miR-145真核表达载体的构建及表达

目的构建miR-145的真核表达载体,为研究miR-145在结肠癌中的生物学功能奠定基础。方法设计并应用PCR扩增miR-145基因片段,将其导入真核表达载体pCMV-myc中构建重组质粒pCMV-miR-145后,将重组质粒转染入结肠癌细胞系HCT116中,运用RT-PCR检测miR-145的表达情况。结果酶切及DNA测序证实miR-145被正确克隆入真核表达载体pCMV-myc中,该重组质粒能在HCT-116细胞中高效表达miR-145。结论成功构建了miR-145的真核表达载体pCMV-miR-145,该载体能有效高表达miR-145。     

人卵泡抑素基因真核表达载体构建和体外表达

目的:体外构建携带人卵泡抑素基因(FS)cDNA的真核表达载体,并观察其在幼年叙利亚地鼠肾细胞(BHK21)中的表达。方法:从新鲜人卵泡抽提液细胞中提取RNA,应用RT-PCR方法扩增人FScDNA序列,克隆到pMD-18T载体中,构成pMD-FS重组克隆质粒。经测序鉴定后,双酶切得到人FS基因cDNA序列,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构成pEGFP-FS重组表达质粒。pEGFP-FS重组表达质粒经酶切和PCR鉴定,通过脂质体2000介导瞬时转染BHK21细胞,并检测绿色荧光蛋白(GFP)的荧光表达。结果:成功构建pMD-FS重组克隆质粒,FScDNA序列测序结果与GenBank中公布的序列(Genbank NM_013409.1)同源性为100%;成功构建pEGFP-FS重组表达质粒,将其转染BHK21细胞后,观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了人FS的pMD-FS重组克隆质粒和pEGFP-FS重组表达质粒,为进一步研究FS对哺乳动物卵泡发育的影响奠定了基础。     

HPV18-L1基因真核表达载体的构建及其表达

目的:从人乳头瘤病毒(HPV)阳性的宫颈癌组织中克隆HPV18型主要衣壳蛋白L1基因全长,构建真核表达载体及验证目的蛋白的表达。方法:根据HPV18-L1基因全长设计一对特异引物,用PCR方法从宫颈癌组织DNA中获得L1基因,构建pMD18T重组质粒扩增L1基因,以pVAX1为真核表达载体构建重组表达质粒,转染入地鼠肾细胞BHK,采用免疫细胞化学方法检测HPV18-L1蛋白的表达。结果:从长春地区宫颈癌临床标本克隆到的HPV18-L1基因序列与Genebank报道序列高度同源,其真核表达产物能够与特异性抗体发生特异性结合。结论:成功构建pVAX1-HPV18-L1重组真核表达质粒,为研制地区特异性HPV预防性疫苗提供基础实验参考。     

白细胞介素10基因克隆及其真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人白细胞介素10(hIL-10)基因,以构建真核表达载体,并检测其在COS-7细胞中的表达情况。方法从人全血标本中提取细胞总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增hIL-10基因,分别构建含hIL-10目的基因的克隆载体与表达载体,提取质粒,经酶切、PCR和DNA测序鉴定;重组表达载体pVAX1-hIL10转染COS-7细胞,观测hIL-10的瞬时表达情况。结果构建了重组克隆载体pMD18T-hIL10和真核表达载体pVAX1-hIL10,经酶切、PCR及测序鉴定正确,插入片段序列与GenBank已公布的hIL-10基因序列一致;pVAX1-hIL10可以有效地转染COS-7细胞,Western blot结果表明hIL-10在COS-7细胞中瞬时表达。结论成功克隆了hIL-10基因,构建的表达载体pVAX1-hIL10在COS-7细胞中瞬时表达hIL-10蛋白,为进一步研究其生物学功能和临床应用奠定了基础。     

人防御素-5基因原核表达载体pRSET-A的构建

目的利用分子生物学技术和方法将pRSET—A质粒改建为带有人α-防御素5（HD-5α）基因的新型表达载体pRSET—HD-5α。为大量生产和提纯具有生物活性人防御素5抗菌肽的研究提供实验基础。方法PCR技术，以设计的引物P1／P2从cDNA文库中扩增人α-防御素5基因片段，并将扩增出来的目的基因和pRSET—A质粒用BamHI和EcoRI双酶切后连接构成重组质粒，然后转化大肠杆菌DH-5α，筛选阳性克隆。最后对PCR及酶切鉴定含有目的基因的克隆进行测序和电泳。结果获得α-防御素-5基因片断大小正确，经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列；电泳结果证明已将此片段克隆到pRSET—A内。结论成功构建了HD-5α基因的新型表达载体pR—SET—A／HD-5α。     

副溶血弧菌tlh基因克隆载体和表达载体的构建

目的：构建含副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus,VP)tlh基因克隆载体和表达载体，检测并鉴定表达载体在转化菌的表达，为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究不耐热性溶血毒素（TLH）的功能奠定基础。方法：根据Genbank的tlh全基因序列，设计一对附加EcorV和HindⅢ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物，以VP基因组DNA为模板，用高保真Taq酶扩增出tlh基因。连接pGEM-T载体构建克隆载体，测序鉴定后，再用EcorV和HindⅢ酶切回收目的基因并克隆至表达载体pET32 ,采用PCR和双酶切鉴定筛选阳性质粒，转化DE3，IPTG诱导，用SDS－PAGE检测tlh的表达。结果：扩增的目的基因与GenBank的tlh比较具有99％的同源性，重组表达载体转化DE3，能表达融合蛋白。结论：本研究成功扩增出完整的tlh基因，构建了克隆载体和表达载体，获得融合表达的目的蛋白。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1( )-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1( )-Lpp20真核表达重组载体。     

HPV16E6真核表达载体的构建及其在CaSki细胞中的表达及定位

目的:构建pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,转染CaSki细胞,检测其在CaSki细胞中的表达。方法:用RT-PCR法从CaSki细胞中扩增出带有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点的HPV16E6基因片段,将HPV16E6基因全长片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEGFP-C2上,通过脂质体将pEGFP-C2-HPV16E6转染入CaSki细胞。结果:pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体构建成功,转染CaSki细胞48h后经RT-PCR及Western-blot检测可见HPV16E6蛋白的高表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白主要在CaSki细胞核内表达。结论:成功构建了pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,为进一步对HPV16E6的研究奠定了基础。     

TPT1真核表达载体的构建及在肝癌细胞系SMMC-7721中的表达

目的：构建TPT1真核表达载体，并转染肝癌细胞系SMMC-7721，为进一步研究奠定基础。方法：通过PCR的方法在TPT1 ORF（open reading frame，开放读码框）两侧添加EcoRI和BamHI的识别序列，将其定向插入真核报告表达载体pEGFP-N3中，构成pEGFP-N3TPT1重构体，卡那霉素筛选阳性克隆，碱裂解法抽提质粒，Sanger法测序，VeeScreen和BLAST分析测序结果，lipofeetAMINE转染肝癌细胞系SMMC-7721，荧光显微镜及RT-PCR方法检测表达效率。结果：成功扩增了带有特异性核酸内切酶识别位点的TPT1 ORF片段，双酶切后连入pEGFP-N3，测序结果证明，rPT1正确插入pEGFP-N3中，转导SMMC-7721后，在荧光显微镜下，可见细胞发出明亮的绿色荧光，转染效率在30％左右。RT-PCR分析显示，pEGFP-N3TPT1转导的细胞，TPT1 mRNA水平较对照高0．78倍（P〈0．05）。结论：成功构建了TPT1的真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1，pEGFP-N3TPT1可在SMMC-7721细胞内高效表达。     

汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

目的 将编码汉坦病毒76-118株核蛋白的S基因片段克隆到真核表达载体DTARGET TM，构建含汉坦病毒核蛋白S基因的重组真核表达质粒pTARGET-hans，并在体外进行瞬间表达。方法 采用PCR产物直接克隆方法，将核蛋白S基因插入到真核表达载体pTARGE TM中；酶切鉴定；用电穿孔法将重组质粒转染入Vero-E6细胞；用间接免疫荧光法检测其表达产物。结果 酶切鉴定证实S基因已被正确地插入pTARGET TM中；在部分转染重组质粒的Vem-E6细胞胞质内观察到中等强度的特异性荧光。结论 重组的真核表达载体pTARGET-hans已被成功地构建并可在体外表达．为下一步基因免疫打下基础。     

miR-29c真核表达载体构建及鉴定

目的 构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c真核表达载体,为进一步研究miR-29c的功能和靶基因鉴定奠定基础。方法 根据miR-29c成熟体序列设计合成1对miRNA寡聚单链DNA,经退火后克隆到真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR中,瞬时转染肺腺癌A549细胞后,经实时荧光定量PCR检测pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c在肺癌细胞中表达miR-29c。结果 A549转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c 24 h后,miR-29c表达量上升,明显高于阴性对照,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 成功构建真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c,并能有效表达miR-29c。     

前纳豆激酶原基因化学诱导型表达载体的构建及鉴定

目的克隆前纳豆激酶原基因,实现其在大肠杆菌中的表达,并对其表达条件进行研究。方法从枯草芽孢杆菌中分离纯化基因组DNA作为模板,通过PCR扩增前纳豆激酶原基因,将其克隆到质粒pUC19中,构建重组克隆质粒pNK并转化大肠杆菌DH5α;将目的基因片段与表达载体pET30a连接,构建重组表达质粒pENK,转化大肠杆菌BL21（DE3）,对其表达条件进行研究。结果序列检测结果表明,所克隆片段全长1152bp,与Genbank中已报道序列相比较,同源性达到100%。转化菌pENK108-BL21（DE3）经IPTG诱导表达目的产物,SDS-PAGE检测结果显示具特异条带,Western Blotting检测结果表明,表达产物确系目的融合蛋白。转化菌pENK108-BL21（DE3）在LB培养基中经37℃培养,1mmol/L IPTG诱导4h后,目的产物表达量达到最大,约占菌体总蛋白的31%。时间凝块法显示表达物具有一定的纤溶作用。结论成功构建前纳豆激酶原基因化学诱导型表达载体,并对转化菌的表达条件进行了研究。     

hMAM与人HSP70融合基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)与人热休克蛋白70(hHSP70)融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,经酶切测序分析后,与人HSP70基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建了融合基因真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70。将重组载体电穿孔法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果:成功扩增了人HSP70基因与hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM与人HSP70的融合基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM与人HSP70融合基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

E9基因的克隆及蛋白的原核表达和纯化

目的通过分子生物学的手段从库蚊幼虫中获得E9酯酶基因，构建表达载体PET-32aE9，实现在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白并将其纯化。方法通过RT—PCR技术从库蚊幼虫中特异性扩增E9酯酶基因，将目的基因通过基因连接反应与PET-32a载体连接，重组质粒进行基因序列测序，构建PET～32a和目的基因的高表达质粒，异丙基-B—D-硫代半乳糖（isopropylthiogalactoside，IPTG）诱导表达，NP柱纯化，Western．blot法检测纯化的目的蛋白。结果成功获得库蚊幼虫E9酯酶基因，基因测序显示基因突变率为0，表达质粒构建双酶切（BamHI和NcoI）可见目的基因的条带，经IPTG诱导表达，获得带HIS标签的融合蛋白E9，相对分子质量为80．6×10^3，经Western—blot分析证实抗原性正确。结论E9酯酶基因可以通过基因工程手段获得体外高效表达，为其功能的研究、抑制剂的筛选以及农药污染的环境治理提供基础。     

人细小病毒B19VP1基因片段原核表达载体的构建及其表达

目的　克隆人细小病毒B19　VP1基因片段,构建其重组克隆载体和表达载体,并诱导表达。方法　利用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,将B19病毒VP1基因片段扩增后,构建pGEM-T-easy克隆载体;经PCR筛选后,亚克隆于pGEX-4T-1表达载体中,并转化至BL21感受态菌;经诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)诱导表达,并以免疫印迹法对表达蛋白进行鉴定。结果　扩增出一条约 801bp的基因片段,PCR鉴定结果的与预期结果一致。经IPTG诱导,VP1融合蛋白在大肠杆菌中得到成功表达,PAGE上出现相对分子量约为 54KD的一条新生蛋白带,经蛋白印迹验证为表达蛋白B19VP1。薄层扫描现示,表达产物占菌体总蛋白的 27. 4%。结论　获得人细小病毒B19VP1基因片段的原核表达载体及其产物,对进一步研究其纯化及B19疫苗有重要意义。     

人血管内皮细胞生长因子受体2小干扰RNA的设计及其表达载体的构建

目的寻找并探讨干扰效果强的人血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelialgrowth factor receptor2,VEGFR-2）小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）,以抑制白血病细胞。方法设计人VEGFR-2siRNA,并转染HL60细胞,MTT法筛选最有效siRNA;合成VEGFR-2shRNA,并构建VEGFR-2shRNA表达载体;比较VEGFR-2shRNA表达载体转染HL60细胞后干扰的效果。结果筛选出最有效siRNA;VEGFR-2shRNA正确正向克隆入pENTR TM/U6,成功构建VEGFR-2shRNA表达载体;以其将VEGFR-2shRNA瞬时转染入HL60细胞后,细胞生长抑制率为84.9%,P〈0.01;VEGFR-2蛋白表达明显减少。结论通过必要和有效的筛选机制,才能找到抑制效果相对高的siRNA靶序列;VEGFR-2shRNA表达载体可在细胞内简单、快速地克隆shRNA,VEGFR-2的表达抑制率高。