兔角膜内皮、上皮及基质细胞体外培养扩增的研究

目的 建立角膜上皮、基质及内皮细胞体外培养扩增的简单稳定的方法，为组织工程化角膜的构建提供种子细胞。方法 内皮细胞与后弹力层在培养基中孵育后消化法获原代细胞，胰酶消化去除表层上皮后取角膜缘，组织块法培养角膜缘上皮细胞，基质细胞应用胶原酶消化法获原代培养，各细胞融合后胰酶消化依次传代培养。结果 原代内皮细胞4—5d融合成单层细胞，可连续传6—7代。上皮细胞1周左右生长融合，连续传3—4代后细胞形态改变。基质细胞接种6—7d后近融合，传代后增殖明显，可连续传10代。结论依据角膜组织特征选择合适的方法体外分离、培养角膜3种细胞成分，可获连续传代扩增的角膜细胞。     

同一猴、兔眼角膜细胞成分原代培养的实验研究

目的建立从同一角膜片上分离培养角膜上皮、基质和内皮细胞的方法,为研究角膜细胞间的相互作用机制奠定基础。方法采用消化法分离培养猴眼角膜内皮细胞、上皮细胞和兔眼角膜上皮细胞．组织块培养法培养基质成纤维细胞和兔角膜内皮细胞。细胞接种于12孔培养板,并于培养不同时间行Wright染色检查细胞生长情况。结果采用消化法和组织块培养法能成功地培养猴、兔角膜上皮、基质和内皮细胞。猴、兔角膜内皮细胞培养1wk后,均能形成内皮细胞单层,细胞类似天然的六角形态．且以猴内皮细胞明显;猴角膜上皮细胞培养3～4d生长旺盛、但难以形成细胞单层,兔上皮细胞生长旺盛,1wk后已达融合状态,细胞呈膜状伸出板层伪足;猴、兔基质成纤维细胞易培养,1wk后已融合成单层细胞,细胞排列整齐,类似纤维走行样外观。结论从同一角膜材料中能分别培养出角膜3种细胞成份,消化法和组织块培养法相结合既能节省材料,又简单易行。     

兔角膜内皮细胞体外原代培养及形态学观察

目的：研究培养兔角膜内皮细胞,为实验提供基础。方法：通过改良的细胞收获,培养技术,在体外进行兔角膜内皮细胞的培养,细胞的类型由电镜证实,观察hEGF不同时间点对角膜内皮细胞生长状态的影响。结果：未加入任何促细胞分裂剂的情况下,细胞在体外生长良好,约一周左右形成密集状态,形态类似天然细胞,经倒置显微镜和电镜证实为角膜内皮细胞。在有hEGF存在时,细胞生长迅速3－4天形成单层,各个时间点EGF组的细胞数高于对照组,结论：该技术可为角膜内皮细胞的研究提供较多的纯内皮细胞。     

改良兔角膜上皮细胞原代培养及纯化的方法

目的 改良原代培养及纯化兔角膜上皮细胞的方法,提高角膜上皮细胞原代培养的成功率.方法 采用全角膜组织培养法培养兔角膜上皮细胞,利用机械刮除和差速贴壁法进行纯化并传代,通过倒置显微镜对细胞进行形态学观察并应用免疫组织化学的方法对细胞进行鉴定.结果 兔全角膜24 h贴壁,48 h后即可见有细胞自角膜缘爬出,5d后细胞大量爬出可见成纤维细胞和角膜上皮细胞共存,界限明显;角膜上皮细胞复层生长.在界限融合前刮除成纤维细胞,角膜上皮细胞继续旺盛生长,10 d后达到融合.兔角膜上皮细胞传至第4代后细胞体积明显变大,传至第5代,细胞衰老、凋亡.兔角膜上皮细胞免疫组织化学显示PCK单克隆抗体阳性.结论 改良原代培养及纯化兔角膜上皮细胞的方法简单、经济、有效,并可获得具有良好生物学特性的角膜上皮细胞,为角膜及角膜疾病的研究奠定实验基础.     

一种培养原代小鼠角膜基质细胞的新方法

目的改良小鼠角膜基质细胞分离培养方法 ,为角膜基质细胞生物学和角膜组织工程等研究提供更好的种子细胞。方法采用Dispase酶消化法联合组织块贴壁法分离、培养原代小鼠角膜基质细胞,倒置显微镜下观察细胞生长情况,通过间接免疫荧光化学染色Vimentin表型和RT-PCR检测Vimentin、Lumican和CK12基因表达对培养的细胞进行鉴别。结果倒置显微镜下可见小鼠角膜基质细胞呈三角形和树枝状,细胞间连接明显,可形成网状连接;免疫荧光化学鉴定小鼠角膜基质细胞表达Vimentin阳性;RT-PCR显示Vimentin和Lumican基因表达阳性,CK12表达阴性。结论 Dispase酶消化法联合组织块贴壁法培养可获得具有角膜基质细胞特性的细胞,本方法为体外获得单纯小鼠角膜基质细胞提供了简单高效的途径。     

兔角膜上皮和基质细胞共同培养模型中的相互作用

目的探讨利用细胞生物学和工程学原理在体外培养角膜上皮和基质细胞,模拟上皮和基质细胞相互作用的生存环境,了解角膜上皮细胞和基质细胞间的作用规律。方法分别进行体外兔角膜上皮细胞和基质细胞的原代培养及传代的二维平面培养,利用特殊培养装置制作上皮细胞和基质细胞共同培养的模型,达到两种细胞胞体不混合,而其分泌的成分可以相互渗透、相互作用的目的,从而更好地观察各自细胞的生长状态。描绘角膜上皮细胞和基质细胞的生长曲线及二者在相互作用模型中的生长曲线。利用激光共聚焦显微镜观察上皮细胞和基质细胞在单独培养和三维共同培养模型中上皮细胞胞间通讯的变化特点。结果角膜上皮细胞倍增时间为3．45d,共同培养的上皮细胞倍增时间为3．30d,角膜基质细胞倍增时间为2．11d,共同培养的基质细胞倍增时间为2．32d,共同培养的上皮细胞增长与单独培养的上皮细胞相比,差异有统计学意义（P〈0．01）,共同培养的基质细胞增长与单独培养的基质细胞相比,差异有统计学意义（P〈0．01）。与角膜基质细胞共同培养的角膜上皮细胞胞间通讯明显高于单独培养的基质细胞,差异有统计学意义（U=2．691,P〈0．05）。结论共同培养的细胞模型是理想的。角膜上皮细胞在与基质细胞共同存在的条件下比单独培养下的增殖能力增强,而角膜基质细胞在与上皮细胞共同存在的条件下比单独培养的增殖能力减弱;而上皮细胞在与基质细胞共同存在的条件下,细胞间通讯增强。     

人胚肺成纤维细胞饲养兔角膜上皮和内皮细胞的体外培养

目的 研究人胚肺成纤维饲细胞体外培养兔角膜上皮和内皮细胞。方法 人胚肺成纤维细胞系细胞。经丝裂霉素C处理成饲细胞,兔角膜上皮和内皮细胞组织块原代培养,消化接种于人胚肺饲细胞瓶传代培养,体外培养的角膜上皮和内皮细胞行常规病理形态学检查。角膜上皮细胞行角蛋白,内皮细胞行神经烯醇化酶免疫组化染色检测。结果 人胚肺成纤维细胞形态均一。易于分辨,经丝裂霉素处理后推动增殖能力。角膜上皮和内皮细胞原代培养5-7天。细胞密集,经人胚肺饲细胞共培养5代。细胞无衰老现象,检测角膜上皮细胞角蛋白,内皮细胞神经烯醇化酶表达阳性,人胚肺饲细胞表达阴性。结论 人胚肺饲细胞能够明显增强角膜上皮和内皮细胞的体外生存能力。提高细胞的增殖能力。     

房水对培养的角膜基质细胞的影响

目的观察房水对角膜基质细胞生长的作用。方法将新西兰大白兔的角膜去除后弹力层、内皮层和上皮层后,得到基质层,用组织块培养法体外培养角膜基质细胞。在实验组的培养基中加入10％房水,对照组使用常规培养基培养。通过CCK8实验测得角膜基质细胞的吸光度（A）值以分析细胞增生的情况。分别在培养基中加入2．5％、5％、10％、15％、20％的房水,用明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶（MMPs）的活性。结果倒置显微镜观察可见培养的角膜基质细胞呈多角形或树枝状,与对照组相比,实验组的细胞生长状态良好,培养的角膜基质细胞数量明显增加。明胶酶谱法显示实验组的条带比对照组清晰。实验第1～5天分别测角膜基质细胞的A值,实验组的检测条带明显强于对照组,〉10％的房水培养组检测的条带明显强于2．5％、5％房水培养组。CCK8检测表明,培养1～5d实验组的角膜基质细胞A值明显高于对照组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论房水作用于角膜基质细胞后,可促进角膜基质细胞的生长,10％房水对体外培养角膜细胞有促细胞增生的作用。     

体外培养兔角膜内皮细胞电生理特性的初步研究

目的通过测定体外培养兔角膜内皮细胞(rabbitcorneal endothelial cells,RCECs)静息电位及全细胞电流,初步研究角膜内皮细胞的电生理特性。方法采用后弹力层及内皮层揭取联合组织块法进行RCECs体外培养,采用膜片钳全细胞记录模式记录原代及传代RCECs细胞静息电位及全细胞电流,绘制电流-电压(I/V)曲线。结果体外培养原代RCECs的平均静息膜电位水平为(20.9±1.7)mV(n=6),第2代RCECs的平均静息膜电位水平为(15.1±1.8)mV(n=6),两者差异有统计学意义(P<0.01)。在钳制电位+60mV下,原代RCECs全细胞电流为(396.2±39.0)pA(n=5),大于第2代RCECs的全细胞电流(201.4±45.2)pA(n=5),差异有非常显著的统计学意义(P<0.01)。结论后弹力层及内皮层揭取联合组织块法获得的原代及传代RCECs,在静息电位和全细胞电流等电生理特性方面存在差异。     

Strabisme Alternant - Etude clinique - traitement

The author defines motor and sensory alternation: the term alternation should not be used in isolation, it should always be accompanied by the name of the parameter concerned. Sensory alternation is always found together with motor alternation but the reverse is not true.The examining criteria for a diagnosis of sensory alternation are given, sensory alternation must not be confused with alternating inhibition. Working from clinical observations of cases of motor alternating strabismus, the author selects 2 types of binocular sensory relations which allow one to differentiate between:- cases of primary alternating strabismus- cases of secondary alternating strabismusThese forms will develop in different ways; in both cases a cure is possible providing that the right treatment is prescribed and once prescribed carefully followed, etc. It is always a case of serious forms of strabismus whose developmental period is spread over several years.According to the authors, the frequency of cases of true primary strabismus is from 1–3%, the frequency of cases of secondary alternating strabismus varies according to the type of therapy practised on cases of monocular strabismus with amblyopia. These latter will become cases of alternating strabismus under the influence of certain types of therapy carried out over several years (penalization, rocking, alternated occlusion, etc...).Experimental data on kittens confirm clinical data; kittens placed in abnormal environments during the sensitive period will show modification in the distribution of cortical cells and the absence of binocular cells (either because the excitation of the two eyes was not simultaneous, or not identical: artificial strabismus, occlusion, opaque glasses). This disturbances become irreversible after a certain period of exposure (a function of age, length of exposure, etc...).It is thus necessary to bear in mind: 1) the iatrogenic risks of certain orthoptic treatments, 2) the necessity for a binocular form of treatment as soon as possible, as once a certain stage is passed, cortical plasticity diminishes and the elaboration of normal binocular relations becomes impossible.

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Guía de estilos de vida y glaucoma (II). Dieta,suplementos, drogas,sueño,embarazo e hipertensión arterial

Purpose

To establish evidence based guidelines to advise patients on the relationship between habits, diet, certain circumstances, diseases and glaucoma.