骨髓间充质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶基因表达含量的变化

目的:提取鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行成骨诱导并对BMSCs成骨分化过程中碱性磷酸酶(ALP)的表达量进行定量监测,揭示BMSCs在成骨分化过程中活性的变化。方法:采用全骨髓贴壁法提取鼠BMSCs,培育、扩增至第3代时,以地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C为主要成分配制诱导培养基进行成骨诱导3周。在成骨诱导过程中,通过实时荧光定量(qRT-PCR)探针法对目标细胞的ALP表达量进行实时监测。结果:成骨诱导BMSCs,经显微镜观察、ALP染色、矿化结节染色等检测方法证实诱导成功。qRT-PCR实时检测的ALP表达量在1周后快速上升并维持1周的高值,2周后快速下降至初始值。结论:采用全骨髓贴壁法提取、培养的BMSCs,利用经典的成骨诱导方法可分化为成骨细胞。成骨分化过程中,目标细胞的成骨活性1周后开始快速增强,并可在高水平维持1周,2周后活性开始下降。     

骨髓间充质干细胞复合表面改性的3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚酯膜的体外相容性

目的: 研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在不同处理工艺的3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚酯(PHBHHx)膜材料上的生长、增殖情况,为组织工程学筛选出一种新型的适合细胞生长、增殖的生物材料.方法: 用全骨髓培养法获得BMSCs,并行免疫荧光鉴定,同时在成骨诱导液中诱导BMSCs,钙钴法检测碱性磷酸酶(ALP),茜素红矿化结节染色;成脂诱导后行油红O染色.将不同处理工艺的材料与第3代BMSCs复合培养1、 3、 7d,通过扫描电镜、MTT法和中性红染色法分别观察细胞的形态、增殖变化及分布情况.结果: BMSCs免疫荧光鉴定CD44、 CD106均呈阳性.经成骨诱导后,ALP呈阳性表达,矿化结节染色呈橘红色;经成脂诱导后,14d油红O染色呈阳性.细胞在经过碱处理或添加5%、 10%中药涂层的PHBHHx膜材料表面均生长状态良好,增殖活力强且分布均匀.结论: 经过碱处理的,且含5%、 10%中药涂层的PHBHHx膜,具有良好的BMSCs相容性,可以作为一种新型的生物材料应用于组织工程.     

骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化

背景：骨碎补促进骨损伤愈合疗效确切,但具体作用机制尚不清楚。 目的：观察骨碎补总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。 方法：冲洗兔股骨和胫骨骨髓腔获取骨髓,采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增兔骨髓间充质干细胞;以四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度骨碎总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响;经骨碎补总黄酮体外诱导后,行扫描电镜形态学观察,碱性磷酸酶染色、茜素红染色和Von Kossa银染色了解细胞钙化情况。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞可以通过密度梯度离心法联合贴壁培养法扩增和纯化;含骨碎补总黄酮血清培养后,四甲基偶氮唑蓝测定结果显示,骨碎补总黄酮浓度为10-6 mmol/L时可明显促进兔骨髓间充质干细胞增殖。经骨碎补总黄酮诱导液诱导,扫描电镜下可见成骨细胞样形态和钙结节形成;细胞碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色和Von Kossa银染色均呈阳性,提示骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化。     

Shh在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用

 目的：研究Sonic Hedgehog（Shh）在雷奈酸锶（strontium ranelate,Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞分化中的作用。方法：采用全骨髓贴壁培养法分离、纯化、培养大鼠BMSCs,取第3~5代BMSCs加入成骨诱导液诱导成骨分化,再加入不同浓度Sr及Shh拮抗剂cyclopamine（Cy）,分别观察它们对BMSCs向成骨细胞分化的影响。酶标法检测成骨细胞分化早期标志物碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性;茜素红染色检测细胞钙化水平;Western blotting法检测Shh和Runx2蛋白的表达情况。结果：Sr（3 mmol/L）可以使细胞ALP活性增高,钙结节形成增加。Sr（0.1～5 mmol/L）作用BMSCs 7 d,可明显促进Shh和Runx2蛋白的表达,且Shh蛋白在1 mmol/L Sr作用时表达最多,而Runx2在3 mmol/L Sr作用时表达最多。1 mmol/L Sr作用BMSCs不同时间（1、3、5、7 d）,呈时间依赖性地上调Shh和Runx2蛋白的表达。Cy（10 μmol/L）不仅拮抗Sr对Shh和Runx2表达的上调作用,还抑制Sr对ALP和钙结节形成的促进作用。结论：Sr可通过上调Shh蛋白及成骨特异性转录因子Runx2的表达促进BMSCs向成骨细胞分化。     

雷奈酸锶通过上调骨形态发生蛋白2的表达促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞

目的: 探讨雷奈酸锶(strontium ranelate,Sr)是否可以通过上调骨形态发生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)的表达而促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为成骨细胞。方法: 对大鼠BMSCs进行分离、纯化、培养及向成骨细胞的定向诱导分化,并在诱导培养时,根据实验目的加入不同浓度Sr以及BMP-2的拮抗剂noggin。用酶标法检测成骨细胞分化和功能成熟的早期标志物——碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化,用茜素红染色检测细胞钙化水平,用Western blotting法检测BMP-2蛋白的表达水平。结果: 应用0.1~7 mmol/L Sr处理细胞7 d均可使细胞ALP活性显著增加,其中浓度为3 mmol/L时效果最显著;应用3 mmol/L Sr处理细胞21 d可使细胞钙化结节明显增多;应用0.1~7 mmol/L Sr处理细胞7 d后细胞内BMP-2蛋白水平明显增高;在Sr处理BMSCs前,应用BMP-2拮抗剂noggin预处理细胞2 h不仅抑制Sr对BMP-2表达的上调作用,还拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论: 上调BMP-2的表达可能是Sr促进大鼠BMSCs分化为成骨细胞的作用机制之一。     

梓醇促大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化的机制研究

目的:探讨梓醇促SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)骨向分化的作用机制。方法:(1)细胞分为对照组、成骨诱导组及梓醇组。4-氨基安替吡啉测酚法检测诱导第7、14和21天各组细胞上清碱性磷酸酶(ALP)活性,ALP染色法检测诱导第14天各组细胞ALP阳性染色率,茜素红染色法检测诱导第21天各组细胞矿化结节数;(2)运用real-time PCR法检测诱导第7、14和21天各组细胞中Runx2、骨钙素(osteocalcin)、β-连环蛋白(β-catenin)、Wnt3a、Wnt5a及Wnt11的mRNA表达水平。结果:(1)2.0 mg/L梓醇可增加BMSCs上清中ALP活性及细胞ALP的阳性染色率,同时促进BMSCs矿化结节的形成(P0.05)。(2)梓醇促BMSCs骨向分化时,Runx2的mRNA表达水平于第14天时达到峰值,随后开始下降,第21天时与对照组无统计学差异;osteocalcin的mRNA相对表达量在第7天时高于对照组,随后持续上升直至第21天。(3)与对照组相比,梓醇促BMSCs骨向分化时,β-catenin与Wnt3a的mRNA相对表达量均于第14和21天时升高并维持在较高水平,而Wnt5a及Wnt11的mRNA相对表达量在第14天达到峰值后开始下降,第21天时Wnt11 mRNA相对表达量显著低于对照组。结论:梓醇通过上调Runx2的表达,促使BMSCs向成骨细胞方向分化,同时还通过增加细胞ALP分泌及osteocalcin的表达,促进细胞矿化的发生,从而促使新生成骨细胞的成熟,此作用可能与其有序激活Wnt信号通路相关。     

rhBMP-7对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的:观察重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的影响。方法:采用密度梯度离心法分离骨髓,体外培养扩增,获得小鼠骨髓间充质干细胞,贴壁培养至第3代,向培养液中加入rhBMP-7,培养5 d后进行碱性磷酸酶(ALP)染色,ALP活性与骨钙素(OC)含量检测,并用RT-PCR法分析成骨细胞标志基因骨钙素(OC)与Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)表达情况,Western blot法检测Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)蛋白的分泌量。结果:rhBMP-7诱导组的骨髓间充质干细胞的ALP染色强度、ALP活性及OC含量明显升高,OC与Col-Ⅰ的mRNA表达水平以及Col-Ⅰ的蛋白表达水平均明显提高。结论:rhBMP-7可促进体外培养的小鼠BMSCs向成骨细胞方向分化。     

Hedgehog/Gli1通路在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用

目的:探讨Hedgehog/Gli1信号通路在雷奈酸锶(strontium ranelate,Sr)促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化中的作用。方法:体外分离培养大鼠BMSCs,诱导其成骨分化,根据实验目的加入不同浓度的Sr、Hedgehog受体拮抗剂cyclopamine(Cy)及Gli1小干扰RNA(Gli1-siRNA)。用Western blotting法检测Gli1及Runx2的表达,酶标法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色法检测钙结节水平。结果:应用不同浓度的Sr(0.1~5 mmol/L)处理BMSCs细胞7 d后,细胞内Gli1蛋白表达增高,Sr的浓度为3 mmol/L时,Gli1表达达到高峰;使用Cy与Sr共处理BMSCs 7 d,能拮抗Sr对Gli1蛋白表达的上调作用;应用Gli1-siRNA转染细胞后,能下调Gli1蛋白的表达,并抑制Sr对Gli1下游Runx2蛋白表达的上调作用,还可拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论:Hedgehog/Gli1通路参与了Sr促进骨髓间充质干细胞向成骨分化的过程。     

梓醇调控Hedgehog信号通路促进BMSCs向成骨分化的实验研究

目的观察梓醇对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化的影响,并从Hedgehog信号角度探讨其可能的作用机制。方法体外分离培养BMSCs,并通过流式细胞仪对细胞加以鉴定。pNPP法筛选梓醇最佳促BMSCs骨向分化的浓度,以最佳梓醇浓度干预BMSCs的成骨性分化。后续实验分4组:对照组、梓醇组、经典组和联合组(梓醇组+经典组)。酶标法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色法检测矿化结节数目,QPCR法检测Shh mRNA、Ihh m RNA水平,Western blot法检测Ptch1、Smo及Gli1蛋白的表达。结果梓醇促BMSCs骨向分化的最佳浓度为1×10-4mol/L;与对照组比较,梓醇组的ALP活性显著增强,矿化结节数目显著升高,Shh mRNA水平显著上升,Ptch1、Smo及Gli1蛋白表达均显著升高(P0.05);与经典组比较,梓醇组的ALP活性、矿化结节数目、Shh m RNA水平、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达均低于经典组(P0.05);各组中Ihh mRNA水平无明显变化。结论梓醇能够促进BMSC向成骨分化,可能与上调Hedgehog信号传导通路相关分子有关。     

SD乳鼠骨髓间充质干细胞体外改良筛选法培养及鉴定

目的评估应用SD乳鼠骨髓的改良筛选法分离培养骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)的可行性及优势,探讨一种简单高效的BMSCs体外分离、纯化及扩增的方法。方法选择7d龄SD大鼠6只,无菌解剖大鼠双侧股骨,于完全培养基浸泡、剪碎,反复吹打暴露骨髓腔,高速震荡3min后取上清液接种于培养瓶中,24h后半量换液,48h后全量换液,以后隔天换液。应用CCK-8法测定生长曲线;成骨分化诱导3周后进行茜素红染色,成脂分化诱导4周后进行油红“O”染色;应用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原。结果原代培养的BMSCs细胞生长曲线呈“S”形,接种1d后有少量细胞贴壁,第3~6天为对数增殖期,第7天进入平台期。BMSCs经成骨诱导3周后茜素红染色细胞外基质中可见深红色团块状矿化结节;经成脂肪诱导4周后胞浆内充满“串珠状”红色脂滴。流式细胞仪检测BMSCs表面抗原CD29、CD44、CD90阳性,CD34和CD45阴性。结论应用7d龄SD乳鼠的改良全骨髓自然贴壁筛选法可以高效分离纯化出BMSCs。     

羌活鱼研粉物、水提及酸提物含药血清对骨髓间充质干细胞增殖及向成骨分化的影响

背景：羌活鱼经大量的临床观察和报道有促进骨折愈合的作用,其具体的作用机制及其有效成分的研究报道尚少。 目的：分析羌活鱼研粉物、水提及酸提物含药血清对体外培养骨髓间充质干细胞增殖与成骨性分化的影响。 方法：制备羌活鱼研粉、水提物、酸提物,分别采用高、中、低剂量灌服大鼠制得羌活鱼研粉物、水提及酸提物含药血清,以灌服等体积生理盐水制得对照血清;采用贴壁筛选法培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过MTT法检测细胞增殖;于干预后的不同时间点分别测定细胞碱性磷酸酶活性、钙盐沉积量、成骨性分化基因表达以及钙化结节数、并比较各组间差异。 结果与结论：羌活鱼研粉物及水提物含药血清具有刺激骨髓间充质干细胞增殖活性及促进其成骨性分化的能力,其中尤其以研粉物中剂量组最为明显,而酸提物含药血清并无此功效。主要表现在细胞增殖、碱性磷酸酶活性、钙盐沉积量、成骨性分化基因和钙化结节数显著高于空白对照组(P < 0.05)。     

microRNA-25-3p suppresses osteogenic differentiation of BMSCs in patients with osteoporosis by targeting ITGB3

This study was conducted to investigate the impact of the microRNA (miR)-25–3p/ITGB3 axis on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) from patients with osteoporosis (OP). BMSCs isolated from the bone marrow of healthy controls and OP patients were identified by flow cytometry, in which ITGB3 mRNA and miR-25–3p expression was detected by RT-qPCR and ITGB3, Runx2, OPN, ALP, and OSX protein expression by western blot. The binding between ITGB3 and miR-25–3p was assessed by dual-luciferase reporter gene and Ago2-RIP assays. BMSC osteogenic differentiation was observed by alizarin red staining and ALP activity. The differentiation of BMSCs to adipocytes and chondrocytes was measured by oil red O staining and alcian blue staining, respectively. BMSCs were successfully isolated from the bone marrow of healthy controls (normal-BMSCs) and OP patients (OP-BMSCs). ITGB3, Runx2, OPN, ALP, and OSX expression was poorer and miR-25–3p expression was higher in OP-BMSCs than in normal-BMSCs. Mechanistically, ITGB3 was negatively targeted by miR-25–3p. After osteogenic, adipogenic, and chondrogenic differentiation of BMSCs were successfully induced, adipogenic differentiation increased and osteogenic and chondrogenic differentiation decreased in OP-BMSCs compared with normal-BMSCs. Overexpression of ITGB3 facilitated mineralized nodule formation and elevated ALP activity and Runx2, OPN, and ALP expression in OP-BMSCs. miR-25–3p upregulation diminished mineralized nodule formation, ALP activity, and Runx2, OPN, and ALP expression in OP-BMSCs and normal-BMSCs, which was annulled by additional ITGB3 overexpression. miR-25–3p targets ITGB3, thereby suppressing osteogenic differentiation of BMSCs from OP patients.     

骨髓间充质干细胞复合羟基磷灰石/磷酸三钙植骨材料的体外研究

目的研究兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)在羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)植骨材料上的黏附增殖情况。方法抽取兔股骨骨髓,进行贴壁培养BMSCs。在成骨诱导液中诱导BMSCs,于7d用钙钴法检测碱性磷酸酶活性,10d进行茜素红矿化结节染色;在成脂诱导液中诱导BMSCs,于21d进行油红O染色。将BMSCs接种到HA/TCP植骨材料上,加入成骨诱导液,采用倒置显微镜、荧光显微镜及扫描电镜检测,并采用四氮唑蓝(MTT)比色法测定HA/TCP植骨材料上BMSCs的增殖情况。结果BMSCs在成骨诱导液中7d碱性磷酸酶呈强阳性,10d矿化结节染色呈橘红色;在成脂诱导液中,21d油红O染色呈阳性。BMSCs在HA/TCP植骨材料上孔隙周围及孔隙内生长良好并大量增殖。MTT分析结果显示,HA/TCP对BMSCs的体外增殖无抑制作用。结论BMSCs与HA/TCP植骨材料有良好的生物相容性。     

雷奈酸锶通过TGF-β1/Smad通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

 [摘 要] 目的:研究转化生长因子β1（TGF-β1）/Smad通路在雷奈酸锶（strontium ranelate,Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞分化中的作用。方法: 在大鼠BMSCs向成骨细胞的诱导分化过程中,用Sr处理细胞,用Western blotting法检测磷酸化Smad2（phosphorylated Smad2,p-Smad2）和Runx2的表达。用TGF-β1特异性阻断剂SB431542或Smad2小干扰RNA（Smad2-siRNA）预处理BMSCs后加入Sr,再观察p-Smad2和Runx2表达的改变。应用试剂盒检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性及钙结节水平。结果: 在大鼠BMSCs向成骨细胞的诱导分化过程中,Sr可增加p-Smad2和Runx2的表达,Sr 浓度为1 mmol/L、作用1 h时,p-Smad2表达最多;Sr 浓度为1 mmol/L、作用5 d时,Runx2表达最多;用SB431542或Smad2-siRNA预处理BMSCs后再加入Sr,不仅可以抑制p-Smad2和Runx2的表达,且ALP活性与钙结节数量也受到明显的抑制。结论: Sr可通过TGF-β1/Smad通路促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化。     

左、右归丸及其拆方对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

 目的： 研究左、右归丸及其拆方含药血清对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化的作用。方法：分别以左归丸、右归丸、两方共同药、滋肾阴药、补肾阳药、阳性对照药补佳乐和蒸馏水制备的大鼠含药血清加诱导剂（地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠）干预BMSCs,并以不含诱导剂的空白含药血清组为对照,共8组,采用改良钙钴法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,茜素红法观察矿化结节的形成,并用real-time RT-PCR法检测核心结合因子α1（core binding factor alpha 1,Cbfα1）和Ⅰ型胶原（typeⅠcollagen,ColⅠ）mRNA表达,用Western blotting法检测Cbfα1和ColⅠ蛋白表达。结果：左、右归丸及其拆方与阳性对照药补佳乐均可协同诱导剂诱导BMSCs成骨分化,其中,左归丸和滋肾阴药可显著促进ALP生成和矿化结节形成,上调Cbfα1和ColⅠ mRNA及蛋白表达（P＜0.05）。结论：左、右归丸及其拆方含药血清能协同诱导剂促进BMSCs成骨分化,左归丸和滋肾阴药促进BMSCs成骨分化的作用优于右归丸和补肾阳药。     

补肾中药有效成分对大鼠骨损伤愈合及血液流变学的影响

背景：补肾中药为骨伤科常用药,但对不同有效成分用于骨愈合的比较研究尚缺乏。 目的：观察不同补肾中药有效成分对骨损伤大鼠骨愈合及血液流变学的影响。 方法：建立大鼠股骨干骨折模型并分别用提取的骨碎补总黄酮、淫羊藿总黄酮、菟丝子总黄酮、柚皮甙、槲皮素,以及橙皮甙对造模大鼠进行灌胃治疗。21 d后取血及骨标本,检测大鼠骨愈合程度和血液流变学指标。 结果与结论：不同补肾中药有效成分均对骨愈合有益,且骨碎补总黄酮、淫羊藿总黄酮效果优于其他4种药物。骨碎补总黄酮和淫羊藿总黄酮可有效抑制低剪切速下大鼠的血液黏度,降低红细胞聚集指数及血小板聚集性和黏附性(P < 0.05),但对红细胞变形性无显著作用。说明补肾中药有效成分可促进骨损伤的愈合,且对血液流变学有一定作用,以骨碎补总黄酮效果最佳。