大鼠卵巢组织冷冻保存和自体移植后形态与功能的研究

目的:探讨大鼠卵巢组织冷冻、解冻和自体皮下移植后甾体激素分泌和卵泡生长发育的恢复情况。方法:将大鼠卵巢组织在程序性降温设备中缓慢冷冻,在液氮中保存14天后快速解冻。将新鲜和冻融后的大鼠卵巢组织分别自体异位移植于去势成年雌鼠的腹股沟皮下。术后每日行阴道细胞涂片检查,观察动情周期恢复情况,并分别于移植后4周和8周取移植卵巢进行组织学检查并测定血清雌孕激素水平。结果:新鲜组和冷冻组分别有80.6%和48.5%的大鼠恢复了动情周期,差异有统计学意义(P<0.01)。新鲜组和冷冻组首次恢复动情周期的天数分别为(8.72±1.69)天和(18.15±2.48)天,差异有统计学意义(P<0.01)。移植术后4周时冷冻组的E2和P水平与假手术组及新鲜组相比差异有统计学意义(P<0.05),而移植术后8周时3组激素水平差异已无统计学意义(P>0.05)。新鲜组和冷冻组移植术后4周和8周时移植物内均可见丰富的血管及不同发育阶段的卵泡和黄体。结论:大鼠的卵巢组织可以较好的耐受冷冻损伤,适宜条件下可以复苏恢复甾体激素的分泌,并且有卵泡的生长和发育。非血管吻合自体异位移植卵巢组织的方法简便易行且具有较高的成活率,是冻存卵巢组织较为安全有效的方法。     

人胎儿卵巢组织异种移植的实验研究

目的:探讨人胎儿卵巢组织异种移植后的卵泡生长发育情况。方法:18只裸鼠行去势手术后分为2组:A组为对照组,B组为胎儿卵巢组织移植组,于移植1个月后开始隔天注射5U的孕马血清促性腺激素(PMSG)持续2个月,获取移植物36h前注射hCG。获取胎儿卵巢组织行光学显微镜观察并测血清雌二醇(E2)的浓度。结果:B组血清E2水平明显高于A组,差异有统计学意义(P<0.01)。移植后存活的卵巢组织中有40%~50%的原始卵泡丢失,均以原始卵泡为主,可见少量初级卵泡和次级卵泡,未见窦卵泡的生长。移植后人胎儿卵巢组织中初级卵泡和次级卵泡的比例较移植前显著增加(P<0.01)。结论:人胎儿卵巢组织移植于裸鼠的背部皮下能存活,卵泡处于良好的生长发育状态。     

卵巢组织玻璃化冷冻移植效果及体外受精结局的动物实验研究

目的探讨玻璃化冷冻和组织移植对小鼠卵巢组织的影响。方法将雌性ICR小鼠分为3组:正常对照组(卵母细胞体外培养及受精, n=9)、新鲜移植组(卵巢组织移植后卵母细胞体外培养及受精, n=9)、冷冻移植组(卵巢组织玻璃化冷冻复苏-移植、卵母细胞体外培养及受精, n=9)。同时, 为了更为直接地说明玻璃化冷冻对于卵泡数量的影响和卵巢移植后内分泌功能的改变情况, 本研究还设置了冷冻复苏组(卵巢组织玻璃化冷冻复苏, n=6)和卵巢去势组(卵巢组织切除, n=6)。卵巢组织移植3周后, 通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色计算各组小鼠的卵泡数量、CD31免疫组织化学染色观察卵巢组织新生血管形成、Masson染色观察卵巢组织纤维化、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清性激素水平, 并统计获卵数、体外受精数量和形成囊胚数量。结果新鲜移植组和冷冻移植组小鼠的卵巢组织中总卵泡数量均较正常对照组明显减少(均P<0.001), 且都明显少于冷冻复苏组(均P<0.001);新鲜移植组小鼠卵巢组织CD3...     

成人卵巢组织玻璃化冷冻保存的实验研究

目的探讨玻璃化法冷冻保存对成人卵巢组织的影响。方法采集21例成人卵巢组织,随机分成三组:新鲜对照组、玻璃化冷冻组、程序冷冻组。新鲜的和冻融后的卵巢皮质分别进行光学显微镜观察和原位末端转移酶标记(TUNEL)实验。结果二个冷冻组的异常始基卵泡及初级卵泡比率差别无统计学意义(P>0.05),但均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。冷冻组与对照组的卵泡凋亡率差别无统计学意义(P>0.05)。结论玻璃化冷冻是人类卵巢组织较适宜的冷冻保存方法。     

两种冷冻方法对人卵巢组织冻存效果的分析

目的:比较程序化冷冻与玻璃化冷冻人卵巢组织的冻存效果。方法:收集19例人卵巢组织标本,每例分成2份,1份应用程序化方法冷冻,另1份应用玻璃化方法冷冻,复苏后分别移植到去卵巢的雌性裸鼠颈部皮下。38只重症联合免疫缺陷(SCID)裸鼠(移植宿主)随机分为2组:A组19只,移植程序化冷冻复苏的人卵巢组织;B组19只,移植玻璃化冷冻复苏的人卵巢组织。以去除移植宿主双侧卵巢日为D0,移植人卵巢组织日为D21,整个实验过程中,每日通过阴道脱落细胞学检查观察移植宿主动情周期变化,分别于D0、D21、D42、D63取裸鼠静脉血,酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测血清AMH浓度。结果:切除卵巢后移植宿主动情周期消失,D63共有14只裸鼠恢复动情周期,2组间差异无统计学意义(A组8只,B组6只,P0.05),但A组恢复时间显著少于B组[(16.38±1.60)d vs.(18.33±1.21)d,P0.05]。2组间AMH水平在D0、D21、D42、D63差异均无统计学意义(P0.05),但A组、B组D21 AMH水平均显著低于D0,差异有统计学意义(P0.05)。恢复动情周期移植宿主的AMH水平在D42和D63逐渐回升但未恢复至D0水平,未恢复动情周期移植宿主的AMH水平在D42和D63均未回升但仍低于D0。结论:程序化冷冻和玻璃化冷冻均能有效保存卵巢组织。在冷冻的卵巢组织经解冻-移植后宿主恢复动情周期方面,程序化冷冻要优先于玻璃化冷冻,但仍需进一步研究。     

两种冷冻方法对人卵巢组织冻存效果的分析

目的：比较程序化冷冻与玻璃化冷冻人卵巢组织的冻存效果。方法：收集19例人卵巢组织标本，每例分成2份，1份应用程序化方法冷冻，另1份应用玻璃化方法冷冻，复苏后分别移植到去卵巢的雌性裸鼠颈部皮下。38只重症联合免疫缺陷（SCID）裸鼠（移植宿主）随机分为2组：A组19只，移植程序化冷冻复苏的人卵巢组织；B组19只，移植玻璃化冷冻复苏的人卵巢组织。以去除移植宿主双侧卵巢日为D0，移植人卵巢组织日为D21，整个实验过程中，每日通过阴道脱落细胞学检查观察移植宿主动情周期变化，分别于D0、D21、D42、D63取裸鼠静脉血，酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测血清AMH浓度。结果：切除卵巢后移植宿主动情周期消失，D63共有14只裸鼠恢复动情周期，2组间差异无统计学意义（A组8只，B组6只，P＞0.05），但A组恢复时间显著少于B组[（16.38±1.60）d vs.（18.33±1.21）d，P＜0.05]。2组间AMH水平在D0、D21、D42、D63差异均无统计学意义（P＞0.05），但A组、B组D21 AMH水平均显著低于D0，差异有统计学意义（P＜0.05）。恢复动情周期移植宿主的AMH水平在D42和D63逐渐回升但未恢复至D0水平，未恢复动情周期移植宿主的AMH水平在D42和D63均未回升但仍低于D0。结论：程序化冷冻和玻璃化冷冻均能有效保存卵巢组织。在冷冻的卵巢组织经解冻-移植后宿主恢复动情周期方面，程序化冷冻要优先于玻璃化冷冻，但仍需进一步研究。     

卵巢皮质玻璃化冷冻保存及移植的损伤因素

卵巢组织冻存和移植在技术上可行,有效性也随着技术发展而提高,可用于女性生育力保存,尤其是青春期前放化疗的患癌女性的生育能力保存。玻璃化冷冻被认为是目前最有潜力的卵巢组织冻存方法之一,但其安全性和有效性尚需进一步验证。冷冻损伤及移植缺血再灌注损伤是卵巢冻存和移植中需要克服的难题,如何尽可能有效地保存卵泡是难点及重点。从冷冻保护剂、卵巢组织大小、冷冻载体、抗氧化剂、促进新血管形成和激素6个方面对目前已有的玻璃化冷冻及移植条件、效果等进行了阐述,有益于女性生育力保存的项目推进。     

人类卵巢组织冷冻保存及其评价的研究进展

恶性肿瘤及其治疗过程可能导致女性患者的卵巢功能衰竭,而卵巢组织冷冻保存使这些患者的生育储备以及生殖、内分泌功能的保存成为可能,具有重要的现实意义和广阔的应用前景.目前,卵巢组织冷冻保存技术包括慢速冷冻法、快速冷冻法和玻璃化冷冻法.卵巢组织冻融后主要通过组织学光镜观察卵母细胞和颗粒细胞形态;电镜下观察卵母细胞和间质细胞的线粒体、内质网、核膜和核染色质等超微结构改变评价冻融的影响;冻融组织培养后主要通过观察各卵泡,包括卵泡的直径大小、颗粒细胞的形态和层数、以及卵泡腔和透明带的形成和培养液中激素的含量等评价组织生长发育潜能;通过组织移植技术,检测移植宿主内分泌功能或生殖和内分泌功能的恢复是评价冻存复苏成败的重要指标和目标.     

人卵巢组织3种超低温冷冻方法比较

目的:探讨3种玻璃化冷冻降温方案对成人卵巢中各级卵泡和卵巢间质的形态学及分离卵泡活性的影响。方法:采集14例人卵巢组织,随机分成3组:自制冷冻环组、筛网组、微滴组,均采用乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)、蔗糖作为冷冻保护剂,上述3组采用不同载体降温实现玻璃化,冷冻前后卵巢组织通过苏木素-伊红(H-E)染色检测人卵巢中各级卵泡和卵巢间质的形态学改变并计数卵泡数目;用台盼兰染色进一步观察冷冻前后卵巢组织中分离卵泡活性。结果:冷冻前3组新鲜卵巢组织中形态正常卵泡百分比差异无统计学意义(P0.05)。冷冻环组复苏后形态正常卵泡百分率与冷冻前比较差异无统计学意义(P0.05);筛网组和微滴组复苏后均较冷冻前明显下降(P0.01,P0.05),冷冻环组复苏后形态正常卵泡百分率高于筛网组和微滴组;光镜下形态学分析提示冷冻环较筛网可以更好地保存人卵巢间质形态(P0.01);分离卵泡台盼兰染色提示冷冻后卵泡活性明显下降(P=0.016)。结论:用自制冷冻环可以较好地保存人卵巢组织中的始基卵泡和初级卵泡及卵巢间质形态。玻璃化冷冻卵巢组织后分离获得的总卵泡中有活性卵泡比例较新鲜分离卵泡下降。     

辛伐他汀改善小鼠卵巢组织自体移植的效果

目的:探索辛伐他汀在小鼠卵巢组织自体移植中的效果和机制。方法:选择6～8周雌性ICR小鼠80只。10只小鼠制备新鲜卵巢组织(新鲜卵巢组),另取10只小鼠切除双侧卵巢组织,玻璃化冷冻(冷冻-解冻卵巢组)。余下的60只小鼠切除双侧卵巢玻璃化冷冻-解冻后自体移植至背部肌肉,随机分成2组(各30只),移植后第1天开始分别以生理盐水(生理盐水组)和辛伐他汀(5 mg/kg,辛伐他汀组)灌胃至移植后第7天。2组分别在移植后第3,7,21天,每组每时间点各处死5只鼠(共处死30只),回收卵巢组织和血清。光学显微镜下观察HE染色的卵巢组织,免疫组织化学检测细胞核增殖性抗原ki67和CD34,原位末端标记法(Tunel法)计数Tunel阳性细胞数,血清雌二醇(E2)和卵泡刺激素(FSH)浓度,2组分别在移植后第3,7天,每组每个时间点各处死5只鼠(共处死20只)测定卵巢组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。本实验中移植术后小鼠死亡4只,灌胃死亡2只,最终剩余4只脱颈处死按动物伦理处理尸体。结果:冷冻-解冻卵巢组比新鲜卵巢组的窦卵泡数减少,Tunel阳性细胞数增加(均P0.05)。新鲜卵巢组织和冷冻-解冻卵巢组织均可见ki67表达。移植后第3,7天辛伐他汀处理组比生理盐水组原始卵泡数多、凋亡细胞数少(均P0.05)。移植后第21天卵巢组织生长良好,2组都可见窦卵泡,辛伐他汀组原始卵泡数和窦卵泡数比生理盐水组多(均P0.05)。移植后第3,7天,辛伐他汀组卵巢组织血管数比生理盐水组多(均P0.05)。辛伐他汀组在移植后第21天血清E2高于生理盐水组(P0.05);血清FSH水平在第21天比生理盐水组低(P0.05)。移植后第3,7天,辛伐他汀组卵巢组织MDA低于生理盐水组,SOD高于生理盐水组(均P0.05)。结论:辛伐他汀通过抗氧化、促血管再生改善小鼠卵巢组织自体移植的效果。     

曲普瑞林对化疗药物引起卵巢损伤的预防作用

目的:探讨化疗对卵巢的损害和促性腺激素激动剂(GnRHa)曲普瑞林对化疗中卵巢的保护作用及机制。方法:选用2～3月龄、体重(250±10)g的SD雌性大鼠40只,随机分为正常对照组、顺铂(DDP)组、GnRHa组及GnRHa+DDP组,比较用药后4组大鼠卵巢、子宫湿重和形态学变化,采用放射免疫法测大鼠血清雌二醇(E2)、卵泡生成素(FSH)水平,免疫组织化学方法检测4组大鼠卵巢中Bcl-2、Caspase-3的表达。结果:DDP组与对照组比较大鼠体重明显减轻(P<0.05),卵巢、子宫重量明显下降(P<0.05);光镜下DDP组各期卵泡总数显著减少,GnRHa使生长卵泡数、成熟卵泡数减少,初级卵泡数及总卵泡数增加。GnRHa+DDP组可见GnRHa能明显改善化疗药物对卵巢的损害,保存了大部分初级卵泡且总卵泡数增加。结论:GnRHa的先期预防性应用对化疗所致的大鼠卵巢损伤有一定的保护作用。     

未成年大鼠亚慢性染镉对卵巢生长发育的影响

目的观察未成年大鼠亚慢性染镉对卵巢生长发育的影响。方法 48只大鼠按体重随机分为4组（对照组和低、中、高染毒组）,氯化镉浓度分别为0、0.5、2.0和8.0mg/kg,每天1次灌胃染毒,每周6d,连续5周。于动情前期处死大鼠,观察镉对大鼠卵巢生长发育的影响。结果与对照组相比,高剂量组动情间期延长,而动情期缩短;各染毒剂量组体重下降,但卵巢重量和脏器系数差异无统计学意义;与对照组相比,高剂量组闭锁卵泡占比升高,而生长卵泡下降;血清雌激素（E2）无明显改变,孕激素（P4）呈下降趋势,但与对照组差异无统计学意义;各染毒组颗粒细胞培养液E2、P4水平均低于对照组。结论未成年大鼠亚慢性染镉,会影响卵巢卵泡发育及性激素分泌功能。     

人卵巢癌荷瘤裸鼠两种皮下移植瘤模型的构建及生长特性的比较

目的:构建人卵巢上皮癌裸鼠皮下移植瘤动物模型,并对实体瘤组织块移植及细胞悬液移植的肿瘤模型及其生长特性进行了一系列比较研究,以期为研究卵巢癌的发病机制及靶向治疗措施确定体内实验的最佳模型,并提供充分的理论依据。方法:随机选择10只6～8周龄的裸鼠,分为实体瘤组织块移植组和细胞悬液移植组,每组各5只。通过显微外科手术将瘤体小块接种到裸鼠腋下皮肤,将另一部分瘤体碾碎制成细胞悬液,将1×107个/ml的细胞悬液0.2 ml裸鼠腋下皮肤内注射。动态追踪两组肿瘤模型的生长情况及体内肿瘤的转移情况,处死荷瘤鼠取出肿瘤组织后做病理学检查。结果:全部裸鼠均皮下成瘤,成功率为100%。组织块接种的裸鼠肿瘤生长速度比细胞接种的裸鼠明显快,接种21天后处死裸鼠,组织块接种组比细胞接种组明显增大,两组肿瘤平均体积差异有统计学意义(P<0.05)。通过尸检发现所有裸鼠均未出现淋巴及其他器官的转移,病理学检查提示两组裸鼠移植瘤都具有人卵巢癌组织学特征。结论:构建了人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,两种方法建立的动物模型均可用于从整体水平对卵巢癌进行相关研究,是理想的卵巢癌动物模型。人卵巢癌组织块接种法构建的动物模型更适合用于周期较短的实验研究。     

Assessment of Estrogen Receptors and Apoptotic Factors in Cryopreserved Human Ovarian Cortex

The aims of this study were: (i) to examine frozen-thawed ovarian tissues for features of follicular health and atresia by histology; (ii) to assess the expression of estrogen receptors alpha (ERα) and beta (ERβ) by real-time PCR; (iii) to evaluate the Bax/Bcl-2 ratio, as an apoptotic index, in the ovarian tissues before and after cryopreservation.

Ovarian cortical biopsies were obtained from 11 patients. The fragments were subdivided into two groups, fresh (control tissues) and cryopreserved tissues obtained by direct plunging into liquid nitrogen. Both tissue groups were subjected to a histological evaluation of the healthy and atretic follicles, immunohistochemical localization of the ER, and a real-time PCR (qPCR) to evaluate the expression of ER, Bax, Bcl-2 as well as β-actin, as control gene. Damage was observed in 31% of primordial, 45% of primary, and 75% of secondary follicles in the cryopreserved tissue group. The qPCR analysis showed that the level of ERβ was greater in fresh than cryopreserved tissues, whereas the ERα expression and Bax/Bcl-2 ratio were similar in both tissue groups. A significant inverse association was observed between ERα mRNA levels in the fresh tissue group and subjects' ages.

The results show that cryopreservation and thawing of human ovarian tissue does not affect the morphology of primordial or primary follicles and that cryopreservation does not affect apoptosis. However, cryopreservation seems to have an inhibitory effect on the level of ERβ. Additional studies are needed to evaluate the differential effects of freezing follicles at different stages of follicular development and ovarian steroidogenesis.     

亮丙瑞林、维生素E对顺铂所致大鼠生殖毒性保护及血清抑制素B变化的研究

目的:探讨亮丙瑞林、维生素E对顺铂所致大鼠子宫、卵巢毒性保护,及测定抑制素B对卵巢储备功能预测的价值。方法:选用清洁级、12周龄雌性SD大鼠64只,体重(270±20)g,随机分为A、B、C、D4组(每组16只),A组为正常对照组,B组为顺铂组,C组为抑那通(GnRHa类药物)+顺铂组,D组为维生素E(自由基清除剂)+顺铂组。A组给予生理盐水2mg/d腹腔注射,连续10天;B组给予顺铂2mg/(kg.d)腹腔注射,连续10天;C组给予亮丙瑞林0.25mg/只1皮下注射,期间持续观察性周期10天,待全部处于间情期,即第11天给予顺铂2mg/(kg.d),连续10天,D组给予维生素E50mg/(kg.d),胃灌注同时腹腔注射顺铂2mg/(kg.d),连续10天。用药结束后当天及用药结束后30天雌鼠分别各组处死8只,经心脏采血,测血清抑制素B水平、卵泡刺激素(FSH)水平,摘除双侧卵巢在光镜下进行形态学病理学观察,进行各级卵泡计数。结果:用药结束后当天:B组与其他各组比较,各级卵泡数目,抑制素B水平均明显降低,FSH水平升高,且卵巢伴有间质纤维化、坏死;C组原始卵泡数量明显多于B组;D组各级卵泡数量均减少,但多于B组(P0.05),出血、坏死现象较B组减轻,两组抑制素B水平与A组相比降低但高于B组,C组FSH水平降低。用药结束后30天:B组、D组各级卵泡数量均减少,但多于用药结束后当天(P0.05),有成熟卵泡发育;各组抑制素B水平比用药结束后当天均升高,但同组相比B组最低(P0.05),FSH水平未见明显差异。结论:①顺铂分别与亮丙瑞林、维生素E的联合应用对预防化疗所致的大鼠卵巢损伤有一定的保护作用。②血清抑制素B水平下降是反映卵巢储备功能下降的直接指标,较FSH水平升高更早期、更敏感。     

巨噬细胞在PCOS发病机制中的作用

目的:建立非甾体类芳香化酶抑制剂——来曲唑诱导雌性大鼠多囊卵巢综合征(PCOS)动物模型。观察巨噬细胞在PCOS大鼠卵巢中的分布及数量的变化,探讨其在PCOS发病机制中的作用。方法:①选择6周龄SD清洁级雌性大鼠60只,随机分为实验组、实验对照组,空白对照组每组各20只。应用来曲唑灌胃制备PCOS大鼠模型,观察3组大鼠动情周期的变化及双侧卵巢大体解剖和组织学改变。②放射免疫法测定血LH、FSH、E2、P、T水平。③免疫组化法观察卵巢组织中巨噬细胞的情况。结果:①实验组大鼠失去规律性动情周期,提示无排卵;②实验组血清T、LH浓度高于对照组(P<0.05),血清P、E2浓度低于对照组(P<0.05);③实验组巨噬细胞在窦前卵泡膜层的数量高于对照组(P<0.05),在窦状卵泡膜层的数量低于对照组(P<0.05)。结论:①来曲唑诱导的大鼠模型是理想的PCOS动物模型。②巨噬细胞参与了PCOS的发病机制。     

冷冻卵巢移植研究进展

哺乳动物的卵巢内有数量众多的卵细胞，是雌性生殖细胞的一个资源库。冷冻保存健康的卵巢组织，快速复苏后再原位移植到盆腔或异位移植至皮下及肾被膜等部位，有望恢复母体的生育力和维持正常激素水平。卵巢组织移植的成功与否取决于移植物的大小、局部缺血持续时间、外源性抗氧化剂和血管生成因子等因素。目前，已有少数关于人类卵巢冷冻移植并成功获得活产儿的报道，也有较多动物实验得到证实。现就冷冻卵巢移植的研究进展进行综述。     

长期使用葛根素对去卵巢大鼠阴道壁结构的影响

目的:观察长期使用葛根素对去卵巢大鼠阴道壁结构的影响,为中西药葛根素与雌激素组合治疗Ⅰ型骨质疏松症提供实验依据。方法:5月龄健康雌性大白鼠40只,分成5个实验组(n=8只),除假手术组外均建立去卵巢动物模型。①假手术组(Sham);②去卵巢模型组(OVX);③葛根素-50组(Pr-50),皮下注射葛根素50 mg/kg,1次/天;④雌二醇-200组(E2-200),皮下注射雌二醇200μg/kg,2次/周;⑤葛根素-25+雌二醇-100组(Pr-25+E2-100),皮下注射葛根素25 mg/kg,1次/天和雌二醇100μg/kg,2次/周。在第20周,取大鼠血清和阴道壁,观察血清雌二醇(E2)水平和阴道壁结构的变化。结果:OVX组E2水平、阴道上皮及肌层厚度明显低于其他各组(P﹤0.05);E2-200组E2水平、阴道上皮及肌层厚度明显高于其他各组(P﹤0.05);Pr-25+E2-100组E2水平较Pr-50组高(P﹤0.05),但两组间阴道上皮及肌层厚度差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论:较大剂量雌二醇可明显促进去卵巢大鼠阴道上皮和肌层增生;小剂量的雌二醇与葛根素联合、较大剂量的葛根素对去卵巢大鼠阴道上皮和肌层增生作用不明显。