运用单细胞三重PCR对杜氏肌营养不良进行植入前遗传学诊断

目的:采用三重PCR技术检测缺失型杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)基因部分外显子和性别鉴定位点amelogenin基因,探讨该技术对DMD家系中致病基因携带者进行植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)的可行性.方法:显微操作取正常男性、正常女性和DMD基因8号、47号外显子缺失型DMD患者单个淋巴细胞及无DMD家族史夫妻行体外授精-胚胎移植(in vitro fertilization pre-embryo transfer,IVF-ET)术后废弃的单个卵裂球细胞,采用三重PCR技术扩增DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因.结果:64枚正常人单个淋巴细胞的DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为93.8%,93.8%和95.3%,假阳性率为2.8%;48枚8号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为3.3%;48枚47号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因8号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为0;40枚单卵裂球细胞DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为82.5%,80.0%和77.5%,假阳性率为0.结论:本研究所建立的单细胞三重PCR技术具有较高的扩增阳性率和特异性,有望在缺失型DMD家系中进行PGD的临床应用.     

杜氏肌营养不良症(DMD)的植入前遗传学诊断

目的 对杜氏肌营养不良症(ducherule muscular dystrophy,DMD)进行植入前遗传学诊断(preim-plantafton genetic diagnosis,PGD),阻断DMD患儿的出生.方法 针对患者的DMD基因的48号外显子缺失位点采用巢式PCR分别对患者和携带者的单个淋巴细胞、行体外授精一胚胎移植治疗的健康志愿捐献者的单个卵裂球细胞进行扩增,建立稳定的经单细胞基因诊断DMD的方法 .再对在该中心进行超排和体外授精一胚胎移植治疗的DMD携带者的胚胎活检后完成PGD,根据诊断结果 选择健康的优质的胚胎移植入子宫.结果 携带者的单个淋巴细胞的PCR扩增成功率为90.5%(95/105),健康志愿捐献者的单个卵裂球细胞PCR扩增成功率为85.7%(54/63),假阳性率为0(0/28).分别对3例DMD携带者施行了植入前遗传学诊断,病例1移植了2枚未受累的优质胚胎,且成功妊娠单胎并已于2005年4月分娩了1个健康的女婴;病例2移植了2枚优良胚胎,不幸的是未能妊娠.病例3诊断为未受累的仅有的2枚胚胎因胚胎质量差而未能移植.结论 该组采用的方案可对DMD基因的48号外显子缺失突变的DMD家庭进行PGD,达到了阻断DMD惠儿出生的目的 .     

X-连锁进行性肌营养不良症(附Becker型肌营养不良一家系基因诊断)

目的 应用分子遗传学方法对患者在基因水平上作出诊断。方法 应用dystrophin cDNA 14kb探针（包括6个亚探针1－2a,2b-3,4-5a,5b-7,8,9-14)与1名18岁的临床表现温和肌营养不良患者及2例对照者[1例正常25岁男性及1例12岁DMD（Duchenne muscular dystrophy)患者]的基因组DNA／HindⅢ片段进行Southern印记分析。结果 患者在亚探针5b-7杂交中,发现其1.5kb,0.5kb杂交带缺失,在与亚探针8杂交中,发现10．0kb杂交带缺失。DMD对照者在与5b-7杂交中,发现0．5kb杂交带缺失。正常对照者在与全部探针杂交中,未发现杂交带缺失。结论 这三个Hd片段分别含有基因的45,46,47号外显子,证明患者缺失了45,46,47号外显子,故诊断该患者为Becker型肌营养不良,从而为该家系的遗传咨询获得了可靠的资料。     

Duchenne型肌营养不良症患者32例基因缺失分析及产前诊断

目的:探讨Duchenne型肌营养不良症(DMD)基因缺失突变的类型,建立基因诊断技术平台.方法:应用寡核苷酸引物扩增DMD基因18个外显子区域,对27例家系32例DMD患者进行基因缺失分析,用4对二核苷酸重复序列多态引物对DMD家系进行扩增片段长度多态性连锁分析.并对10例先证者有DMD基因缺失的家系进行产前诊断.结果:27例DMD家系中19例(70.4%)有至少1个外显子缺失,且缺失热点区域集中在外显子12、13、45、47、48、49和50,所有携带者至少有1个或1个以上多态性位点为杂合态,缺失诊断结合多态分析进行诊断,10例男性胎儿中2例具有外显子缺失.结论:基因缺失诊断结合连锁分析可快速、准确地进行DMD的产前诊断.     

广西基因缺失型肌营养不良的基因诊断

目的：探讨广西Duchenne型肌营养不良（DMD）基因缺失的主要类型。方法：应用PCR技术分别扩增抗肌萎缩蛋白（dystrophin)基因9个缺失热点的外显子区域。结果：38例患者缺失率为47．4％（18／38）,以外显了48,51,45缺失较为常见。结论：广西DMD基因缺失热点分布规律与国内外学者的研究结果相似;PCR技术可在临床上帮助诊断缺失型患者,而且是产前诊断的基础。     

应用10对引物多重PCR方法检测DMD基因缺失

目的 建立适合于Duchenne型进行性肌营养不良(DMD)临床基因诊断的10对引物多重PCR方法,并探讨其临床应用价值.方法 抽提55例DMD患者及正常对照者外周血DNA,选取肌营养不良蛋白基因的10对外显子引物,应用多重PCR反应方法,同时扩增10个特异性片段,扩增产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳.结果 55例DMD患者中,28例(50.9%)存在外显子缺失.27例(49.1%)未检测到缺失;25例缺失片段集中于第45～53外显子,3例缺失片段集中于第12-19外显子.第50外显子缺失频率最高;其次为外显子45、47、51、52,再次之为外显子12、53.结论 DMD基因缺失片段主要分布于第45-53、12-19外显子2个缺失热点区域.该方法具有临床应用价值,是检测DMD基因缺失的首选方法.     

3例无家族史Duchenne肌营养不良患者的基因突变研究

目的探讨3例无Duchenne肌营养不良(DMD)家族史DMD患者的发病原因。方法采用17对引物检测dystro-phin基因外显子的缺失,结合45CA、49CA、50CA、3′CA和5′CA这5个短串联重复序列(STR)多态位点,对3个无DMD家族史而只有1例明确患者的家系进行连锁分析。结果 STR连锁分析显示3例患者的49CA位点dystrophin基因缺失,但其母亲49CA位点均为杂合子。结论 3个家系中的3位母亲均不是致病基因的携带者,DMD是由于患者自身发生基因突变所致。     

产前基因检测杜氏肌营养不良

目的 产前基因检测杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)家系胎儿.方法 利用性别决定基因SRY引物PCR和羊水细胞培养染色体核型分析确定3例DMD家系胎儿性别,采用mPCR技术对3个DMD家系成员外周血及胎儿羊水和脐静脉血进行DMD基因内18个外显子位点扩增,STR-PCR结合聚丙稀酰胺凝胶技术对DMD基因3'端及基因内的44、45、49、50内含子的(CA)n短串联重复序列引物进行扩增,进行家系连锁分析和产前基因诊断.结果 共检出4例胎儿,其中2例单胎和1例双胎之甲胎为男性,之乙胎为女性.3个DMD家系2个检出为非缺失型,1个为缺失型.4例胎儿均继承了与同代先证者相同的母源致病单体型,除1例双胎之女胎为风险基因携带者外,其余3例男胎均为DMD风险胎儿,3例患儿母亲均为杂合型.结论 STR多态连锁分析不仅适用于常见缺失突变检测未发现缺失的DMD患者,同样适用于缺失型DMD患者的产前基因检测.     

连接片段在Duchenne型肌营养不良症携带者检测中的应用

目的探讨连接片段在缺失型Duchenne 型肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）携带者检测中的应用价
值。方法对1个DMD家系和1例DMD散发病例进行研究。DMD家系中以确诊的患者Ⅲ2和待查携带者Ⅱ3为研究对象;散
发病例以患者Ⅱ1及其母亲Ⅰ2为研究对象。通过外显子检测确定家系中患者Ⅲ2第31~43外显子缺失,散发病例患者Ⅱ1第
45~54外显子缺失。然后以PCR步移法在相应内含子设计引物定位断裂点的位点,最后在尽量靠近断裂连接点处设计1对引物
直接对患者及其待查女性亲属进行连接片段的PCR扩增。结果对上述DMD家系中待查女性Ⅱ3的检测结果为PCR扩增出与
患者Ⅲ2一致的阳性片段,诊断其为DMD携带者。对散发病例患者母亲Ⅰ2的检测结果为PCR反应阴性,而对照的患者Ⅱ1扩
增出阳性结果,排除其母亲为DMD携带者。结论利用常规PCR技术直接检测缺失型DMD患者的女性亲属是否带有连接片
段,可以同样达到进行携带者检测的目的。该方法有别于目前DMD携带者检测中所使用的各种定量分析方法。
     

外显子组测序在抗肌萎缩蛋白基因检测到一个新的剪接供体位点突变

目的应用外显子组捕获和第2代测序技术检测抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin)中的微小突变。方法通过外显子组捕获和第2代测序技术对1例具有典型杜氏肌营养不良症(DMD)临床表现但没有外显子缺失或重复的患者进行dtstriogub基因突变检测,并用Sanger测序证实检测结果。以生物信息学预测基因突变所致该基因编码情况的改变。以患者母亲和100名体检正常者作为对照。结果在患者dystrophin基因内含子50的第1个碱基检测到1个碱基改变:G>C,其母亲在相同的位置发生了杂合改变。生物信息学预测此改变将使内含子50原有的5’剪接位点消失,导致其相应肽链C端氨基酸序列改变、终止密码提前出现。Sanger测序进一步证实了该突变的存在,且在正常对照未检测到该突变。这是在dystrophin基因上新发现的致病性剪接供体位点突变。结论外显子组测序技术可有效检测dystrophin基因微小突变,其应用可进一步完善DMD分子诊断体系。     

Single Cell Analysis of Dystrophin and SRY Gene by Using Whole Genome Amplification

Objective To develop a reliable and sensitive method for detection of sex and multiloci of Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene in single cell Materials & methods Whole genome of single cell were amplified by using 15-base random primers (primer extension preamplification, PEP), then a small aliquot of PEP product were analyzed by using locus-specific nest PCR amplification. The procedure was evaluated by detection dystrophin exons 8, 17, 19, 44, 45, 48 and human testis-determining gene (SRY)in single lymphocytes from known sources and single blastomeres from the couples with no family history of DMD.Results The amplification efficiency rate of six dystrophin exons from single lymphocytes and single blastomeres were 97. 2% (175/180) and 100% (60/60) respectively.Results of SRY showed that 100% (15/15) amplification in single male-derived lymphocytes and 0% (0/15) amplification in single female-derived lymphocytes. Conclusion The technique of single cell PEP-nest PCR for dystrophin exons 8, 17,19, 44, 45, 48 and SRY is highly specifc. PEP-nest PCR is suitable for Preimplantation genetic diagnosis (PGD) of DMD at single cell level.     

兄妹同患假肥大型肌营养不良症

目的探讨同患假肥大型肌营养不良症(DMD)兄妹的临床以及实验室检查特点。方法对患者进行临床观察、血清酶、肌电图、心电图及心脏彩色超声检查、肌肉病理HE染色,免疫组织化学染色检测肌肉组织抗肌萎缩蛋白、utrophin的表达,用多重连接探针扩增法对抗肌萎缩蛋白基因1～79号外显子进行缺失和/或重复突变检测,利用抗肌萎缩蛋白基因的CA短串联重复序列(STR)对该家系进行STR-PCR连锁分析。结果兄妹二人符合DMD诊断,具有典型的DMD临床表现,肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶、羟丁酸脱氢酶和谷草转氨酶的水平均显著高于正常值,肌电图呈肌源性损害,肌肉HE染色符合DMD,男患者的抗肌萎缩蛋白表达阴性,女患者的少量肌纤维仍可见不连续膜阳性,两患者抗肌萎缩蛋白基因的1～79号外显子未见缺失和重复突变,女患者与男患者携带相同的母源性X染色体。结论携带DMD致病基因的女性携带者可以具有临床以及实验室的典型表现,应加强对携带者的全面检查。     

DMD／BMD基因诊断的新体系—Amp—FLP单体型连锁分析

应用同位素掺入的多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因内含子44、45、49、50中的CA重复序列,在聚丙烯酰胺凝胶电泳后放射自显影检测扩增产物。中国人在这4个位点均具有长度多态性:各位点等位片段数目分别为9、7、11、4,多态性信息含量(PIC)分别为0.872、0.772、0.870、0.710。应用这4个位点及先前报道的5‘CA及3‘CA进行了非缺失型DMD家系的单体型连锁分析及产前基因诊断,并用此方法检出了1例缺失。由此建立了以PCR为基础的DMD/BMD基因诊断新体系—Amp-FLP(扩增片段长度多态性连锁分析),此方法简便快速、灵敏高效,使缺失型与非缺失型DMD/BMD的基因诊断连贯性一次完成,有效地提高了DMD/BMD基因诊断的效率和成功率。     

应用二核苷酸重复多态DMD产前基因诊断研究

目的：应用二核苷酸重复多态Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型肌营养不良症（ＤＭＤ）基因诊断,探讨ＤＭＤ产前基因诊断方案及其可行性。方法：在应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）初步分析Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因内含子４９和４５的（ＣＡ）ｎ多态分布的基础上,以Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因５′端（ＣＡ）ｎ多态和内含子４５,４９,５０以及３′端（ＣＡ）ｎ多态为遗传标记,单体型连锁分析的同时直接检测缺失相结合的方法。结果：Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因内含子４９和４５的（ＣＡ）ｎ多态共检测到７个和６个等位片段,实际检出的杂合子率为８６．６％和７３％;在东北地区首次成功地完成了８个家系９例ＤＭＤ产前基因诊断。结论：该方法不分缺失型和非缺失型一步完成诊断,是临床产前基因诊断较理想的方案。     

MLPA和多重PCR法检测假肥大性肌营养不良患者DMD基因

目的 应用多重连接依赖式探针扩增 (MLPA)和多重PCR法对临床诊断为假肥大性肌营养不良患者进行基因诊断,并比较两种方法检测DMD基因缺失和重复改变的效果。方法 选择2005年至2007年在中国医科大学盛京医院儿科就诊的51例DMD患者和8例BMD患者。采用MLPA法对经多重PCR法检测过的患者的DMD基因的缺失/重复突变进行突变筛查,同时对先证者的母亲进行基因的缺失/重复突变检测。结果 用多重PCR方法在59例假肥大性肌营养不良症患者中检测到31例患者有外显子缺失。MLPA检测出33例外显子缺失,6例外显子重复和1例点突变,同时检测出26例患儿的母亲为携带者。MLPA比多重PCR多检测出10例DMD基因突变,两种方法共同检测出的30例突变中MLPA 检测出16例基因突变范围比多重PCR大。结论 与多重PCR法相比,MLPA更加简便、快捷、可靠,同时可以对携带者进行诊断,是一种高效的遗传病基因诊断手段。 【关键词】假肥大性肌营养不良症;多重连接依赖式探针扩增;多重PCR;缺失/重复突变     

非缺失型女性Duchenne型肌营养不良症患者短串联重复序列多态性分析

目的检测1例女性Duchenne型肌营养不良症(DMD)患者Dystrophin基因的突变情况及其短串联重复序列多态性,以探讨其发病机制。方法用多重PCR方法检测1例女性DMD患者的Dystrophin 基因,并用PCR结合基因扫描的方法连锁分析该患者及其家系的5个微卫星DNA位点(STR-44、45、49、40、5' DysⅡ)多态性。结果该患者和其儿子均为非缺失型DMD。短串联重复序列多态单倍型连锁分析发现女性DMD患者STR单倍型有两种情况:(1)和其患病的儿子Ⅳ-1具有一样的单倍型,该单倍型来自其未患病的母亲Ⅱ-1;(2)因该女性DMD患者儿子的第45内含子缺失,该患者的母亲有可能是嵌合体,该女性DMD患者只遗传了父亲的等位基因,则她的单倍型与其母亲及患病的儿子都不同。结论该女性患者由Dystrophin基因突变引起的可能性较小,她和患病的儿子的单倍型可能相同或不相同,说明其发病与短串联重复序列多态性关系不密切。     

Amp-FLP连锁分析对DMD基因诊断的价值

①目的　探讨扩增片段长度多态性（Ａｍ ｐ－ＦＬＰ）连锁分析对杜氏进行性肌营养不良（ＤＭＤ）基因诊断中的价值。②方法　运用多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）、聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法,对１０ 个ＤＭＤ家系成员的抗肌营养不良蛋白基因内９个基因区进行了Ａｍ ｐ－ＦＬＰ连锁分析。③结果　１０ 个ＤＭＤ家系中的９ 个先证者,６ 例为外显子缺失,１ 例为内含子缺失,２ 例为非缺失型。④结论　Ａｍ ｐ－ＦＬＰ连锁分析是对ＤＭＤ进行基因诊断的实用方法。     

非缺失型女性Duchenne型肌营养不良症患者短串联重复序列多态性分析

目的 检测1例女性Duchenne型肌营养不良症(DMD)患者Dystrophin基因的突变情况及其短串联重复序列多态性。以探讨其发病机制。方法用多重PCR方法检测l例女性DMD患者的Dystrophin基因，并用PCR结合基因扫描的方法连锁分析该患者及其家系的5个微卫星DNA位点(STR-44、45、49、40、5’DysⅡ)多态性。结果 该患者和其儿子均为非缺失型DMD。短串联重复序列多态单倍型连锁分析发现女性DMD患者STR单倍型有两种情况：(1)和其患病的儿子Ⅳ-1具有一样的单倍型，该单倍型来自其未患病的母亲Ⅱ-1；(2)因该女性DMD患者儿子的第45内含子缺失。该患者的母亲有可能是嵌合体，该女性DMD患者只遗传了父亲的等位基因，则她的单倍型与其母亲及患病的儿子都不同。结论该女性患者由Dystrophin基因突变引起的可能性较小，她和患病的儿子的单倍型可能相同或不相同，说明其发病与短串联重复序列多态性关系不密切。     

应用分子标记对Duchenne型肌营养不良胎儿的产前基因诊断

目的:对未知遗传类型的Duchenne肌营养不良(DMD)家系早期妊娠风险胎儿进行产前基因诊断,确定能否接续妊娠,并探讨检测技术。方法:通过TRIzol方法从孕妇羊水中提取胎儿DNA,用Promega提血试剂盒提取家系其他成员外周血中的DNA。选取Xp21.1区附近的6对荧光引物对12个样本DNA进行PCR扩增和多态性连锁分析,以确定风险X染色体;通过DMD50和SRY2对引物的多重PCR扩增确定胎儿性别。连锁分析与性别鉴定相结合对胎儿进行产前诊断。结果:发现该胎儿为1正常女胎,未携带风险X染色体,且胎儿产后复查结果与产前检测一致。结论:这种方法提示对缺失或/和非缺失型DMD风险胎儿的检测可一步完成,而且扩大了基因的检测范围,诊断结果更为准确可靠。