人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的构建人肠三叶因子(hITF)的毕赤酵母表达载体。方法从人结肠黏膜提取总RNA,经RT-PCR得到hITF cDNA,用PCR方法扩增hITF基因,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的重组表达质粒pPIC9/hITF。结果通过酶切和基因序列分析确定插入pPIC9中的片段为hITF基因片段。结论重组质粒pPIC9/hITF的成功构建,为在真核细胞中高效表达hITF。并制备其抗体的进一步研究提供基础。     

幽门螺杆菌多表位肽在毕赤酵母中的分泌表达

构建分泌表达幽门螺杆菌多表位肽CTB-UE的毕赤酵母。以原核表达载体pET-22b-CTB-UE为模板,通过PCR扩增得到融合His-tag的ctb-ue基因序列,将其插入酵母表达载体pPIC9K,得到重组表达载体pPIC9K-CTB-UE。重组表达载体pPIC9K-CTB-UE经内切酶Sal I线性化后,电击转化进毕赤酵母GS115,通过组氨酸缺陷性MD平板筛选重组菌株,G418抗性筛选多拷贝转化子,阳性转化子经PCR鉴定,摇瓶发酵表达,取上清经过超滤浓缩,Ni-NTP亲和层析纯化,透析脱盐,SDS-PAGE检测,Western blot验证。结果获得了整合有ctb-ue基因的毕赤酵母,诱导后分泌表达的CTB-UE蛋白能够与His-tag抗体发生特异性反应。成功构建了分泌型毕赤酵母GS115(pPIC9K-CTB-UE),能分泌表达幽门螺杆菌多表位肽CTB-UE。     

慢性髓性白血病bcr/abl融合基因的克隆与表达

目的：克隆bcr／abl融合基因融合位点基因片段。方法：以慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞株总RNA作为模板,采用RT—PCR方法扩增包含Bcr／abl（b3a2）融合位点基因片段。将RT—PCR物按正确的阅读框架,定向克隆到pEGFP—N3的下游,将重组质粒转化大肠杆JM109大肠杆菌,用PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定,并进行序列的测定。结果：扩增出470bp的Bcr／abl融合位点基因片段,构建重组质粒pEGFP—bcr／abl,酶切产物的大小分别与预期相符。结论：成功地扩增bcr／abl融合位点基因片段及构建真核表达重组质粒pEGFP—bcr／abl,为在体外表达重组bcr／abl蛋白奠定基础。     

T4溶菌酶在毕赤酵母中的诱导表达及抑菌活性测定

目的利用毕赤酵母诱导表达T4溶菌酶蛋白并测定其抗菌活性。方法T4溶菌酶（T4lysozyme）基因以N端融合的方式被准确插入到质粒pPIC9K的EcoR I-Not I位点内,得到分泌型重组表达载体 pPIC9K-T4L。该载体首先经限制性内切酶Sal I酶切,进而采用电击方法将线性化的重组质粒DNA导入到毕赤酵母中。经过梯度筛选得到多个单拷贝和多拷贝转化重组子。随机挑取部分重组子PCR扩增阳性克隆,经菌体培养和甲醇诱导后获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清液中。结果表达蛋白经琼脂孔扩散抗菌实验显示抑菌圈明显;重组蛋白对金黄色葡萄球菌与肺炎链球菌均具有显著抑制作用;多拷贝与单拷贝重组表达子没有抗菌活性差异与蛋白表达量的差异;加热煮沸对于T4溶菌酶蛋白的抗菌活性无明显影响。结论T4溶菌酶在毕赤酵母中得以成功诱导与表达;表达产物不受拷贝数影响并具热稳定性。     

抗磷脂抗体靶抗原-β2糖蛋白Ⅰ的原核表达和鉴定

目的 构建β2糖蛋白Ⅰ(β2—GNI)的原核表达载体并诱导其表达。方法利用PCR技术从β2—GPI昆虫表达载体中扩增出编码β2—GNI目的DNA片段，将其插入GST融合表达载体pGEX—2T多克隆位点，以IPTG诱导GST融合β2—GNI的表达。结果 凝胶电泳显示昆虫表达载体的PCR扩增产物的分子量大小与目的片段大小相符。对重组质粒(pGEX—2T—β2—GNI)分析表明，插入片段的序列与发表的β2—GNI基因编码序列一致。在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达出一个分子量约为64kDa产物，与预期相符。结论 β2—GNI编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX—2T。     

N-糖基化IL-24的表达及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的构建IL-24基因的真核表达载体,在毕赤酵母GS115中高效表达,研究重组N-糖基化IL-24蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。方法借助过渡质粒α/pUC18,将IL-24基因插入到质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,构建重组质粒IL-24/pPIC9K,转化毕赤酵母GS115分泌表达,Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,ELISA检测蛋白表达量,糖苷酶PNGaseF分析IL-24糖基化形式和程度。MTT法和形态学分析重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性。结果成功构建重组表达质粒IL-24/pPIC9K,IL-24在毕赤酵母最高表达量为(81.31±14.46)mg·L-1。约70%的IL-24发生了N-糖基化。重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。N-糖基化IL-24对MCF-7抑制率约高于去糖基化IL-24。结论毕赤酵母分泌形式的表达和适度的糖基化修饰都有利于目的蛋白IL-24的生物学活性,为后续的研究提供基础。     

Osx cDNA反义表达载体的构建

目的：构建反义Osterix(Osx)cDNA表达载体。方法：快速提取人全血基因组DNA。以DNA为模板，经过两步PCR扩增获得Osx编码序列，与pGEM-T Easy连接获得重组克隆载体。将Osx编码序列反向克隆人真核表达载体pcDNA3，进行序列测定。结果：经序列分析证实，Osx扩增序列完全正确，且反向插入到pcDNA3载体。结论：成功构建了Osx反义表达载体，为研究Osx对成骨细胞分化的影响奠定了基础。     

人巨细胞病毒pp65基因片段毕赤酵母表达载体的构建

目的 构建人巨细胞病毒pp65基因片段毕赤酵母表达载体.  方法   PCR扩增pp651087-1515 nt,克隆于pMD19-T载体,转化大肠杆菌DH5α.提取质粒测序鉴定后,与pPIC9K载体连接,转化DH5α,筛选阳性克隆,酶切及测序鉴定.   结果  获得了重组酵母表达载体pPIC9K-pp65,测序结果证实为pp65 1087-1515 nt基因,与基因库报道序列一致.  结论 构建得到人巨细胞病毒pp651087-1515 nt毕赤酵母表达载体.     

人骨保护素成熟肽表达载体的构建、表达及重组蛋白免疫学鉴定

目的：构建人骨保护素(OPG)成熟肽cDNA重组表达载体，实现其在毕赤酵母中的高效表达。方法：由人成骨细胞提取总RNA，经RT—PCR扩增得到人0PG成熟肽cDNA，克隆入分泌型表达载体pPIC9K，转化酵母细胞，G418筛选多拷贝整合的重组子进行甲醇诱导表达，产物行Western blottmg鉴定。结果：成功构建了人OPG成熟肽表达载体，该载体能在酵母细胞中获得分泌表达，诱导96h的表达量占上清总蛋白的30％。重组蛋白相对分子质量约55ku，可被0PG抗体识别。结论：重组人OPG成熟肽在酵母表达系统获得较高水平表达，为进一步研究开发基因工程药物准备了条件。     

反向重复序列法构建神经病靶标酯酶RNA干涉表达质粒

目的构建基于通用真核表达载体的人神经病靶标酯酶双链RNA的稳定表达载体。方法在正义和反义引物两端分别加上EcoRⅠ和BamHⅠ的识别位点扩增得到神经病靶标酯酶活力域序列,构建含有目标基因的倒置重复序列的双链RNA表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,酶切分析鉴定重组载体。脂质体法转染到Hela细胞中瞬时表达重组载体,酶活力测定其对细胞内神经病靶标酯酶活力的影响。结果成功构建了NTE双链RNA稳定表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,表达该载体细胞内NTE活力明显下降至对照细胞的20%左右。结论采用反向重复序列法将靶标基因的编码序列正反向插入到通用真核细胞表达载体中,是构建哺乳细胞基因双链RNA稳定表达载体的有效方法。     

子宫中隔切除术后预防粘连方法探讨

目的 探讨子宫中隔并不孕患者宫腔镜术后不同处理方法预防宫腔粘连的效果.方法 55例子宫中隔并不孕患者行腹腔镜监护下宫腔镜子宫中隔切除术(TCRS),术后针对不同患者采用不同术后处理措施,包括宫腔放置与不放IUD,是否进行人工周期治疗,部分患者术后使用GnRH-a类药物治疗术后第1、3个月行宫腔镜检查随访,宫内放置IUD的患者;于术后第3个月取环.结果 54例患者术后进行宫腔镜检查随访,其中40例分别于术后第1、3个月完成了术后2次宫腔镜检查,另14例只完成一次检查.宫腔术后放环与否对术后宫腔形态影响无差异(P>0.05),术后使用人工周期治疗患者较未使用者子宫内膜厚,此两者术后第3个月宫腔镜检查发现宫底创面均已有内膜覆盖.使用GnRH-a类药物患者术后官腔形态满意.结论 TCRS术后宫腔放置IUD无助于预防术后粘连的发生;术后人工周期治疗应更个体化并有针对性的使用GnRH-a类药物治疗.术后及时进行宫腔镜检查随访可防止术后宫底新粘连的形成.     

欧洲药典适用性认证介绍

目的介绍欧洲药典适用性认证程序,为国内药品监管机构和原料药生产企业提供信息,促进我国原料药生产企业的国际化。方法通过查阅调研欧盟相关药品法规和与EDQM同行面对面的交流,详细了解欧洲药典适用性认证的组织机构和具体程序。结果与结论欧洲药典适用性认证程序在对原料药的质量控制有重要作用,加强了药典的监管力度,进一步保证了原料药的质量、安全性和有效性。     

住院患者精神用药情况调查分析

目的：了解目前住院精神患者的药物使用情况。方法：采用一日法调查西安市精神卫生中心403例住院精神患者诊断和治疗情况，并与上海市精神卫生中心2004年调查结果相比较。结果：①传统精神药物使用显著减少，新型精神药物使用占据首位；②抗精神病药物使用趋向小剂量化；③本组联用丙戊酸盐类药物显著增多；④我院精神药物使用情况与上海精神卫生中心比较有显著差异。结论：近年来精神药物使用情况已发生了显著变化，与新型精神药物疗效好，副作用少，患者依从性高有关。     

不同方法治疗慢性宫颈炎的疗效分析

目的慢性宫颈炎是妇科最常见的疾病之一,可引起盆腔脏器炎症,并且与宫颈癌的发生关系密切。本文诣在探讨不同方法在慢性宫颈炎中的疗效。方法回顾性分析新乡市中心医院收治的210例宫颈炎患者,采用药物保妇康栓、聚焦超声治疗及宫腔镜下宫颈电切术的临床效果进行统计分析。结果宫颈电切术治疗有效率为97.9%,明显高于另外两组,差异有统计学意义。结论宫腔镜下宫颈电切术治愈慢性宫颈炎,并且切除宫颈移行带,减少宫颈癌发生。     

片剂溶出度影响因素分析

目的:考察片剂溶出度的影响因素,提高片剂溶出度,从而提高产品质量。方法:通过实验,研究各种参数对片剂溶出度的影响,选择出最佳工艺条件,如改进处方、控制颗粒硬度和大小、控制压力等工艺参数,用于指导大型生产,提高片剂溶出度。结论:崩解剂及润滑剂的用量对片剂溶出度影响较大,颗粒的硬度及大小、粘合剂的温度,压片压力对片剂的溶出度亦有影响;片剂直径大小对片剂溶出度影响不大。     

槲皮素代谢产物定性检出条件研究

目的:研究给予大鼠槲皮素后血浆中代谢产物的定性检出条件。方法:给予大鼠槲皮素单体(100mg.kg-1)后腹腔静脉取血,血浆样品经2mol.L-1盐酸(甲醇-水溶液)水解,采用高效液相色谱法对血浆样品中代谢产物进行定性分析。结果:大鼠给药后3h内取血、血浆样品经盐酸水解处理4h,可稳定检测槲皮素和异鼠李素,样品在—20℃条件下贮存稳定。结论:血浆样品采集时间、盐酸水解时间及贮存方式等不同均可影响代谢产物的有效检出。     

甲泼尼龙佐治毛细支气管炎疗效观察

目的探讨甲泼尼龙与布地奈德治疗毛细支气管炎的疗效。方法将182例毛细支气管炎患儿随机分成三组,三组均采用综合治疗,A组62例用甲泼尼龙静脉滴注,B组60例雾化吸入布地奈德,C组60例用静滴氢化可的松,观察三组喘憋、哮鸣音消失和住院时间。结果A组喘憋、哮鸣音消失时间及住院时间均比B,C组缩短（P〈0.05）。结论甲泼尼龙静滴治疗毛细支气管炎有效、安全、方便,明显加快治愈过程,优于布地奈德与氢化可的松。     

新疆维吾尔自治区基层医院平均住院日调查分析

目的 通过对新疆维吾尔自治区14个县乡级医疗机构住院患者平均住院日及影响因素进行分析,为县乡级医疗机构进一步提高医疗管理质量提供依据.方法 将2009-2010年1504例县乡级医院住院患者平均住院天数,按性别、年龄、院别、付费方式、疾病分类进行描述性统计和秩和检验分析.结果 不同性别间及院别间平均住院日差异均有统计学意义(均P＜0.05),男性平均住院日为10.39 d,女性为8.69d,乡级医院为9.27d,县级医院为9.50 d.不同年龄间平均住院日差异有统计学意义(P＜0.05),小于15岁组、15 ～24岁组、25～44岁组、45 ～65岁组、大干65岁组平均住院日分别为8.10 d、7.66d、8.83 d、10.26 d和11.33 d.自费患者平均住院日为8.39 d,新农合组为9.10 d,商业保险组10.17 d,社会基本医疗保险患者则为11.08 d.不同疾病分类间平均住院日差异明显,妊娠类平均住院日最短,为6.73 d,而肿瘤患者则为14.26 d.结论 不同性别、不同年龄段、不同疾病分类及不同付费方式间平均住院日存在差异,县级医疗机构和乡级医疗机构住院患者平均住院日也存在差异.     

原发性十二指肠恶性肿瘤76例临床分析

目的分析原发性十二指肠恶性肿瘤临床表现、病理类型,探讨如何进行辅助检查的选择与减少病例的误诊。方法回顾性分析1997年3月至2008年3月收治的76例确诊为原发性十二指肠恶性肿瘤患者的临床资料。结果临床表现无特异性,可有腹痛、腹胀、黄疸、呕吐以及消化道出血等表现。从起病到入院确诊平均病程6.5个月。肿瘤好发于十二指肠降部,共64例,另外球部6例,水平部6例,升部0例,病理类型以腺癌为主,占90.8%。辅助检查以胃镜加十二指肠镜检出率最高91.2%,造影检查为87.1%,CT83.3%,B超70.4%,CA-19973.6%。结论提高原发性十二指肠恶性肿瘤预后的关键是早期诊断,对上述临床表现不能用常见疾病解释者应提高警惕,结合RECP、Gl、胃镜、CT、B超等多项辅助检查,可望达到早期诊断的目的。     

合理用药监测系统应用体会

目的:提高医院合理用药水平。方法:对“合理用药监测系统”在我院的应用情况进行总结。结果:我院不合理用药主要表现在注射剂的配伍禁忌、药物相互作用、重复用药、药物剂量大于极限量、特殊人群用药警示5个方面。结论:我院通过应用“合理用药监测系统”,减少了药源性疾病的发生,提高了合理用药的整体水平。