玻璃化冷冻法在未成熟卵子冷冻技术中的应用

目的:探讨玻璃化冷冻法在未成熟卵子冷冻方面的应用价值。方法:选取GV期卵母细胞744枚,随机分为5组,A组(128枚),GV期卵子直接进行未成熟卵母细胞体外培养(IVM);B组(220枚),GV期卵子直接行玻璃化冷冻;C组(155枚),GV期卵子直接行IVM,待培养至MⅡ期,再行玻璃化冷冻;D组(112枚),GV期卵子去除冠-丘细胞,行玻璃化冷冻;E组(129枚),GV期卵子保留除冠-丘细胞行玻璃化冷冻。比较各组卵母细胞的存活率、成熟率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果:与A组相比,B组和C组的成熟率、受精率、卵裂率和囊胚形成率均降低(P<0.05);B组与C组间存活率、成熟率、受精率、卵裂率和囊胚形成率无差异(P>0.05)。E组的成熟卵子率较D组提高(P<0.05),但两组在解冻卵子存活率、受精率、2细胞数和>2细胞数方面无差异(P>0.05)。结论:未成熟卵子的玻璃化冷冻保留冠-丘细胞可显著提高冻融效果。     

细胞松弛素B在人类体外成熟卵子冷冻中的作用

目的:探讨细胞松弛素B在人类体外成熟卵子玻璃化冷冻中的作用。方法:收集常规胞浆内单精子显微注射-胚胎移植(ICSI-ET)周期中未成熟卵母细胞234枚(包括生发泡期即GV期和第1次减数分裂中期即MⅠ期),在体外培养24～48 h,181枚卵母细胞成熟(排出第2极体),随机分成3组并行玻璃化冷冻。A组(43枚)用细胞松弛素B(CB)预处理30 min后行玻璃化冷冻;B组(66枚)用CB预处理20 min后行玻璃化冷冻,C组(72枚)未用CB预处理直接行玻璃化冷冻。D组为对照组30枚体内成熟卵子未用CB处理直接玻璃化冷冻。各组卵子冷冻3周后解冻,复苏的卵子行ICSI辅助授精,观察各组成活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果:冻融后的体外成熟卵子,其成活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率均显著低于体内成熟卵子(P<0.05)。A组的成活率显著低于B、C两组(P<0.05),A、B、C 3组间的受精率、卵裂率差异无统计学意义(P>0.05),A、B两组未获囊胚,C组仅有1枚囊胚。结论:冻融体外成熟卵子,成活率、受精率、卵裂率均下降,囊胚形成率低,胚胎后期发育潜能显著降低。CB预处理未能提高卵子冷冻的成活率、受精率、卵裂率及胚胎的发育潜能。     

Hemi-straw玻璃化与程序化冷冻小鼠不同发育阶段胚胎的效果

目的:探讨半细管(Hem i-straw)玻璃化方法与程序化方法冷冻不同发育阶段小鼠胚胎的效果。方法:采用慢速程序化方法与玻璃化方法冷冻小鼠原核期胚胎、卵裂期及早期囊胚期胚胎。解冻后观察存活率、囊胚形成率。结果:采用玻璃化方法冷冻小鼠卵裂期与早期囊胚期胚胎的存活率为92.7%与95.5%,显著高于玻璃化冷冻原核期胚胎的存活率79.8%与程序化冷冻的各组(均P<0.01)。程序化冷冻早期囊胚的存活率仅为50.2%,显著低于其他组(均P<0.01)。经培养后囊胚的形成率比较,程序化冷冻组内无显著性差异(P>0.05),但均显著低于玻璃化冷冻组(均P<0.01)。玻璃化冷冻卵裂期与早期囊胚组的囊胚形成率高达90.1%与92.2%,显著高于原核期胚胎玻璃化冷冻组69.5%(均P<0.01)。结论:胚胎行冷冻保存时,玻璃化冷冻效果较程序化冷冻好,且选择早期囊胚可获最佳冷冻效果。     

人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻研究

目的:研究人类成熟卵母细胞玻璃化的方法和冷冻液,探讨人类卵母细胞玻璃化冷冻保存的方法及临床应用价值。方法:运用cryoleaf进行人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存,复苏后行胞浆内单精子注射-胚胎移植或培养至囊胚形成,观察复苏后卵母细胞受精及发育能力。根据冷冻方法分为程序化冷冻组和玻璃化冷冻组,又将玻璃化冷冻组分为自配液冷冻组和成品液冷冻组,比较各组存活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果:程序化冷冻组和玻璃化冷冻组间存活率、卵裂率、囊胚形成率均无显著性差异(P>0.05),但是受精率存在显著性差异(P<0.05);程序化组与自配液组、成品液组间存活率、卵裂率均无显著性差异(P>0.05),但受精率存在显著性差异(P<0.05)。成品液组与自配液组、程序化组间囊胚形成率存在显著性差异(P<0.05)。程序化组移植4例,获得临床妊娠并分娩1例,玻璃化组移植7例,获得1例生化妊娠。结论:程序化冷冻与玻璃化冷冻法均可应用于人类成熟卵母细胞,冻融后卵母细胞具备正常受精能力及卵裂能力。玻璃化冻存人类卵母细胞具有更大发展趋势。     

人未成熟卵玻璃化冷冻初步实验探讨

目的:对人未成熟卵母细胞玻璃化冷存保存技术进行初步实验探讨。方法:采用OPS玻璃化冷冻方法,对未成熟的卵子进行冷冻,解冻后体外成熟培养,ICSI受精,观察胚胎培养情况,并对某些影响因素进行探讨。结果:冷冻了GV期卵62个,M I期卵40个。两期卵细胞复苏后存活率、成熟率、受精率和卵裂率分别为:80.65%、77.50%,52.00%、41.94%,57.69%、61.54%,60.00%、62.50%,两组间比较无统计学差异(P>0.05);采用HTF或G-Mops两种缓冲液配制玻璃化冷冻液冷冻解冻未成熟卵效果无统计学差异(P>0.05);未成熟卵解冻后置于含性激素的TCM199与单纯IVF30中成熟培养效果无统计学差异(P>0.05)。结论:应用OPS玻璃化冷冻方法能够有效冻存未成熟卵母细胞。     

人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻研究

目的:研究人类成熟卵母细胞玻璃化的方法和冷冻液,探讨人类卵母细胞玻璃化冷冻保存的方法及临床应用价值.方法:运用cryoleaf进行人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存,复苏后行胞浆内单精子注射一胚胎移植或培养至囊胚形成,观察复苏后卵母细胞受精及发育能力.根据冷冻方法分为程序化冷冻组和玻璃化冷冻组,又将玻璃化冷冻组分为自配液冷冻组和成品液冷冻组,比较各组存活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率.结果:程序化冷冻组和玻璃化冷冻组间存活率、卵裂率、囊胚形成率均无显著性差异(P＞0.05),但是受精率存在显著性差异(P＜0.05);程序化组与自配液组、成品液组间存活率、卵裂率均无显著性差异(P＞0.05),但受精率存在显著性差异(P＜0.05).成品液组与自配液组、程序化组间囊胚形成率存在显著性差异(P＜0.05).程序化组移植4例,获得临床妊娠并分娩1例,玻璃化组移植7例.获得1例生化妊娠.结论:程序化冷冻与玻璃化冷冻法均可应用于人类成熟卵母细胞,冻融后卵母细胞具备正常受精能力及卵裂能力.玻璃化冻存人类卵母细胞具有更大发展趋势.     

OPS法玻璃化冷冻未成熟卵母细胞的效果观察

目的:探讨OPS(open pu lled straw,开放式拉细麦管)法玻璃化冷冻技术冻存未成熟卵母细胞的效果。方法:小鼠GV期卵母细胞用OPS法玻璃化冷冻复苏后行体外成熟培养(in-vitro m aturation,IVM)或直接行IVM,所获成熟卵行体外受精(IVF)和胚胎的体外培养(IVC)。以体内成熟卵行IVF/IVC作为in-vivo对照组。结果:GV期卵冻融后65.11%存活,IVM后成熟率为52.86%,其成熟率显著低于IVM对照组。冻融卵成熟后受精、卵裂率(33.78%、76.00%)低于IVM对照组和in-vivo对照组,培养后未见囊胚形成。结论:OPS法玻璃化冷冻技术可有效冻存GV期卵母细胞,复苏后可发育成熟,但卵的受精和继续发育能力欠佳。     

不同胚胎冷冻方法对冻融胚胎移植患者临床结局的影响

目的:比较人卵裂期胚胎玻璃化冷冻和慢速冷冻解冻后胚胎复苏率、卵裂球完整率、种植率以及临床妊娠率,评价两种方法的有效性。方法:选择2009年7月～2010年3月在辅助生殖中心行F-ET的89例患者,将其分为玻璃化冷冻组(46例)和慢速冷冻组(43例),比较解冻后胚胎复苏率、卵裂球完整率、种植率以及临床妊娠率。结果:玻璃化冷冻组与慢速冷冻组比较具有较高的胚胎复苏率(92.7%vs.66.1%)、卵裂球完整率(89.2%vs.61.4%)、种植率(21.1%vs.4.7%)以及临床妊娠率(47.8%vs.23.3%)。结论:玻璃化冷冻法解冻后胚胎复苏率高,卵裂球完整性好,胚胎具有更好地发育潜能,是人卵裂期胚胎冷冻的有效方法。     

小鼠卵母细胞程序化和玻璃化冷冻效果的比较

目的本实验通过建立小鼠的实验模型,比较程序化和OPS玻璃化冷冻效果,探讨卵子冷冻的具体方法,为卵子冷冻技术应用于临床提供实验依据。方法通过促排卵获取小鼠MII期卵母细胞,随机分组,观察不同冷冻方法、高浓度的冷冻保护液,对卵子的成活及进一步发育潜能的影响;不同的IVF前培养时间对冻融卵子的受精及继续发育的影响。结果（1）OPS玻璃化冷冻组与程序化冷冻组的存活率、受精率、卵裂率及6—8cell胚形成率均无显著差异。（2）玻璃化冷冻组与暴露组的卵母细胞存活率分别为35．3％,100％,有显著性差异（P〈0．05）。暴露组与对照组比较的受精率、卵裂率,无显著性差异（P〉0．05）。而暴露组与对照组的6—8cell的胚形成率分别为41％,63％,两组比较,有显著差异（P〈0．05）。（3）无论OPS玻璃化冷冻法还是程序化冷冻法,冻融后的培养2h组和培养1h组的,受精率、卵裂率。两组比较,均有显著性差异（P〈0．05）。结论本实验证实,OPS玻璃化冷冻法至少可以达到程序化冷冻法同样的效果,而OPS玻璃化冷冻法有好于程序化冷冻法的趋势。加之,其简便、省时、经济等优点,因而,更有发展前景。     

卵泡刺激素及戊酸雌二醇对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的:探讨卵泡刺激素(FSH)、戊酸雌二醇(E2)对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟、受精及卵裂能力的影响.方法:对雌性小鼠进行超促排卵后处死小鼠,取出卵巢,刺破卵泡,收集形态较好的未成熟卵母细胞,随机分为6组,在不添加激素的基础培养液中以及分别添加10,50 IU/mL的FSH及1,10,100 mg/L的戊酸E2的培养液中培养24h后,观察各组卵母细胞的成熟情况.对已成熟的卵母细胞进行体外受精,观察卵母细胞受精情况.受精后继续培养48～72 h,观察其卵裂情况.比较各组的成熟率、受精率和卵裂率.结果:①各浓度FSH组及各浓度戊酸E2组与对照组相比,成熟率[生发卵泡破裂率(GVBD率)、MⅡ率]及卵裂率的差别均无统计学意义(P＞0.05).②10,50 IU/mL FSH组以及10 mg/L戊酸E2组的受精率分别为41.18％,40％和42.86％,均高于对照组(19.44％),差异有统计学意义(P＜0.05);1,100 mg/L戊酸E2组与对照组相比受精率差异均无统计学意义(P＞0.05).③各浓度FSH组之间以及各浓度戊酸E2组之间成熟率(GVBD率、MⅡ率)、受精率及卵裂率的差别均无统计学意义(P＞0.05).结论:在小鼠体外成熟培养液中添加10,50 IU/mLFSH及10 mg/L戊酸E2能促进小鼠卵母细胞胞质的成熟,从而提高受精率.     

Improvement of embryonic development and clinical outcomes of germinal vesicle stage oocytes using a microvibration culture system

ABSTRACT

In vitro maturation (IVM) has evolved as a clinical treatment option in assisted reproductive technology. However, the poor developmental potential of germinal vesicle (GV)-stage oocytes is still suboptimal. This study’s objective was to evaluate the effect of a microvibration culture system (MVC) during IVM and/or in vitro culture (IVC) on the clinical outcomes and the embryonic development potential of human GV-stage oocytes collected from human chorionic gonadotropin (HCG)-primed IVM and fertilization-embryo transfer (IVM/F-ET) cycles of patients with polycystic ovaries (PCO). A total of 206 HCG-primed IVM/F-ET cycles were divided into four groups according to the microvibration and static culture system applied during IVM and/or IVC: Group SS (static system during both IVM and IVC); Group SV (static system during IVM alternated with microvibration system during IVC); Group VS (microvibration system during IVM alternated with static system during IVC), and Group VV (microvibration system during both IVM and IVC). The results indicate that the rates of in vitro MII oocytes per cycle, fertilization, and cleavage were not significantly different between the groups. The rate of good-quality embryos in Group SV tended to be higher than the rate in Groups SS and VS, but there was no significant difference between Group SS and Group SV. Clinical pregnancy, implantation, and live birth rates of Groups SV and VS were slightly higher than those of Group SS. However, the rate of good-quality embryos with at least six cells on day 4, the clinical pregnancy, implantation, and live births in Group VV were significantly higher than those in Group SS. These results indicate that, compared with the static culture system, the MVC system applied for both IVM and IVC seems to improve the clinical outcomes and the quality of embryos of GV oocytes derived from HCG-primed IVM/F-ET cycles in PCO patients.

Abbreviations: PCO: polycystic ovaries; HCG: human chorionic gonadotropin; GV: germinal vesicle; MII: metaphase II; IVM: in vitro maturation; IVF: in vitro fertilization; IVC: in vitro culture: MVC: microvibration culture; SC: static culture; ICSI: intracytoplasmic sperm injection; IVM/F-ET: IVM and fertilization-embryo transfer; AMH: anti-Mullerian hormone; OHSS: ovarian hyperstimulation syndrome     

超排卵周期未成熟卵母细胞体外培养及其激活效应

目的:探讨超排卵周期中获得的未成熟卵母细胞的利用价值及人工辅助激活能否改善源于此类卵母细胞的胚胎的发育结局。方法:对226枚超排卵周期中获得的未成熟卵母细胞行体外成熟(IVM)培养,发育至MⅡ期卵母细胞行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)授精,受精后卵母细胞随机分成非激活组和激活组,非激活组卵母细胞ICSI后不作任何处理直接移入G-1中培养,激活组卵母细胞ICSI后入7%无水乙醇作用6 min(即人工辅助激活),比较两组受精、卵裂、优质胚胎、囊胚及优质囊胚形成情况。结果:未激活组和激活组体外成熟率分别为83.9%(94/112)和82.5%(94/114)、受精率分别为80.9%(76/94)和76.6%(72/94)、优质胚胎率分别为14.3%(10/70)和25.0%(18/72),囊胚形成率分别为8.6%(6/70)和16.7%(12/72),两组间差异无统计学意义(P>0.05),但卵裂率激活组(100%,72/72)高于未激活组(92.1%,70/76),差异有统计学意义(P<0.05),优质囊胚率激活组(83.3%,10/12)明显高于未激活组(0%,0/6),差异有统计学意义(P<0.01)。结论:超排卵周期中的未成熟卵母细胞经体外培养成熟可获得比较满意的受精率及早期胚胎发育潜能,人工辅助激活技术为超排卵周期中获取的未成熟卵母细胞的充分利用提供一种新的思路     

人卵母细胞玻璃化冷冻的分子表达变化

卵母细胞冷冻技术是体外受精助孕的重要组成部分,是保存女性生育力的主要途径,卵母细胞冷冻保存易对卵母细胞造成不可逆损伤。卵丘细胞对卵母细胞体外成熟过程具有重要作用,在冷冻过程也可能受损伤。目前已知玻璃化冷冻/解冻对卵母细胞（包括成熟与未成熟卵母细胞）的影响,可改变卵母细胞正常发育必需基因的表达,如卵母细胞成熟（GDF9、BMP15）、凋亡（Bax、Bcl-2）、细胞骨架（CK8、ACTB）、细胞周期（CCNA1、MCM10）、缝隙连接（GJA1）、发育能力（HDAC1、STAT3、SMARCAL1和DNMT3B）、脂质代谢（cGMP）等方面的改变。就卵母细胞玻璃化冷冻前后的分子及基因变化进行阐述,为卵母细胞玻璃化冷冻提供更好的理论基础和实验依据。     

Successful cryoloop vitrification and subsequent in vitro maturation of mouse preantral follicles

The purpose of this study was to assess follicular viability and competence through in vitro maturation (IVM) of cryoloop vitrified mouse preantral follicles. Early mouse preantral follicles were isolated and vitrified using the cyroloop vitrification technique. After thawing, the preantral follicles and oocytes were cultured and in vitro matured for 10 d to the metaphase two stage (M2). Oocytes were assessed for viability at 2 and 10 d of IVM and compared to a control group of freshly isolated preantral follicles undergoing IVM. Of vitrified follicles, 94.0% (345/367) were recovered after thawing. The survival rate after the first two-days of IVM culture was 82.3% (284/345) for the cryoloop vitrified follicles and 100% for the control follicles (437/437). The percentage of oocytes in the cryoloop group that developed to M2 was 70.2% (174/248), comparable to that of the control group at 68.7% (241/351) (p value 0.12). Our results indicate that cyroloop vitrification is a viable and practical technique for cryopreservation of mouse preantral follicles. Human oocyte cryopreservation by means of cryoloop vitrification may prove to be useful as a possible treatment modality for human fertility preservation.     

体外培养成熟技术对未成熟卵母细胞冻融的影响

目的:探索影响未成熟卵母细胞冻融技术的关键因素。方法:A组:来源于体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期中自愿捐献的多余的成熟卵母细胞(MⅡ期),共56个;B组:来源于手术切除的卵巢组织中的未成熟卵母细胞(GV或MⅠ),共67个。不同成熟时期卵母细胞经慢冻快融后培养和体外受精,观察其体外成熟、受精及胚胎发育情况。结果:A组与B组相比,两组冻融后的存活率有显著性差异(60.71%vs 77.61%,P<0.05);A组受精率高于B组,但两组比较无显著性差异(61.76%vs 50.00%,P>0.05);A组与B组相比,两组冻融后的卵裂率和优质胚胎率有显著性差异(76.19%vs 37.50%,47.62%vs 12.50%,P<0.05)。A组获2枚囊胚,而B组没有囊胚培养成功。结论:体外成熟培养技术可能是影响冻融后未成熟卵母细胞发育的关键因素。