肠道病毒71型RT-LAMP快速检测方法的建立及初步应用

目的建立手足口病肠道病毒71型(EV71型)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测方法,并对其进行应用评价。方法利用软件针对EV71型病毒特异性基因6个区域设计4条LAMP引物,在普通恒温水箱内65℃保温约1 200min完成RT-LAMP扩增,扩增结果通过电泳和肉眼来判断。利用RT-LAMP和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法同时检测70份EV71型肠道阳性标本;将EV71型的RNA做一系列10倍稀释后用RT-LAMP和RT-PCR方法进行检测来比较两者敏感度。结果 EV71型出现LAMP特征性梯状条带,肉眼可以判断结果;RT-LAMP与RT-PCR方法检测100份EV71型标本的检出率比较差异无统计学意义(P0.05);RT-LAMP方法的敏感度(10.0pg/μL)与RT-PCR方法相同。结论建立了一个可以在普通恒温水箱内进行核酸扩增的EV71型RT-LAMP检测方法,初步应用证实该方法有一定的应用前景。     

环介导等温扩增技术快速检测副溶血性弧菌

目的建立一种检测副溶血性弧菌（Vp）快速且特异的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。方法针对副溶血性弧菌不耐热溶血素（tlh）基因特异性序列的6个位点设计4条LAMP引物,65℃保温约60min,完成对副溶血性弧菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green Ⅰ染色、电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测1株副溶血性弧菌和12株非副溶血性弧菌来验证LAMP方法的特异性;将副溶血性弧菌菌液作一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测,比较两者敏感性。结果1株副溶血性弧菌出现LAMP扩增反应：通过肉眼、SYBR Green Ⅰ染色和电泳均能观察到LAMP扩增产物的出现,酶切证实了LAMP产物的特异性;12株非副溶血性弧菌未出现LAMP扩增。LAMP检测tlh基因的特异性和敏感性与普通PCR相同,LAMP检测tlh基因的检测下限为15cfu／mL。结论建立了一种快速、敏感、特异的副溶血性弧菌检测方法,适合日常监测及快速检测的需要。     

荧光恒温扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立与评价

目的利用荧光恒温扩增(SAT)技术建立一种快速可靠的肠道病毒71型(EV71)检测方法。方法通过设计特异性的EV71 RNA扩增引物及优化探针技术,使用M-MLV反转录酶及T7 RNA多聚酶对EV71 RNA进行核酸扩增,同时利用荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪进行实时的荧光信号收集和检测。检测复旦大学附属儿科医院儿童手足口病患儿粪便样本199例,以EV71型核酸检测试剂盒作参比方法,DNA测序为第三方验证方法,对研究数据进行Kappa一致性分析。结果 SAT技术共检测到119例EV71阳性样本,其中21例荧光探针法检测为阴性,经测序证实20例样本仍为阳性。SAT与荧光探针法检测结果的Kappa值为0.789。SAT方法的敏感性100%、特异性98.77%。结论本研究建立的EV71型RNA SAT技术具有敏感性高、特异性强、准确、快速可靠等优点,适用于临床对EV71感染的快速诊断。     

2013-2014年漳州市手足口病的病原学特征及分子流行病学研究

目的 了解2013-2014年漳州市手足口病的病原构成及分子流行病学特征,为漳州市手足口病的防治工作提供科学依据。方法 采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）方法,检测2013-2014年漳州市哨点医院送检的1421份临床诊断手足口病疑似病例的标本,进行肠道病毒通用型、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）的核酸检测;通过RT-PCR方法,扩增VP1区基因部分片段并测序,对非EV71及非Cox A16的肠道病毒进行分型鉴定;扩增完整VP1区基因片段并测序,构建系统进化树对EV71、Cox A16、Cox A6和Cox A10进行基因进化分析。结果 1063份标本肠道病毒通用型阳性,阳性率为74.81%,其中222份标本EV71阳性,340份Cox A16阳性,8份EV71+Cox A16阳性,493份非EV71及非Cox A16的肠道病毒阳性。随机抽取40份非EV71及非Cox A16的肠道病毒阳性标本经RT-PCR和测序进一步分型,共鉴定出38份非EV71及非Cox A16的肠道病毒,其中Cox A6型25份（65.79%,25/38）,Cox A10型8份（21.05%,8/38）,Cox A5型1份（2.63%,1/38）,Cox A4型3份（7.89%,3/38）和Cox A9型1份（2.63%,1/38）。VP1区完整基因的进化分析显示,漳州市的EV71均属C4基因亚型的C4a进化分支,Cox A16分属B1基因亚型的B1a和B1b两个分支;Cox A6和Cox A10均与原型株及国外地区分离株的亲缘关系远,与国内地区分离株的亲缘关系近。结论 2013-2014年漳州市非EV71及非Cox A16的肠道病毒在手足口病病原谱中占有重要位置;非EV71及非Cox A16的肠道病毒型别多样,Cox A6和Cox A10为其中的优势型别。漳州市的EV71、Cox A16、Cox A6和Cox A10标本在进化树上与国内地区相应分离株共进化共循环。     

检测EV71和EV-U的TaqMan-LNA探针多重荧光RT-PCR的建立

目的 建立一种针对手足口病病原体的快速准确检测方法。 方法 利用TaqMan-LNA探针建立多重荧光定量RT-PCR方法,同时检测肠道病毒71型(EV71)和肠道病毒通用型(EV-U),用含有目的序列RNA的标准品制备标准曲线,对病毒进行准确定量,同时对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评估。结果 用TaqMan-LNA探针多重荧光RT-PCR法检测CoxA16、CoxB2、EV71病毒和其他人类病毒RNA,证实其特异性为100%;对EV71和EV-U的检测灵敏度均达到10^{2拷贝/μl;将EV71和EV-U的RNA标准品进行重复性实验,其批内、批间变异系数分别为0.97%～2.02%和0.89%～2.13%。 结论 本方法灵敏度较高,特异性强,重复性好,适用于手足口病的临床检测。}     

粤东地区2011年手足口病病原学检测及临床分析

目的 了解粤东地区2011年婴幼儿手足口病的病原体分型情况及其与临床的关系.方法 采集2011年1月至12月汕头大学医学院第二附属医院儿科手足口病住院患儿的咽拭子标本,RT-PCR检测肠道病毒71型（EV71）,柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）,肠道病毒属,并对扩增产物测序鉴定.结果 301例患儿中有214例咽拭子中检测到肠道病毒,病毒阳性率为71.1%,其中EV71 60例,占28.0%,CoxA16 108例,占50.5%,除EV71、CoxA16外的其他型别肠道病毒为46例,占21.5%;91例患儿有明显神经系统损害,其中33例EV71检测阳性（33/60,55.0%）,35例CoxA16检测阳性（35/108,32.4%）,8例除EV71、CoxA16外其他型别肠道病毒检测阳性（8/46,17.4%）,15例肠道病毒检测阴性.除1例由EV71引起的的危重型手足口病死亡外其余300例均痊愈出院.结论 粤东地区2011年手足口病病原体主要为CoxA16、EV71,但CoxA16已经成为当年优势病原体,其他型肠道病毒也占有一定比率.而EV71最容易引起神经系统损害和导致重症及危重症,EV71、CoxA16及其他型肠道病毒均可引起神经系统损害.     

实时荧光PCR技术在手足口病检测中应用

目的:探讨实时荧光PCR技术检测手足口病肠道病毒的价值.方法:建立手足口病的实时荧光PCR检测技术平台,检测茂名地区手足口病患者243份标本中人肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型特异性核酸,再将标本送广东省疾病预防控制中心进行复检.结果:243份标本中肠道病毒通用型核酸阳性27份,柯萨奇A16核酸阳性16份,肠遘71型病毒核酸阳性17份,与广东省疾病预防控制中心复检结果一致,符合率100%.结论:实时荧光PCR检测技术平台具有特异性强、灵敏度高等优点,是一种手足口病肠道病毒的快速检测方法.     

人细小病毒B19的环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的建立一种简单、快速的核酸检测新方法,即环介导等温扩增方法(LAMP)来检测人细小病毒B19的核酸。方法从GenBank中获得B19病毒VP2基因序列,利用PrimerExplorer V3软件在序列保守区域设计LAMP引物,同时对试验中的几个重要参教进行优化,并评价其敏感性和特异性。结果LAMP检测方法的敏感性高于PCR方法,并且对B19病毒的检测具有特异性。结论建立了环介导等温扩增快速检测方法,此方法灵敏性高、特异性强,不仅适用于实验室检测,更能够广泛用于临床检测。     

手足口病病原微生物EV71病毒株的分离与鉴定

目的：探讨手足口病病原体EV71病毒的分离方法。方法：取手足口病患儿的粪便,经磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后用0.22μm滤膜过滤,将悬液接种于Vero细胞。通过EV71病毒致细胞病变效应（CPE）分析、电镜分析、EV71病毒特异性核酸及蛋白的聚合酶链反应（PCR）及Western Blotting分析来鉴定病毒分离和致病效果。检测病毒悬液对于宿主细胞Vero增殖抑制的效果。结果：标本悬液接种Vero细胞48h后出现CPE。收集感染细胞的培养基上清液,连续感染2次,均出现同样的CPE。电镜检测发现在感染组Vero细胞的细胞质和细胞核周围均有大量聚集的病毒颗粒。EV71特异性核酸RT-PCR检测证实,感染组Vero细胞中可以扩增出EV71病毒特异性的核酸条带。Western Blotting检测发现,在感染组细胞中有高表达EV71特异性抗原蛋白,而未感染组细胞不表达该病毒抗原。MTT检测结果显示,EV71病毒显著抑制宿主细胞Vero的体外增殖和生长,并且呈时间依赖性。结论：成功分离出人手足口病致微生物EV71病毒株（该EV71病毒株编号为EV71-Tj-100623）。     

手足口病患者柯萨奇病毒核酸检测结果分析

目的探讨手足口病患者柯萨奇病毒核酸检测的临床应用价值。方法利用实时荧光聚合酶链反应技术,以EV71/CA16基因组编码区的高度保守区为靶区域,设定特异性引物及荧光探针,通过一步法RT-PCR扩增对EV71RNA/CA16RNA进行检测。结果在428份患者标本中,EV71-RNA阳性136份,CA16-RNA阳性6份,其中有1例患者既是EV71-RNA咽拭子和肛拭子均阳性又是CA16-RNA咽拭子阳性。而有40例(80份标本)患者EV71-RNA咽拭子和肛拭子均阳性,46份EV71-RNA单独肛拭子阳性,10份EV71-RNA单独咽拭子阳性。在6份CA16-RNA阳性患者标本中,4份为肛拭子阳性,2份为咽拭子阳性。结论手足口病患者柯萨奇核酸检测对重症患者判断预后有重要的指导意义,对指导临床合理制订治疗方案有重要的参考价值,值得推广应用。     

基于单一基因的反转录-环介导等温核酸扩增技术快速检测甲型副伤寒沙门菌

目的建立反转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)方法特异检测甲型副伤寒沙门菌。方法针对甲型副伤寒沙门菌特异保守hsdM基因设计引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的RT-LAMP体系。利用多种血清型沙门菌及非沙门菌菌株DNA评价该方法的特异性及敏感性。同时对甲型副伤寒沙门菌全血模拟标本及粪便模拟标本进行敏感性检测,并利用临床样本进行初步验证。结果等温65℃条件下,30~60 min内完成RTLAMP反应,利用该方法检测130株甲型副伤寒沙门菌均为阳性,其他非甲型副伤寒沙门菌均扩增阴性。对纯菌RNA检测中检测下限为50 pg/反应,约为19 000个拷贝/反应。在以全血模拟样本的检测中,敏感性达80 cfu/ml,略高于PCR检测低限。对粪便模拟标本的检测中,对原始样品检测下限为500 cfu/g;增菌后样品检测下限为0.8 cfu/g,比PCR检测低限高2~10倍。临床样本中甲型副伤寒患者血液标本检测均阳性,而伤寒样本检测均阴性。结论建立了敏感性高、特异性好的检测甲型副伤寒沙门菌的RT-LAMP方法,为甲型副伤寒沙门菌感染的快速诊断提供了简易手段,可试用于甲型副伤寒的早期诊断。     

两种不同方法检测肠道71型病毒的比较

目的研究不同方法检测肠道71型病毒的灵敏度和特异性。方法采集135例临床确诊为手足口病患儿和44例临床确诊为非手足口病患儿血清,分别用免疫层析法（ICA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗肠道71型病毒IgM抗体。结果ICA法检出阳性病例29例,ELISA法检出阳性病例27例;ICA法和ELISA法的灵敏度分别为21．48％和20．0％,特异性为100％。结论ICA法和ELISA法均具有较高特异性,但其灵敏度较低。     

RT—LAMP法快速检测人季节性流感病毒

目的 建立并应用RT-LAMP法检测人季节性流感病毒.方法 选择并合成针对甲1型、甲3型、乙型流感病毒基因的保守区引物,并对南京地区2007年11月～2009年2月400份临床流感样患者的咽拭子标本进行检测.这些样本同时用MDCK细胞进行流感病毒的分离,用特异性单抗血凝抑制试验进行亚型鉴定.结果 用该法从57份临床流感样患者的咽拭子标本中检测出流感病毒,其中49份为甲1型,6份为甲3型,2份为乙型.用MDCK细胞分离鉴定出55份阳性,其中47份为甲1型,6份为甲3型,2份为乙型.两种方法的检测结果无统计学差异（P〉0.05）.RT-LAMP法为等温扩增,可用水浴锅代替PCR仪,检测结果在可见光下或紫外灯下直接肉眼观察.结论 RT-LAMP法对人季节性流感病毒的检测有高度的特异性,对禽流感病毒H5、H9无交叉反应,可用于季节性流感病毒的亚型鉴定.     

咸阳市2012年手足口病病原学监测结果分析

目的：分析咸阳市手足口病病原体构成特征的变迁,为手足口病防控提供科学依据。方法对2012年咸阳市手足口病病例资料及咽拭子标本检测结果进行分析。结果共送检手足口病病例咽拭子标本549份,检出肠道病毒（EV ）阳性标本126份,阳性检出率为22．95％,其中 EV71阳性77份（占61．11％）、柯萨奇病毒 A组（CoxA）16型（CoxA16）阳性10份（占7．94％）、CoxA10阳性9份（占7．14％）、其他未分型 EV 阳性30份（占23．81％）,未检出CoxA6阳性标本。不同病情病例EV71阳性检出率比较差异有统计学意义（P＜0．05）。发病高峰期及非高峰期送检标本阳性检出率比较差异有统计学意义（P＜0．05）。不同试剂阳性检出率比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论咸阳市2012年手足口病病原体以EV71型为主,首次检出CoxA10。重症病例EV71阳性检出率高于普通病例。在手足口病发病高峰期采样,可以提高EV阳性检出率。     

荧光聚合酶链式反应与酶联免疫吸附法筛查肠道病毒71型病原感染的比较研究

目的比较肠道病毒71型（EV71）核酸与EV71-IgM抗体检测两种方法对临床诊断手足口患儿的意义。方法采用荧光定量聚合酶链式反应法对2011年4月20日-9月10日诊治的1 379例临床诊断为疑似手足口患儿进行肛拭子EV71核酸检测,同时用酶联免疫吸附法对血清标本进EV71-IgM抗体水平检测。结果 1 379例患儿EV71核酸的阳性为79例,阳性率为5.73%,EV71-IgM抗体阳性为82例,阳性率为5.95%,两者均阳性为32例。两检测方法一致率为95.2%,两者之间的阳性检出率差异无统计学意义（χ2=0.093,P=0.761）。结论应用EV71核酸及EV71-IgM抗体检测的两种联合监测,能更有效地提高手足口病患儿感染的诊断水平,对预防及对诊断手足口病有积极意义。     

2012～2013年杭州市萧山区手足口病病原谱及临床特征分析

目的：了解杭州市萧山区手足口病（H FM D ）病原谱及临床特征。方法采用荧光定量反转录聚合酶链反应,对2012年5月至2013年7月就诊的208例H FM D疑似患儿咽拭子标本（45份）和粪便标本（208份）进行病原体检测,结合患儿临床资料分析检测结果。结果208例患儿中,肠道病毒（EV ）检出率为83．17％,其中EV71、柯萨奇病毒A16（CoxA16）和其他EV亚型所占比例分别为55．49％、13．29％和31．21％;男、女性患儿EV检出率比较差异无统计学意义（P＞0．05）。5岁及其以下患儿以EV71感染为主,5岁以上患儿以其他EV亚型感染为主。HFMD患儿临床症状主要为发热伴疱疹,各种类型临床症状患儿均以EV71感染为主。粪便标本EV检出率高于咽拭子标本（P＜0．05）。结论 EV71和其他EV亚型是该地区 HFMD患儿常见病原体,CoxA16感染流行趋势有所下降。加强EV、EV71和CoxA16检测有助于 HFMD的预防和控制。