Tubulin和HSP90在氧化应激预适应中的作用

目的：探讨热休克蛋白90和细胞骨架蛋白tubulin在氧化应激预适应中的作用。方法:应用不同浓度H2O2作用于HepG2细胞,建立HSP90不同表达量的模型后,MTT比色法检测细胞活力,Western blotting 定量检测各模型中HSP90、tubulin量,激光扫描共聚焦显微镜测定该两种蛋白在对照、预适应、氧化应激、预适应后氧化应激下的分布和共定位。 结果:MTT比色法结果提示预适应可提高应激状态下的细胞生存活力;Western blotting结果显示氧化应激预适应可提高细胞内HSP90 和 tubulin含量,减轻再次应激所致的HSP90 和 tubulin总量下降;激光共聚焦显示该两种蛋白有相似的细胞分布。结论:Tubulin可能协同HSP90在氧化应激预适应中起保护作用。     

姜黄素抑制STAT3磷酸化对乳腺癌细胞增殖及Hsp90α表达的影响

目的探讨姜黄素对乳腺癌细胞增殖和Hsp90α表达的影响及其可能机制。方法以乳腺癌细胞株MCF-7为材料,分别用不同浓度的姜黄素(0、5、10、15、20μmol/L)处理细胞36 h,或以10μmol/L姜黄素分别处理细胞12、24、36、48 h,用MTT法检测细胞生长抑制率,分别采用实时定量PCR和Western blot法检测Hsp90αmRNA、Hsp90α及磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的表达。结果姜黄素处理MCF-7细胞后,总STAT3蛋白的表达无明显差异,p-STAT3表达明显下调;同时,姜黄素处理组MCF-7细胞代谢MTT的能力降低,细胞生长的抑制率明显上升,Hsp90αmRNA和蛋白质的表达下调,且该效应呈浓度和时间依赖性(P0.05)。结论姜黄素可能通过STAT3信号途径,调控Hsp90α的表达,进而干预乳腺癌细胞的增殖。     

野生型p53对热休克蛋白90β基因表达的调控作用

为了阐明野生型Ｐ５３在热休克蛋白９０β（ｈｓｐ９０β）基因表达调控中的作用，我们利用野生型Ｐ５３的表达质粒转染Ｊｕｒｋａｔ细胞，发现野生型Ｐ５３可以剂量依赖方式抑制ｈｓｐ９０β基因的启动子活性，证实ｈｓｐ９０β基因的表达在ＭＲＮＡ和蛋白水平无明显减少。     

HSP90高表达细胞株的建立及细胞应激反应的改变

目的: 建立稳定高表达热休克蛋白90(HSP90)细胞株,研究HSP90高表达对细胞应激反应的影响。方法: 含人HSP90β全长基因的重组质粒pSmycHSP经克隆、纯化、酶切鉴定后,用电穿孔法转染到小鼠成纤维细胞系NIH-3T3细胞内。经G418筛选、克隆分离培养,用免疫荧光、免疫印迹鉴定阳性克隆。用高温作用(44 ℃,20 min、40 min)模拟氧化应激环境,以转染空质粒的NIH-3T3细胞为对照,全自动生化分析仪观测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出活性变化、流式细胞仪测定DNA受损细胞数,分析细胞应激状态对细胞膜和DNA的损害及HSP90高表达对细胞应激反应的影响。结果: 转染pSmycHSP的NIH-3T3细胞HSP90免疫荧光染色增强;与对照相比,44 ℃,20 min时培养液中漏出的LDH无显著差别,DNA损害加重;44 ℃,40 min时LDH漏出减少,DNA的损害减弱。结论: 已建立稳定高表达HSP90 NIH-3T3细胞株;HSP90高表达在不同的应激强度下对细胞的影响呈现复杂性,其应激保护作用与应激强度密切相关。     

热休克蛋白90α(HSP90α)在大肠杆菌中的表达

目的 :探讨热休克蛋白 90α的生物学功能 ,获得高质量及充足的HSP90α蛋白。方法 :采用PCR的方法扩增HSP90αcDNA5’端 42 4bp片段 ,在起始密码子位置制造一个NcoI酶切位点 ,将PCR产物克隆到中间载体 ,再通过合适的酶切位点将其余片段连接到此载体 ,形成一个带有NcoI突变位点的HSP90αcDNA全长克隆。最终将HSP90α全部编码cDNA插入到pET 16b表达载体中。结果 :经诱导表达 ,SDS PAGE凝胶电泳分离显示在分子量大约 83kD处有一诱导蛋白带。WesternBlot证明表达产物与抗HSP90α抗血清有特异的免疫反应。结论 :构建成了T7启动子控制下的HSP90α表达质粒。     

HSP90以及IL-6在系统型红斑狼疮发病中的作用

目的研究系统型红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中热休克蛋白90(HSP90)、血清中白细胞介素6(IL6)的水平,探讨与活动期SLE的相关性。方法应用Western印迹检测20例SLE活动期患者(A组)与20例正常人(B组)PBMC中HSP90的表达,并利用酶联免疫法(ELISA)检测其血清中IL6水平。结果①A组HSP90表达水平为0.47±0.05,B组为0.18±0.07,差异有统计学意义(P<0.01);②血清中IL6水平在A组[(32.97±8.65)pg/ml]显著高于B组[(10.46±4.33)pg/ml](P<0.05);③A组血清中IL6水平与PBMC中HSP90表达呈正相关(r=0.61,P<0.01),且与SLE疾病活动指数(SLEDAI)正相关(r=0.48,P<0.01)。结论IL6可作为病情活动监测指标,IL6与HSP90的异常高表达可能在SLE发病机制中起重要作用。     

热休克蛋白在人乳腺癌中的作用

目的探讨不同类型和亚型热休克蛋白（Ｈｓｐｓ）在人乳腺癌增殖、分化中的作用及意义。方法应用免疫组织化学ＳＰ法、电镜、原位杂交和ＲＴ－ＰＣＲ法对１１５例浸润性导管癌Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、泛素（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）进行观察。结果Ｈｓｐ９０ｍＲＮＡ在癌组织较非癌组织中的表达显著增强。此外，癌组织中的Ｈｓｐ９０αｍＲＮＡ表达水平与增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）指数密切相关。提示Ｈｓｐ９０α同功异构体表达增加在细胞增殖过程中起一定作用。另外，在分化差的癌组织中也有Ｈｓｐ９０βｍＲＮＡ表达。Ｈｓｐ７０和泛素在细胞中的分布部位一致。在Ｈｓｐ７０核内染色阳性的标本中，ＰＣＮＡ指数显著增加。Ｈｓｐ７０家族中的Ｈｓｐ７３ｍＲＮＡ在ＰＣＮＡ高表达的癌组织比非癌组织有较高水平的表达。结论本研究显示：Ｈｓｐ９０α在癌细胞增殖中起重要作用，而Ｈｓｐ９０β与细胞分化和结构构建有关。此外，Ｈｓｐ７０家族中，尤其是与泛素有关的Ｈｓｐ７３可能是癌细胞增殖的一个指标。     

Ubiquitin B在HSP90抑制剂17-AAG诱导人宫颈癌HeLa细胞周期阻滞中的作用

目的 研究Ubiquitin B(Ubb)在热休克蛋白90(HSP90)抑制剂17-AAG诱导人宫颈癌HeLa细胞周期阻滞中的作用及机制.方法 不同浓度17-AAG处理HeLa细胞后,流式细胞术检测细胞周期分布,荧光分光光度法检测细胞蛋白酶体活性变化;Ubb siRNA 转染HeLa细胞后,Real Time PCR法检测Ubb干扰效应,Western 印迹检测细胞周期相关蛋白的表达改变.结果 17-AAG可以诱导HeLa细胞阻滞于G2/M期,同时显著增强细胞内糜蛋白酶样蛋白酶体活性,并且两者的变化均呈现剂量依赖性;干扰HeLa细胞内Ubb后,可以逆转17-AAG引起的G2/M期阻滞;17-AAG可明显下调HeLa细胞周期相关蛋白Cdk1和Hec1的表达,并且这一变化也是Ubb依赖的.结论 Ubb在17-AAG诱导的HeLa细胞周期阻滞中发挥重要作用,Ubb和HSP90抑制剂17-AAG在功能上相互关联,可能成为宫颈癌治疗的新靶点.     

原发性肾病综合征中HSP90与糖皮质激素抵抗关系的研究

目的：观察原发性肾病综合征（INS）患者外周血单个核细胞（PBMC）内热休克蛋白90（HSP90）的表达、分布及其与糖皮质激素受体（GR）之间的关系，以揭示HSP90在INS发病、糖皮质激索抵抗及治疗效应中的作用本质。方法：采用RT-PCR和激光共聚焦免疫荧光技术，分别检测PBMC中HSP90、GR的mRNA表达水平及HSP90的亚细胞分布状况。结果：发现INS患者与健康对照者PBMC中的GR表达无明显差异（P〉0．05）；HSP90的表达较健康对照组明显增高，并且激素抵抗组INS患者HSP90mRNA表达显著高于激素敏感组INS患者（P〈0．05）。INS患者的HSP90／GR比值明显高于健康对照组（P〈0．05）。HSP90亚细胞分布研究发现，健康对照组的HSP90主要分布在PBMC的胞浆中，核内含量极微；INS患者增加的HSP90则明显趋向细胞核内分布（P〈0．001）。结论：HSP90的异常表达及亚细胞分布变化可能是导致内源性、外源性糖皮质激素抵抗的重要机制，其一方面通过影响糖皮质激素对免疫系统的自身反馈调节，参与INS发病；另一方面则可能干预患者对外源性激素的治疗反应，影响临床疗效。     

HSP90依赖的Akt线粒体转位参与IGF-1对低温保存心脏的保护作用

目的: 观察胰岛素样生长因子1(IGF-1)是否可对抗低温保存诱导的心肌损伤,并探讨其可能的机制。方法: 观察SD大鼠心脏低温保存9 h后,再灌注期左心室发展压(LVDP)和细胞凋亡指数的变化。Western blotting法检测蛋白激酶B(Akt)蛋白表达。结果: (1)Celsior保存液中加入10 nmol/L IGF-1可促进低温保存9 h后心脏收缩功能的恢复、减少心肌细胞凋亡的发生、抑制线粒体渗透性转换孔开放。(2)IGF-1可上调心脏Akt蛋白磷酸化水平。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002不仅可降低IGF-1诱导的Akt磷酸化水平,且可逆转IGF-1促进低温保存心脏心功能的恢复和抗凋亡作用。(3)抑制热休克蛋白90(HSP90)可降低IGF-1诱导的Akt磷酸化和线粒体转位,阻断IGF-1的心肌保护作用。结论: IGF-1可明显减少低温保存心脏心肌细胞凋亡的发生,促进再灌注期心功能的恢复,其机制可能与HSP90依赖性Akt的激活和线粒体转位有关。     

HSP70调节应激活化蛋白激酶JNK活性与细胞凋亡

1　简述热休克蛋白 (ｈｅａｔ-ｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ ,ＨＳＰ)家族具有分子伴侣功能 ,能调节蛋白质的折叠、传递和降解[1 ] 。这个家族的成员能被应激诱导合成并保护细胞对抗热休克和其它导致大量蛋白质损伤、变性的有害应激。因为ＨＳＰ70能促进蛋白质的折叠 ,被认为能防止 /修复应激所致的蛋白质损伤。许多实验结果都支持这一观点。例如 :大量表达ＨＳＰ70能显著地减少热诱导的核蛋白聚集[2 ] 。此外 ,温和热休克诱导ＨＳＰ70和其它热休克蛋白的合成堆积 ,可以戏剧性的降低其后严重高温所致的肌动蛋白及其它细胞骨架组织的聚集[3] 。…     

热休克蛋白90在硫化氢抗化学性缺氧诱导心肌细胞氧化应激损伤中的作用

目的： 探讨热休克蛋白90（HSP90）在硫化氢（H2S）对抗化学性低氧模拟剂氯化钴（CoCl2）诱导H9c2心肌细胞氧化应激损伤中的作用。方法： 应用CoCl2处理H9c2心肌细胞,建立化学性缺氧损伤心肌细胞的实验模型。在CoCl2处理H9c2心肌细胞前30 min,把硫氢化钠（NaHS,H2S的供体）加入培养基中,作为预处理。应用高效液相色谱法（HPLC）检测细胞内ATP的含量;罗丹明123（Rh123）染色荧光显微镜照相检测线粒体膜电位（MMP）;超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒检测SOD活性;免疫印迹法（Western blotting）检测血红素氧合酶-1（HO-1）的表达。结果： 600 μmol/L CoCl2明显地降低H9c2心肌细胞内SOD活性、ATP水平及MMP,并增加HO-1表达。400 μmol/L NaHS 预处理可显著地抑制CoCl2诱导的细胞毒性及氧化应激反应,使SOD活性、ATP水平及MMP提高,HO-1表达减少。热休克蛋白90抑制剂17-丙烯胺基-17去甲氧基格尔德霉素（17AAG）能明显地阻断H2S对CoCl2诱导的细胞毒性和氧化应激反应的抑制作用,使细胞内ATP水平及MMP降低,HO-1表达增多,但对SOD活性的影响不明显。结论： 热休克蛋白90可通过抑制化学性缺氧引起的氧化应激反应来介导H2S的心肌保护作用。     

人乳腺癌细胞系中上皮型钙黏连蛋白表达对其黏附和增殖的影响

目的 探讨上皮型钙黏连蛋白(E-cadherin,E-cad)表达对MDA-MB-231人乳腺癌细胞黏附力及增殖的影响.方法 采用脂质体转染方法将携带有E-cad基因的重组真核表达质粒E-cadpcDNA3转染入E-cad阴性MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,通过G418筛选,Western blot法鉴定出E-cad过表达的阳性单克隆细胞株.分别通过三种不同的黏附试验检测E-cad转染前后细胞自身黏附、与基质黏附及与其他细胞黏附能力的变化:免疫沉淀法检测表达的外源性E-cad能否与内源性连环蛋白(β-catenin,β-cat)发生相互作用.Western blot检测E-cad表达后细胞内β-cat、细胞周期蛋白(cyclin)D1蛋白的表达变化;MTT法检测细胞的生长和增殖能力状况;流式细胞仪检测转染E-cad前后细胞凋亡变化情况.免疫细胞化学直接二步法检测β-cat定位变化.结果 通过稳定转染,获得了稳定表达E-cad的两个细胞株Ecad-231-7和Ecad-231-9.MDA-MB-231细胞在不贴壁培养时大部分呈单细胞状态,而两个表达E-cad的细胞株都形成大细胞团;MDA-MB-231、Ecad-231-7和Ecad231-9与HCT116细胞共孵育30 min后的平均黏附率分别为39.0%、60.0%和59.5%.MDA-MB-231细胞在EDTA作用5 min后的平均脱落率为37.4%,Ecad-231-7和Ecad-231-9细胞分别下降为4.2%和7.2%,即E-cad表达后乳腺癌细胞的自身黏附力、与基质的黏附力及与其他细胞的黏附力均增强;且细胞内过表达的外源性的E-cad与β-cat结合,使细胞内cyclin D1表达下降,细胞增殖受到抑制.常规培养48 h后MDA-MB-231、Ecad-231-7和Ecad-231-9细胞的凋亡率分别为1.9%、2.0%和2.1%,E-cad表达对细胞的凋亡没有明显影响.二步法染色显示胞质内β-cat增加.结论 成功建立了稳定表达E-cad蛋白的单克隆细胞株Ecad-231-7和Ecad-231-9.表达的E-cad通过β-cat-cyclinD1途径增强癌细胞黏附力、抑制癌细胞增殖.

Abstract：

Objective To investigate the role that E-cadherin (E-cad) plays on cell adhesion and proliferation of human breast carcinoma. Methods E-cad expression vector was transfected into an E-cadnegative human breast carcinoma MDA-MB-231 cells. G418 was used to screen positive clones. E-cad,β-catenin (β-cat) and cyclin DI expressions of these clones were confirmed by Western blot. Their cell-cell and cell-matrix adhesion abilities were detected. E-cad/β-catenin interaction was confirmed by immunoprecipitation. Cell proliferation was evaluated by MTT. Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. Direct two-step immunocytochemistry was used to detect the localization of β-cat. Result E-cad ( + ) cell strains Ecad-231-7 and Ecad-231-9 were established. When cultured in ultra-low-binding dishes Ecad-231 cells grow in suspension while Ecad-231-7 and Ecad-231-9 cells grow in large clamps. When MDA-MB-231, Ecad-231-7 and Ecad-231-9 respectively. The average detachment rates by EDTA for 5 min are 37.4%, 4. 2% and 7.4% respectively. So E-cad expression enhanced hemotypic and heterotypic cell-cell adhesion and cell-matrix adhesion. Forced exogenously expressed E-cad could combine with endogenous β-cat, whereas down stream cyclin D1 expression was significantly decreased, as evidenced by Western blot. The rates of cell apoptosis of MDA-MB-231, Ecad-231-7 and Ecad-231-9 were 1.8%, 2. 0% and 2.1%. Expression of E-cad had no obvious effect on the apoptosis of tumor cells with regular culture.β-cat increased in the cytoplasma. Conclusions Two monoclonal tumor cell strains ( Ecad-231-7 and Ecad-231-9) stably expressing E-cad were successfully established. E-cad could enhance adhesion and inhibit proliferation of human breast carcinoma cells through a pathway involving β-cat and cyclin D1.     

下调p21活化蛋白激酶2表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响*

 目的： 应用RNA干扰技术下调人乳腺癌MCF-7细胞中p21活化蛋白激酶2（PAK2）的表达,观察其对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。方法: 构建针对PAK2基因的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体并包装病毒颗粒,感染MCF-7细胞,筛选获得稳定细胞株。Western blotting检测细胞中PAK2蛋白表达水平的改变;CellTiter 96 AQueous法和软琼脂集落形成实验检测MCF-7细胞体外增殖能力的改变;流式细胞术检测十字孢碱诱导的MCF-7细胞凋亡的变化。结果: MCF-7细胞的PAK2基因被沉默后,PAK2蛋白表达量明显下降（P<0.01）,与阴性对照组相比,sh-PAK2组细胞生长明显减缓（P<0.01）,克隆形成的数目和大小明显下降（P<0.01）,十字孢碱诱导的细胞凋亡率显著增加（P<0.01）。结论：通过RNA干扰技术下调PAK2的表达,可抑制MCF-7细胞的生长和增殖,并增强其对化疗药物诱导的细胞凋亡的敏感性。PAK2可能是潜在的乳腺癌治疗的新靶点。     

乳腺癌细胞过表达HER2/neu时经PI3K和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路下调野生型p53蛋白含量

目的 研究HER2/neu基因过表达对乳腺癌细胞野生型p53蛋白含量的影响并探讨其分子机制。方法 脂质体介导的HER2/neu基因转染MCF7细胞,G418筛选阳性克隆。Western印迹法鉴定HER2/neu蛋白表达,并同时检测p53及信号转导分子Akt,p-Akt,p-Raf,p-MEK,p-ERK蛋白含量,以及P13K信号通路抑制剂LY294002和MEK抑制剂U0126处理对p53蛋白含量的影响。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测p53 mRNA水平。结果 成功建立稳定过表达HER2/neu的MCF7细胞(MCF7-neu3),其HER2/neu蛋白表达量是对照组MCF7细胞的13倍。MCF7-neu3中p-Akt,p-Raf,p-MEK,P-ERK蛋白含量分别较MCF7细胞升高了2.5倍、2倍、1.6倍和1.6倍(P<0.01),p53蛋白含量仅为对照组细胞的40％(P<0.01),但p53mRNA表达无明显差异。在经PI3K信号通路抑制剂LY294002及MEK抑制剂U0126处理24 h后,MCF7-neu3细胞p53蛋白含量分别上升了1.7和1.5倍(P<0.01),在LY294002和U0126处理48 h后,p53蛋白含量分别升高了4.7倍和5.3倍(P<0.01)。LY294002和U0126处理对MDA-MB-453细胞突变型p53蛋白含量不产生影响。结论 乳腺癌细胞中HER2/neu基因的过表达能够通过激活P13K和Ras/Raf/MEK/ERK通路导致野生型p53蛋白含量减少,可能是HER2/neu过表达乳腺癌患者预后不良及对治疗产生抗性的分子机制。     

Exogenous heat shock protein 27 uniquely blocks differentiation of monocytes to dendritic cells

Circulating heat shock protein (HSP)-27 is associated with tumor progression and increased post-injury infection. Extracellular HSP-27 might alter monocyte (MO)-derived DC and/or MPhi function to mediate immunosuppression. HSP-27 treatment inhibited expression of CD1a and CD1b/c, antigen uptake, and allogeneic T cell induction (MLR) by IL-4 + GM-CSF-differentiated human DC while increasing some MPhi characteristics ( upward arrowCD14, upward arrowCD16, upward arrowCD163). MO cytokine receptor profiles elicited by 24-h exogenous HSP-27 treatment remained supportive of immature DC (iDC) emergence ( upward arrowIL-4R, downward arrowIL-6R, downward arrowM-CSFR). IL-10, IL-6, and M-CSF (which promote MPhi differentiation) were significantly increased in IL-4 + GM-CSF + HSP-27 MO-->iDC differentiation cultures. However, HSP-27 treatment during MO differentiation to DC increased programmed cell death ligand 1 coinhibitor and depressed CD86 costimulator expression in parallel to decreased iDC MLR activity. This suggested that increased MPhi differentiation was not solely responsible for HSP-27 reduction of differentiating DC activity. HSP-27 treatment actually depressed the phagocytic capacity of MO differentiated to MPhi by IL-10 or M-CSF culture. CD163 (hemoglobin receptor) expression was depressed on M-CSF + HSP-27 MO-derived MPhi. HSP-27-mediated inhibition of MO-->iDC differentiation was reversed by p38alpha & beta inhibitor (SB202190) addition or TLR4 receptor modulation. HSP-27 impaired appropriate MO-->iDC and MO-->MPhi differentiation modulating expression of receptors necessary for their proper functions. This suggests that endogenous HSP-27 has immunoregulatory activities which could contribute to immunopathology.     

星形细胞瘤中PTEN、Mdm2和p53的表达及其相关性研究

目的: 探讨不同组织病理分级的星形细胞瘤中PTEN、Mdm2和p53的表达水平, 并分析PTEN影响Mdm2、p53表达的信号转导机制。方法: 采用免疫组织化学方法检测68例星形细胞瘤标本中PTEN、Mdm2和p53的表达水平。结果:星形细胞瘤中PTEN、Mdm2、p53的表达水平分别是54.4%(37/68)、41.2%(28/68)、45.6%(31/68)。PTEN阳性标本中Mdm2的表达率(24.3%, 9/37)与PTEN阴性标本中该蛋白的表达率(61.3%, 19/31)相比差异显著, 统计学分析显示PTEN表达与Mdm2表达呈负相关(P＜0.01)。Mdm2表达和p53表达一致符合率达66.2%(45/68), 两者的表达密切相关(P＜0.05)。结论: (1)PTEN、Mdm2和p53表达与星形细胞瘤的组织病理分级相关。(2)抑癌基因PTEN可以下调癌基因Mdm2的表达水平。(3)Mdm2和p53的表达存在一致性。