广州管圆线虫V期幼虫cDNA表达文库中优势诊断抗原的筛选、鉴定和克隆

目的筛选与广州管圆线虫感染小鼠血清具有较强免疫反应性的优势诊断抗原。方法用感染广州管圆线虫21d的小鼠感染血清做免疫探针筛选广州管圆线虫v期幼虫cDNA表达文库,对筛选得到的阳性克隆进行插入片段的测序和生物信息学分析,再根据测序结果设计引物扩增该基因并将其克隆入PET-30a（＋）载体中。结果共获得6个阳性克隆,经DNA测序及同源性分析表明,发现其中2个与广州管圆线虫髓鞘转录因子1（MYT1）高度同源,1个与广州管圆线虫胶原蛋白家族基因（alpha-collagen）高度同源,且均为全长cDNA。克隆出广州管圆线虫MYT1全长cDNA序列．构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符合的目的片段。结论用感染小鼠血清作为探针初步筛选到2个广州管圆线虫基因,并成功构建MYT1的原核表达重组质粒PET30a（＋）-MYT1。     

广州管圆线虫一期幼虫的分离纯化及其抗原分析

目的建立广州管圆线虫一期幼虫的分离纯化方法,分析其抗原特性及血清学诊断价值。方法分别用贝尔曼漏斗法、蔗糖离心浮选法及改良贝尔曼法联合胰酶消化法从大鼠粪便中分离纯化一期幼虫;用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋白谱与抗原谱分析;分别用一期幼虫和成虫抗原包被ELISA反应板,间接法检测不同样本中相应抗体。结果3种方法分离效率分别为50.1%、33.6%和19.7%;联合法获得的纯度最高,且90%以上的幼虫有活力;贝尔曼漏斗法分离的幼虫99%以上具有活力但纯度低;蔗糖离心浮选法分离的绝大多数虫体失去活力。一期幼虫104000Mr与广州管圆线虫感染2周的大鼠血清出现强反应,32000Mr和31000Mr与感染6周的大鼠血清、32000Mr与广州管圆线虫病患者血清均出现较强反应,与对照血清均未出现明显的反应;在ELISA检测中,一期幼虫抗原对广州管圆线虫病患者血清和感染大鼠血清的检出率与成虫抗原无统计学差异。结论改良贝尔曼法联合胰酶消化法可从大鼠的粪便中分离高纯度且具有活力的一期幼虫,一期幼虫104000Mr、32000Mr和31000Mr具有潜在的诊断价值,可望从大鼠粪便中分离一期幼虫开发诊断性抗原。     

一种广州管圆线虫新基因——胶原蛋白全长cDNA的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)新基因——胶原蛋白(collagen,COL)全长cDNA序列。方法根据表达序列标签(expressionsequencetag,EST)中部分序列和文库载体序列设计引物,采用PCR技术从广州管圆线虫幼虫的cDNA文库中分段扩增cDNA序列,用DNAMAN软件拼接分段扩增的序列以得到全长cDNA序列;利用多种生物信息学软件对cDNA全长序列进行同源性搜索与结构分析。根据cDNA全长序列,设计新的引物从文库中扩出包含胶原蛋白全长开放阅读框(openreadingframe,ORF)的cDNA片段,PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上并测序。重组T载体经双酶切后切下的新基因AcCOL亚克隆到原核表达质粒pET32a( )中。结果克隆一个广州管圆线虫新基因全长cDNA序列;序列比对、蛋白结构域搜索及结构分析结果显示,该新基因所编码的是一种胶原蛋白。构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符的插入片段。结论克隆并鉴定了广州管圆线虫新胶原蛋白编码基因全长,成功构建了该基因的原核表达重组质粒pET32a( )-AcCOL。     

各种化学因素对广州管圆线虫第Ⅲ期幼虫活力的影响

目的寻找更为简便、有效的杀灭蔬菜和水中广州管圆线虫第Ⅲ期幼虫的方法,防止因生食蔬菜或凉拌菜而感染广州管圆线虫病,另外也为寻找新的治疗广州管圆线虫病药物进行前期研究。方法将广州管园线虫第三期幼虫置于各种不同浓度的化学试剂溶液中,镜下观察虫体的活动能力和形态的改变。结果用于消毒餐具1∶80稀释后有效氯终浓度为5.9%的次氯酸钠消毒液1.5 h可使幼虫完全停止活动;用于饮用水消毒的有效氯终浓度为0.35‰的消毒片使虫体运动加快,4 h后仍非常活跃;10%酱油处理10 min即可使幼虫活动明显减弱,30 min虫体完全死亡,虫体卷曲,出现空泡,而且酱油加热后杀虫效果有所增加。结论次氯酸钠消毒液1∶80稀释后用于浸泡餐具、蔬菜或喷洒地面,可用于预防广州管圆线虫病;在食用螺类或凉拌菜时加入酱油可起到预防广州管圆线虫病的作用;酱油加热后杀虫效果并不丧失,表明具有杀虫作用的是一种非蛋白质的化学物质,该物质具有成为新的治疗广州管圆线虫病药物的可能。     

广州及其周边地区福寿螺体内广州管圆线虫感染的现状调查

目的了解广州及其周边地区福寿螺感染广州管圆线虫的情况,为防治提供依据。方法．人式消化174只福寿螺。显微镜下检查消化液中有无广州管圆线虫幼虫。结果广东省广州市花都区、广州市越秀区、兴宁、化州、蕉岭、茂名等六地的福寿螺感染率分别为25．0％、23．1％、24．2％、18．5％、14．3％、13．3％,广东省东莞采集的福寿螺未发现感染广州管圆线虫。结论广东省广州市花都区、广州市越秀区、兴宁、化州、蕉岭、茂名等六地存在广州管圆线虫的自然疫源地。     

无机盐及葡萄糖对广州管圆线虫三期幼虫的体外趋化作用

目的观察不同浓度的无机盐及葡萄糖对广州管圆线虫三期幼虫（AC-L3）的趋化作用。方法将含有20、50、100和150mmol/L无机盐（KCl、NaCl、Na2HPO4、NaHCO3、CaCl2、MgCl2）及葡萄糖溶液的纸片与蒸馏水浸泡的纸片分别贴于琼脂糖平皿的两个区域（实验区和对照区）,将活力好的AC-L3离心后重悬,释放于平皿中央,避光孵化8h,显微镜下计数各区域幼虫。结果 20mmol/L Na2HPO4（P=0.016,CI=0.587）和50mmol/L NaCl（P=0.025,CI=0.696）对AC-L3有较明显的趋向作用,而100mmol/L KCl（P=0.027,CI=-0.546）和150mmol/L NaCl（P=0.028,CI=-0.366）对AC-L3有趋避作用。20mmol/L KCl、NaHCO3、MgCl2,100mmol/L CaCl2,150mmol/L NaHCO3、MgCl2均对AC-L3有趋向作用,但CI值均在0.5以下。不同浓度的葡萄糖对AC-L3的趋化作用差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 NaCl、NaHPO、KCl等无机盐对AC-L3具有一定的趋化作用,并且与无机盐的浓度相关。     

广州管圆线虫幼虫排泄分泌抗原及其诊断价值分析

目的对比分析广州管圆线虫幼虫排泄分泌抗原(LESA)与成虫抗原(AWA),探讨其诊断价值。方法广州管圆线虫三期幼虫感染小鼠,21 d后取小鼠脑内幼虫进行体外培养,收集幼虫排泄分泌蛋白,并与广州管圆线虫成虫匀浆蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析,分别用两种抗原建立LESA-ELISA和AWA-ELISA以检测小鼠血清和不同人群血清。结果SDS-PAGE和Western blot显示幼虫排泄分泌蛋白条带和抗原反应带较成虫少;LESA与小鼠感染血清和广州管圆线虫病患者血清在Mr40 000和Mr26 000处均出现强反应带;感染小鼠血清中抗LESA和AWA的IgG和IgM抗体自感染后开始上升,5 d后达到高峰,第10天后开始下降;LESA-ELISA用于检测广州管圆线虫病疑似病人血清阳性率低于AWA-ELISA;检测血吸虫和华支睾吸虫感染病人血清的交叉阳性率明显低于AWA-ELISA;检测献血员血清及其他非广州管圆线虫感染血清时,假阳性数较AWA-ELISA少。结论 LESA的抗原反应带较AWA少,尽管对广州管圆线虫病疑似病例血清抗体阳性率略低于AWA,但其特异性高;具有潜在的广州管圆线虫病早期诊断和现症感染诊断价值。     

不同温度对广州管圆线虫感染期幼虫的杀灭作用

目的 探究广州管圆线虫感染期幼虫(第Ⅲ期幼虫)在不同温度不同时间下的生存及死亡情况(死亡率).方法 采用人工消化法,从自然感染的褐云玛瑙螺中提取广州管圆线虫感染期幼虫,将其放入不同温度(35～90℃)的热水中,分别作用不同时间(1～20 min).取出置解剖镜下观察虫体的变化情况.结果 在1～20 min内,45℃以下温度对感染期幼虫不具有杀灭作用,死亡率为0;50～55℃温度对感染期幼虫有轻度的杀灭作用,死亡率为12.00%～97.33%;60～65℃温度对感染期幼虫有一定强度的杀灭作用,死亡率为57.39%～100.00%:70～75℃温度对感染期幼虫有很强的杀灭作用,死亡率为97.22%～100.00%;在80℃以上温度时感染期幼虫迅速死亡,死亡率为100.00%.结论 45℃以下温度,20 min内对广州管圆线虫感染期幼虫没有杀灭作用;50～75℃温度,1～20 min,对大多数广州管圆线虫感染期幼虫具有杀灭作用,温度越高,时间越长,杀灭作用越强:80℃以上温度,1～20 min,对广州管圆线虫感染期幼虫具有完全杀灭作用.     

广州管圆线虫Ⅰ期幼虫感染河蚬、河蚌实验研究

目的了解广州管圆线虫Ⅰ期幼虫是否感染河蚬、河蚌,为研究广州管圆线虫病提供科学依据。方法从广州管圆线虫疫区龙海市海澄镇采集广州管圆线虫中间宿主褐云玛瑙螺,解剖分离Ⅲ期幼虫。大白鼠共12只,分3组,每组4只,经口感染大白鼠,每组分别感染100、50和25条广州管圆线虫Ⅲ期幼虫/只,40 d后采集鼠粪镜检,确认感染成功。将鼠笼置于实验感染池上方,以鼠粪便内广州管圆线虫Ⅰ期幼虫感染河蚬、河蚌。结果感染第14 d解剖河蚌和河蚬,均检出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫,感染第28 d镜检,两者感染率均为100%。河蚌和河蚬感染度分别为162.3条/个、2.84条/g和6.9条/个、1.73条/g。三组感染大鼠于30 d、40 d、58 d的死亡率分别为100%、75%、25%。结论河蚬、河蚌可为广州管圆线虫适宜中间宿主。     

温州福寿螺体内广州管圆线虫幼虫分布情况的研究

目的了解温州福寿螺体内广州管圆线虫幼虫的分布情况，为防治提供依据。方法人工消化３６１只福寿螺。结果福寿螺感染率为６９．４％。幼虫在螺体内分布依次为腮６１．３％，肾１６．３５％，消化道１２．６２％，肌肉９．９３％，肝０．７％。结论福寿螺内脏及肌肉中幼虫感染率均高于国内其他疫螺。     

广州管圆线虫Mr32000抗原的免疫诊断效果评价

目的 评价广州管圆线虫Mr32000抗原(AC32)的诊断价值。方法 利用切胶纯化法从广州管圆线虫成虫抗原中获取AC32,用Westernblotting和ELISA方法检测61例广州管圆线虫感染大鼠血清、5例正常鼠血清、1例广州管圆线虫病人血清、50例其他寄生虫体阳性患者血清和50例献血员血清。结果 AC32和成虫粗抗原包被的ELISA检测61份感染大鼠血清和1例临床诊断为广州管圆线虫病人血清均为阳性;AC32-ELISA检测的50例献血员、20例急性血吸虫病人、11例弓形虫病人和所检测的其他寄生虫抗体阳性患者血清均为阴性。结论 AC32在广州管圆线虫病的血清学诊断中具有较高的敏感性和特异性。     

广州管圆线虫成虫尿素溶解性抗原分析及其诊断价值的探讨

目的分析广州管圆线虫成虫尿素溶解性抗原,探讨其诊断价值。方法广州管圆线虫成虫匀浆后沉渣经尿素溶解,与成虫水溶解性抗原同时进行SDS-PAGE和Western-blot,分析蛋白谱与抗原谱;用ELISA检测不同样本中相应抗体。结果SDS-PAGE结果显示尿素抗原蛋白条带少于水溶解性抗原;尿素抗原与感染大鼠血清、免疫兔血清和广州管圆线虫病患者血清在32000Mr处均出现强反应带,尿素抗原的反应带条数较水溶性抗原少。两种抗原包被ELISA检测广州管圆线虫病疑似病人血清和感染大鼠血清的阳性率相同;尿素抗原用于检测血吸虫感染小鼠血清的交叉阳性率明显低于水溶性抗原,检测正常大鼠血清、献血员血清及其他非广州管圆线虫感染血清时,假阳性数较水溶性抗原少。结论广州管圆线虫成虫尿素抗原含有32000Mr抗原;广州管圆线虫尿素抗原用于诊断时,与水溶性抗原有同样的敏感性,而特异性高于水溶解性抗原。     

广州管圆线虫GAMMA-BBH基因的克隆表达鉴定和荧光定量检测

目的亚克隆和表达广州管圆线虫γ-丁基甜菜碱羟化酶（γ-butyrobetaine hydroxylase,GAMMA-BBH）基因．对该蛋白属性进行鉴定,定量检测不同虫龄该目的基因表达量。方法PCR扩增GAMMA—BBH cDNA基因．产物经Nco Ⅰ和HindⅢ限制性内切酶酶切后连接至原核表达载体重组为pET—BBH,在B121（DE3）中用IPTG诱导表达．SDS—PAGE、Westernblot和酶活性测定鉴定表达产物,用荧光定量PCR方法检测广州管圆线虫不同虫龄GAMMA—BBH的表达量。结果PCR和核苷酸序列测定结果表明pET—BBH构建正确并能在IPTG诱导下表达,SDS—PAGE和Western blot鉴定表明表达产物分子量与预期分子量（Mr=48500）一致,酶学测定显示表达产物有GAMMA—BBH的酶活性,荧光定量PCR方法检测结果显示GAMMA—BBH在虫体不同虫龄期表达量不一致。结论目的基因能正确编码并表达具有酶活性的GAMMA—BBH,该酶的表达量与虫龄和寄生部位可能有关。     

单克隆抗体检测广州管圆线虫循环抗原的研究

目的制备抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原单克隆抗体,用于广州管圆线虫循环抗原（CAg）的检测。方法广州管圆线虫成虫可溶性抗原免疫BALB／c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2／0）融合,用酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹试验对所获得的细胞克隆进行筛选和鉴定,双抗体（单抗3F1和4H2）夹心ELISA法检测实验感染广州管圆线虫大鼠、小鼠和广州管圆线虫病人血清中的CAg。结果获得了3株稳定分泌抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原单抗的杂交瘤细胞株,经鉴定2株为IgG1（3F1、4H2）,1株为IgM（2A2）,杂交瘤细胞培养上清效价分别为1：25600、1：25600和1：12800,诱生腹水ELISA效价分别为1：80000、1：80000和1：40000。3株单抗均识别广州管圆线虫成虫相对分子量约为15000的蛋白。实验感染广州管圆线虫大鼠、小鼠血清CAg检出率分别为84．2％（48／57）和87．2％（41／47）,广州管圆线虫病人血清CAg检出率为86,4％（19／22）,与日本血吸虫、囊虫、肺吸虫、旋毛虫病人血清无交叉反应。实验感染小鼠血清CAg第2周即呈阳性反应,第4周A。。值达到高峰。结论建立了敏感性高、特异性强的3P1、4H2双抗体夹心ELISA检测广州管圆线虫循环抗原法,可用于广州管圆线虫病的临床诊断、疗效考核和流行病学调查。     

肺检法和组织匀浆法检测福寿螺广州管圆线虫效果比较

目的 比较直接组织匀浆法和肺检法检测福寿螺广州管圆线虫检出率, 寻找简便快捷适合不同场境的检测方法。方法 在前辈报道已确认的疫区的水塘、沟渠、河流边等环境,捕捞收集福寿螺。每只螺逐只称重后,分别解剖成螺肺囊与肌肉两部分,先用肺检法镜检每只螺肺囊内是否有结节进行初筛,把结节用解剖针挑出单独压片用显微镜查找虫体,并在显微镜下鉴定虫种,然后再把肺囊和螺肉一起用组织匀浆法复检。结果 共检测330只福寿螺,组织匀浆法检出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫的福寿螺63只,检出率为19.1%（63/330）,肺检法查见结节的福寿螺52只,检出率为15.8%（52/330）,其中肺检法查见结节并查到幼虫的福寿螺36只,其匀浆法也全部阳性,符合率100%（36/36）;肺检法查见结节但未查到幼虫的福寿螺16只,其中有6只匀浆法阳性,10只匀浆法阴性,错检率19.2%(10/52 );肺检法未查见结节福寿螺278只,但用匀浆法检查有21只检出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫,漏检率7.6%（21/278）。匀浆法与肺检法（以查见结节判定阳性为标准）比较,两者之间差异无统计学意义（χ²=1.27,P= 0.26,P>0.05）。匀浆法与肺检法（以查到幼虫判定阳性为标准）比较,两者之间差异有统计学意义（χ²=8.66,P=0.003,P<0.01）。两种方法对不同体质量的福寿螺广州管圆线虫检出率比较,结果显示肺检法2种判定方法在检测大螺（≥25 g）时与匀浆法比较其检出率之间差异都没有统计学意义（χ²=0.08,P=0.777;χ²=2.58,P=0.108）,但在检测小螺（≤10 g）方面与匀浆法比较其检出率之间差异有统计学意义（χ²=5.63,P=0.02）。结论 肺检法的检测效果与组织匀浆法相比, 在检测大螺方面方法简单所需仪器设备更少,其检测速度更快, 适合广州管圆线虫的自然疫源地现场调查。而直接组织匀浆法灵敏度高,能直观地显示虫态与活度,虫体活力强,检出率高,更适合用在食品安全风险监测方面。     

广州管圆线虫抗原IF的体外表达系统的建立和分析

【目的】建立广州管圆线虫特异性抗原中间纤维(IF)基因的体外表达系统,研究IF蛋白的结构和功能关系。【方法】将IF基因亚克隆入原核表达载体pET-30a-c(+)并在原核中诱导表达,Westernblot鉴定融合表达产物的免疫特性,用组氨酸(His)亲合层析柱分离纯化表达产物,鉴定表达体系效率。生物信息学分析目的蛋白结构和功能关系。【结果】抗原基因IF在原核中与6个组氨酸进行了融合表达,以可溶性表达为主,并能在该系统中大量、稳定表达,其相对分子质量Mr=48×103,该表达产物具有较好的抗原性,可被大鼠感染血清识别,抗原IF具有典型的中间纤维家族特征,该蛋白具有多个抗原表位存在。【结论】建立了IF的有效原核表达系统,IF抗原蛋白的结构决定了它的属性和功能。     

广州管圆线虫抗原IF的中间纤维蛋白组织来源分析和定位

目的 对广州管圆线虫抗原IF进行中间纤维蛋白家族分类和细胞组织定位.方法 IFTG诱导重组基因pET-IF在大肠杆菌中表达广州管圆线虫抗原IF,用组氨酸亲和层析纯化表达产物,用Western blot方法鉴定抗原IF的中间纤维蛋白类型;小鼠皮下多点注射法制备抗IF抗体血清,用免疫组织化学方法检测抗原IF在虫体组织和细胞上的定位.结果 广州管圆线虫抗原IF在体外成功表达并纯化,其属于中间纤维蛋白家族的角蛋白,定位于广州管圆线虫成虫肠管壁,存在于细胞质中.结论 广州管圆线虫抗原IF分布于虫体肠管壁,同时从组织学角度证明广州管圆线虫存在中间纤维结构.     

抗广州管圆线虫噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的以广州管圆线虫感染的小鼠脾细胞为源,构建抗广州管圆线虫抗体库,并筛选可用于广州管圆线虫病早期诊断的目的抗体。方法提取感染广州管圆线虫的小鼠脾细胞RNA,并逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻、重链基因先后连接到表达载体pComb3上,转化大肠杆菌XLI-Blue,构建组合文库。用广州管圆线虫排泄分泌抗原(EsAg)作为筛选抗原,进行富集筛选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果成功构建了小鼠抗广州管圆线虫噬菌体抗体文库,库容为2.32×106,滴度为1.7×1013cfu/ml。筛选到了抗广州管圆线虫排泄分泌抗原特异性抗体克隆5株,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行初步鉴定,具有一定的特异性。结论构建的抗广州管圆线虫噬菌体抗体库达到了要求,为研制广州管圆线虫金标诊断试剂盒奠定了基础。     

左旋咪唑及吡喹酮对鼠体内广州管圆线虫幼虫杀灭效果的研究

本文报道感染50条和100条广州管圆线虫幼虫的大白鼠,在感染后第6天开始用左旋咪唑及吡喹酮口服治疗,前者给10mg/kg/日,连用3天和6天,后者给25mg/kg/日,连用6天,每组大白鼠在感染后第14,15、21、22天解剖,从鼠脑收集虫体数,与对照组比较,治疗组收集虫数明显少,治疗3天和6天虫减少率分别为90～96％和99～100％,提示:左旋咪唑有高的杀幼虫效果。连用6天优于连用3天,两者有显著差异,(U=8.30,P<0.001)。吡喹酮治疗6天,虫减少率为65～97％,也有良好的杀虫效果,但不如左旋眯唑好,两者比较,有显著差异,(U=7.45P<0.001)。