角膜干细胞增殖与分化表达实验研究

目的 了解角膜缘干细胞体外生长的增殖分化特性,检测上皮细胞生长因子对干细胞增殖的促进作用。方法 采用ＤＭＥＭ和Ｆ１２培养基进行兔角膜上皮细胞培养,用克隆形成率（ＣＦＥ）、免疫组化染色和蛋白质免疫印迹等方法检测细胞的增殖力和分化表达状况。结果角膜缘干细胞（ＬＣ）在本培养条件下能够正常传代生长５代,ＣＦＥ为（５．０７±２．３５）％,而角膜中央上皮细胞（ＣＣ）仅第１次传代生长,ＣＦＥ为（１．１２±０．８     

角膜上皮干细胞定位特征的免疫组织化学研究

利用单克隆抗体ＡＥ５与分化型角膜上皮细胞中角蛋白Ｋ３特异性结合,研究缺乏分化标志特征的角膜上皮干细胞定位特点,应用免疫组织化学方法显示Ｋ３阳性表达的区域分布于除角膜缘上皮基底部以外所有角膜上皮细胞中,角膜上皮干细胞存在于角膜缘基底部ＡＥ５抗体反应阴性细胞中,即角膜干细胞位于角膜缘上皮层基底部。     

角膜上皮干细胞定位特征的免疫组织化学研究

利用单克隆抗体ＡＥ５与分化型角膜上皮细胞中角蛋白Ｋ３特异性结合,研究缺乏分化标志特征的角膜上皮干细胞定位特点,应用免疫组织化学方法显示Ｋ３阳性表达的区域分布于除角膜缘上皮基底部以外的所有角膜上皮细胞中,角膜上皮干细胞存在于角膜缘基底部ＡＥ５抗体反应阴性细胞中,即角膜干细胞位于角膜缘上皮层基底部。     

角膜缘上皮细胞分化与增殖及细胞周期素表达

目的：探讨角膜缘上皮细胞分化、增殖能力与细胞周期素D1、E、A表达水平的关系。方法：应用消化培养法分别培养人角膜缘及角膜中央上皮细胞,并将角膜缘上皮细胞传至第3代,将角膜中央上皮细胞传至第1代。分别选用抗细胞周期素D1、E、A的抗体,通过免疫组织化学染色检测各代细胞表达细胞周期素D1、E、A的水平。结果：角膜缘上皮原代细胞表达细胞周期素D1、E、A的水平最高,传代培养时细胞周期素的表达水平逐代下降,至第3代已基本上检测不到细胞周期素的表达。角膜中央上皮原代细胞仅极少数表达细胞周期素D1、E、A,传至第1代时已失去表达细胞周期素的能力。各代细胞表达细胞周期素D1、E、A的水平与其增殖能力一致。结论：细胞周期素D1、E、A表达水平的高低可反映角膜缘上皮细胞增殖能力的强弱。高度表达细胞周期素D1、E、A的角膜缘上皮细胞可能就是角膜缘干细胞。细胞周期素可能成为干细胞的一种新的免疫学或生化标记。     

角膜缘上皮细胞分化与增殖及细胞周期素表达

目的:探讨角膜缘上皮细胞分化、增殖能力与细胞周期素D1、E、A表达水平的关系.方法:应用消化培养法分别培养人角膜缘及角膜中央上皮细胞,并将角膜缘上皮细胞传至第3代,将角膜中央上皮细胞传至第1代.分别选用抗细胞周期素D1、E、A的抗体,通过免疫组织化学染色检测各代细胞表达细胞周期素D1、E、A的水平.结果:角膜缘上皮原代细胞表达细胞周期素D1、E、A的水平最高,传代培养时细胞周期素的表达水平逐代下降,至第3代已基本上检测不到细胞周期素的表达.角膜中央上皮原代细胞仅极少数表达细胞周期素D1、E、A,传至第1代时已失去表达细胞周期素的能力.各代细胞表达细胞周期素D1、E、A的水平与其增殖能力一致.结论:细胞周期素D1、E、A表达水平的高低可反映角膜缘上皮细胞增殖能力的强弱.高度表达细胞周期素D1、E、A的角膜缘上皮细胞可能就是角膜缘干细胞.细胞周期素可能成为干细胞的一种新的免疫学或生化标记.     

体外培养不同代角膜缘干细胞特性分析

目的比较不同代角膜缘干细胞的生物学特性,为角膜缘细胞移植在临床中的氉应用提供依据。方法组织块培养法体外培养角膜缘干细胞,光镜观察、HE染色和免疫荧光染色分析原代、第1代和第2代角膜缘细胞形态学特性;流式细胞技术定量检测原代、第1代和第2代角膜缘细胞ABCG2表达;MTT比色法测定体外培养原代、第1代和第2代角膜缘干细胞的增殖活性变化。结果倒置相差显微镜下可见原代细胞培养24h有单个细胞从组织块边缘迁出,48h细胞局部可见拉网样生长趋势,72h出现大片细胞,细胞呈现多边形或多角形,96h细胞几乎铺满整个培养板。随着传代次数的增加,细胞形态变得不规则,CK3单克隆抗体表达阳性率逐渐增强;p63单克隆抗体原代和第1代细胞间表达阳性率无明显差别,第2代细胞表达量明显减弱。流式细胞检测显示原代、第1代和第2代细胞ABCG2表达阳性率分别为13.41%、22.96%和4.43%。MTT结果显示随传代次数增加细胞增殖活性逐渐下降。结论原代和第1代角膜缘干细胞可以作为制备组织工程角膜上皮细胞膜片的较理想种子细胞。     

角膜上皮细胞Pax—6基因表达分析

目的检测体外培养角膜上皮细胞Pax-6基因的表达,探讨维持角膜缘干细胞特性的基因因素.方法地高辛标记cDNA探针进行DNA印迹杂交和蛋白质免疫印迹,检测培养的角膜上皮细胞中Pax-6基因表达状况.结果EcoRⅠ酶切角膜缘上皮细胞中9.1kbp的DNA片断与探针序列相同,其中原位和原代培养细胞、传第l代明显测出,角膜中央上皮细胞的原位和原代细胞中也能测出.Western     

人角膜缘干细胞体外培养后生物学特性的变化

目的 探讨人角膜缘干细胞体外培养后细胞形态学，抗原性和增殖能力的变化。方法 消化培养法体外培养人角膜缘干细胞。获得细胞单层并观察细胞形态学变化。利用间接免疫荧光组化检测人角膜缘组织HLA-DR抗原在培养前，后的变化，检测培养后细胞增殖核抗原和角膜上皮64KD角蛋白的表达。结果 原代细胞在培养1周形成单层细胞形态以圆柱状细胞为主，培养前角膜缘上皮下少星HLA-DR抗原分布，培养后单层细胞DR抗原表达阴性；单层细胞中多量，散在分布的增殖细胞核抗原阳性细胞，并且部分细胞表达64KD角蛋白，结论 角膜缘干细胞体外培养后分化为角膜上皮，不表达HLA-DR抗原，介仍保持较强的分裂增殖能力，可能是临床移植治疗干细胞缺乏眼表疾病患者的一种有效手段。     

碱性成纤维细胞生长因子对人晶状体上皮细胞促增殖作用研究

研究了碱性成纤维细胞生长因子对人晶状体上皮细胞的促增殖作用。方法胎儿晶状体上皮细胞原代与传代培养。第２代培养细胞中添加ｂＦＧＦ，浓度１０＾－３－１０＾３ｎｇ／ｍｌ，用甲基噻唑基四唑测定法观察ｂＦＧＦ对ＨＬＥＣｓ的影响。结论ｂＦＧＦ在后囊混浊发生上起了生要作用。     

角膜缘组织定位培养和冷冻后培养的实验研究

目的验证角膜缘干细胞的组织学定位,探讨低温冷冻保存对其增殖活性的影响。方法取新鲜角膜缘上皮组织和相应部位浅层巩膜组织各10块进行体外细胞培养,对比观察细胞生长情况。取冷冻保存的角膜缘上皮组织14例,观察体外培养后细胞生长情况。通过免疫组化方法检测冷冻保存的角膜缘上皮细胞的增殖活性和培养后单层细胞K3角蛋白的表达。结果10例新鲜角膜缘上皮组织培养后,7例有上皮细胞生长,1周形成细胞单层;10例浅层巩膜组织培养后未见细胞生长。14例冷冻角膜缘上皮组织培养后,4例有上皮细胞生长,9d形成细胞单层。5例冷冻角巩膜环组织冰冻切片中,3例可见角膜缘上皮基底细胞PCNA表达阳性。培养细胞对K3角蛋白特异性的AE-5单克隆抗体免疫反应阳性。结论角膜缘干细胞定位于角膜缘上皮基底部,低温冷冻保存的角膜缘干细胞组织可以保持增殖活性,体外培养后生长分化成为角膜上皮。