hTWEAK基因重组慢病毒载体构建、病毒包装及蛋白表达分析

目的:构建携带人肿瘤坏死因子样微弱凋亡诱导剂(hTWEAK)基因的慢病毒表达载体,体外包装成病毒颗粒,并分析其感染人肝癌细胞HepG2后TWEAK的表达情况。方法:以pORF5-TWEAK为模板,采用普通PCR扩增TWEAK基因,通过酶切、连接等步骤构建Plentilox3.7-TWEAK重组质粒,利用酶切和测序的方法对重组质粒进行鉴定。在293T细胞中包装含TWEAK基因的慢病毒颗粒并感染HepG2细胞,采用荧光定量PCR和Western-blot检测TWEAK表达水平,并通过间接免疫荧光(IMF)检测其细胞表达定位。结果:酶切与测序结果证明重组质粒构建成功,并能在293T细胞中与病毒包装质粒成功包装病毒颗粒。病毒转染的HepG2细胞中,TWEAK基因mRNA表达量约为对照组的500倍,TWEAK蛋白表达量明显高于对照组,且主要定位于胞浆。结论:本研究成功构建了含人TWEAK基因的慢病毒表达载体,其可在人肝癌细胞系HepG2中稳定表达,为后续的功能学研究打下了基础。     

Vasohibin-2慢病毒过表达载体的构建及相关增殖功能研究

目的:构建Vasohibin-2(VASH2)慢病毒过表达载体,获得稳定表达的肝癌细胞株HepG2,并观察其对HepG2增殖的影响?方法:通过逆转录?PCR技术从细胞总RNA中获得VASH2目的基因,引入NheⅠ和PstⅠ酶切位点,连接到pTA2 vector中,经NheⅠ和PstⅠ双酶切后再连接到Lv-CMV-EGFP vector中,并对重组后的质粒进行双酶切和测序分析;VASH2过表达载体?pVSV-G及delta8.91 3个质粒共转染293T细胞,获得慢病毒感染肝癌细胞株HepG2,经流式细胞仪分选阳性细胞;提取细胞总RNA和总蛋白,利用real-time PCR和Western blot鉴定稳转细胞株中VASH2的表达,用MTT法和细胞周期法检测各组HepG2的增殖能力?结果:成功构建VASH2慢病毒过表达载体,感染肝癌细胞株HepG2后能够稳定高表达VASH2;稳定高表达VASH2的HepG2增殖能力明显增强(P < 0.05)?结论:成功构建了VASH2慢病毒过表达载体,并发现VASH2可以促进HepG2的增殖能力,这为进一步研究VASH2在肝癌中的功能及作用机制奠定了基础?     

携带人miR302和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人miR302和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pFUM3GW.方法 Nhe Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pmiR302ApE以释放miR302,接着补平酶切位点而获连接用miR302:BamH Ⅰ酶切携带EGFP的慢病毒载体pFUGW,接着补平酶切产物.并去磷酸化而获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用miR302连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR302测序.所构建载体命名为pFUM3GW.获pFUM3GW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR302和EGFP基因的慢病毒感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F以建立相应病毒感染体系.结果 PCR、酶切和测序证实成功构建了pFUM3GW,按标准程序生产的携带miR302和EGFP基冈的慢病毒上清高效率感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)及鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F.结论 成功构建携带人miR302和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUM3GW,为相关后续研究打下了良好基础.     

pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒的构建及在肝癌细胞系HepG2中稳定高表达

目的 建立癌-睾丸抗原NY-ESO-1稳定表达的HepG2肝癌细胞系.方法 设计NY-ESO-1的引物,PCR法从NY-ESO-1阳性表达的睾丸癌组织中扩增出目的片段,克隆至T载体,双酶切后定向连入pCDNA3.1载体,构建pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒.经酶切、PCR、测序检测其构建的正确性,脂质体转染法将重组质粒转入HepG2细胞,G418药物筛选出稳定转染的细胞系,RT-PCR法、间接免疫荧光法分别检测稳定转染HepG2细胞中NY-ESO-1基因、蛋白的表达水平.结果 构建的pCDNA3.1/NY-ESO-1质粒经酶切、测序等检验表明质粒构建成功,筛选获得稳定高表达NY-ESO-1的HepG2细胞.结论 构建了pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒及稳定高表达NY-ESO-1的HepG2细胞株,为下一步以NY-ESO-1为靶标进行肝癌的抗原特异性免疫治疗研究奠定了实验基础.     

人SR-BI基因表达抑制慢病毒载体构建及其稳定细胞株的筛选

目的 建立SR-BI表达抑制的肝癌细胞系,以作为研究SR-BI基因突变对HCV感染性影响的细胞模型.方法 构建SR-BI短发夹状RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒重组质粒Lv-SR-BI-shRNA,挑取克隆进行PCR扩增和序列测定;将阳性重组质粒与慢病毒辅助质粒共转染HEK2973T细胞,包装SR-BI shRNA慢病毒并进行病毒滴度测定.SR-BI shRNA慢病毒感染人肝癌细胞株Huh7和Huh7.5.1细胞,嘌呤霉素筛选,Real-time PCR和Western blot法检测SR-BI mRNA转录和蛋白表达.结果 测序结果证实Lv-SR-BI-shRNA慢病毒载体构建成功并获得HEK293T细胞中包装的慢病毒,Lv-SR-BI-shRNA重组慢病毒感染Huh7和Huh7.5.1细胞,感染组SR-BI mRNA转录降低,蛋白表达降低.结论 建立了SR-BI表达抑制的人肝癌细胞株Huh7-siSR-BI和Huh7.5.1-siSR-BI稳定细胞系.     

siRNA靶向稳定干扰HDGF基因胃癌细胞株的建立

目的 构建针对肝癌衍生生长因子(HDGF)基因的siRNA表达载体,建立稳定干扰HDGF表达的胃癌细胞株. 方法 常规聚合酶链反应(PCR)检测HDGF基因在胃癌SGC-7901细胞株的表达情况.构建重组靶向HDGF shRNA慢病毒表达质粒pLentiU6/ HDGFshRNA,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞株.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株.荧光定量PCR检测干扰效率. 结果 在胃癌SGC-7901细胞株中,HDGF显示高表达.测序验证pLentiU6/HDGFshRNA重组质粒构建成功;在将干扰表达质粒稳定转染入胃癌细胞株后能明显抑制HDGF mRNA表达水平. 结论 成功构建了pLentiU6/HDGFshRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰HDGF表达的siRNA胃癌细胞株.     

MiR-122稳定转染细胞系的建立及其脂代谢特征

目的:利用稳定表达人miR-122前体的表达载体,转染低表达miR-122的人肝癌细胞系HepG2细胞,获得过量表达miR-122的稳定转染细胞系,探讨miR-122对肝脏细胞脂代谢的影响及其机制。方法:对已构建完成的表达质粒pEZX-hsa-mir-122和对照质粒pEZX-mir-control进行酶切鉴定,对酶切正确的克隆进行DNA测序,测序正确的克隆应用脂质体试剂转染,绿色荧光蛋白表达监测转染效率,应用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞系,实时定量PCR在RNA水平鉴定miR-122的表达,蛋白质印迹法从靶分子水平验证miR-122的抑制功能,尼罗红染色观察细胞内脂质。结果:pEZX-hsa-mir-122质粒成功转染HepG2细胞,质粒携带的miR-122前体序列整合到细胞基因组中,获得过量表达miR-122的HepG2细胞株,细胞内成熟体miR-122可抑制靶基因的翻译,细胞内脂质明显增加。结论:人miR-122前体序列可整合在HepG2细胞基因组中,过量表达miR-122的HepG2细胞出现脂质代谢异常。     

慢病毒shRNA靶向干扰RegⅣ基因胰腺癌细胞株的构建

 目的  构建并鉴定再生基因4 (regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短发夹干扰RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,继而建立稳定干扰RegⅣ基因表达的胰腺癌细胞株PANC-1。方法  使用聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)检测RegⅣ基因在胰腺癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向干扰RegⅣ基因的shRNA 慢病毒表达质粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂质体转染的方法将载体导入胰腺癌细胞,建立稳定表达shRNA的细胞株。使用荧光定量PCR检测干扰效率。RegⅣ基因过表达载体的构建方法为:将获取的目的基因与pEGFP-RegⅣ-3FLAG过表达质粒载体分别进行双酶切,利用电泳回收双酶切产物,转化感受态细胞并进行测序验证,验证成功后,使用Western blot检测其在293T细胞中的表达强度。结果  PCR结果显示RegⅣ在PANC-1中表达最高,在BxPC-3中表达最低。测序验证pGC-shRNA-RegⅣ重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胰腺癌细胞株PANC-1后能明显抑制RegⅣ mRNA 表达水平。过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后进行Western blot鉴定,验证pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ过表达载体构建成功。过表达RegⅣ基因转染BxPC-3后,与空质粒组相比,RegⅣ表达量明显提高。结论  成功建立了靶向稳定干扰RegⅣ基因表达的shRNA胰腺癌细胞株PANC-1。     

miR-424慢病毒表达载体的构建及其对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：构建hsa‐miR‐424基因慢病毒表达载体,并鉴定miR‐424在细胞内表达水平,研究hsa‐miR‐424对宫颈癌 He‐la 细胞增殖的影响。方法以人基因组 DNA 为模板,设计合成 miR‐424的上下游引物,PCR 扩增目的片段,回收产物将其连入pMD18T 载体中,进行测序。再以 pMD18T‐miR424为模板进行 PCR 扩增,将其中表达 pMD18T‐miR424的结构经酶切后插入pLentis‐CMV‐GFP‐MCS‐PGK‐PURO 载体,构建成 pLentis‐CMV‐GFP‐miR424‐PGK‐PURO ,在293T 细胞中与 pSPAX2、pMD2．G包装产生所需的慢病毒,再用含慢病毒的上清液感染 Hela 细胞。结果 miR‐424基因与慢病毒载体连接成功,测序结果证明了插入到质粒载体中的 miR‐424前体序列完全正确,成功构建 pLentis‐CMV‐GFP‐miR424重组慢病毒载体,用其感染宫颈癌Hela 细胞后上调 miR‐424的表达近60倍。采用 M TT 法检测增殖结果提示：感染 miR‐424慢病毒的宫颈癌 Hela 细胞株均存在细胞增殖减慢。结论成功的构建了 miR‐424慢病毒载体,建立了高效稳定表达 miR‐424的细胞株,并用含慢病毒的上清液感染宫颈癌 Hela 细胞,成功抑制了 Hela 细胞的增殖,为后续相关的研究奠定了良好的基础。     

重组Bmi1基因的慢病毒的制备和鉴定

目的制备携带B细胞特异单克隆鼠白血病毒整合位点1基因（Bmi1基因）的慢病毒pSin-Bmi1,并在人胚胎干细胞H1中过表达Bmi1基因和BMI1蛋白。方法根据GeneBank提供的Bmi1基因序列,以H1来源的cDNA为模板扩增其cDNA序列,回收片段,Bmi1基因和pSin载体分别进行双酶切,连接后的质粒转化。经菌落PCR、双酶切鉴定及测序鉴定pSin-Bmi1阳性克隆。将阳性表达的pSin-Bmi1和包装质粒转染到293T细胞中制备病毒液。将包装好的病毒感染人胚胎干细胞H1细胞系并用嘌呤霉素筛选稳定表达BMI1的细胞株。通过Western blot验证H1细胞中外源性BMI1蛋白表达。结果经菌落PCR、限制性核酸内切酶酶切和测序证实目的基因Bmi1序列正确。Western blot检测发现感染重组Bmi1的慢病毒的细胞中有外源性BMI1蛋白的高表达,而未感染重组Bmi1的慢病毒的对照组未检测到BMI1表达。结论成功制备了携带Bmi1基因的慢病毒,并得到了稳定高表达外源Bmi1的细胞株。     

川芎嗪对人肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM中P-gp表达的影响

目的观察川芎嗪（TMP）对人肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM中P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）表达的影响,研究TMP对人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM的逆转机制。方法将人肝癌细胞耐药株BEL-7402/ADM及其亲本细胞BEL-7402分为：亲本组、耐药组、逆转组（耐药＋TMP）、阳性对照组（耐药＋维拉帕米）、二抗阴性对照组,用免疫组化SABC法和流式细胞术对照观察TMP对BEL-7402/ADM中P-gp表达的影响。结果流式细胞术结果显示耐药组显著高于亲本组（P〈0.01）;耐药＋TMP组和耐药＋维拉帕米组均显著低于耐药组和亲本组（P〈0.01）。免疫组化SABC法显示耐药组P-gp阳性表达率显著高于亲本组（P〈0.01）;TMP组、维拉帕米组的P-gp阳性表达率显著低于耐药组（P〈0.01）。结论 TMP能显著降低人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM细胞表面P-gp的表达,增加阿霉素等化疗药物对BEL-7402/ADM的细胞毒性作用,从而增加对肿瘤细胞的抑制率,提高化疗疗效。     

miR-122表达载体的构建及其对Bcl-xL,Bcl-2基因的抑制作用

目的构建miR-122真核表达载体并检测其表达对BEL-7402/5-FU细胞中耐药相关基因Bcl-xL,Bcl-2基因表型的作用。方法人工合成miR-122成熟cDNA序列,以质粒载体pSilencer 3.1-H1 neo为母本,构建miR-122真核表达载体,空载体作为对照,利用脂质体2000和G418筛选稳转至BEL-7402/5-FU细胞中。其中转染miR-122载体的细胞为miR-122转染组,转染空载体的细胞为空载体转染组,通过实时荧光定量RT-PCR检测未转染组、转染空载体组和miR-122转染组细胞中miR-122表达水平。验证miR-122载体是否在细胞中稳定表达。并通过实时荧光定量RT-PCR检测未转染组、空载体转染组和miR-122转染组中耐药相关基因Bcl-xL,Bcl-2的基因表达情况。结果 miR-122真核表达载体在BEL-7402/5-FU细胞中稳定表达,与未转染组和空载体转染组比较,miR-122转染组中Bcl-xL,Bcl-2的基因表达水平显著降低。结论 miR-122可下调耐药相关基因Bcl-xL,Bcl-2的基因表达,MiR-122是降低BEL-7402/5-FU细胞的5-氟尿嘧啶药物敏感性影响的潜在因素。     

MiR-122上调野生p53蛋白增强BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶敏感性

目的探讨MiRNA-122对肝癌耐药细胞株BEL-7402／5。Fu的5．氟尿嘧啶敏感性的影响以及作用机制。方法构建miR-122及其阴性对照空载体稳定转染至BEL-7402／5-FU细胞中,Westernblot检测未转染组,阴性载体转染组和miR-122转染组中与耐药相关的p53蛋白表达水平。用MTT法和流式细胞术检测三组细胞对5-氟尿嘧啶敏感性。结果MiR-122转染组与未转染组,阴性载体转染组比较,野生型p53蛋白表达水平升高。流式细胞术检测,miR-122转染组的细胞凋亡率较未转染组和阴性载体转染组高。结论miR-122能上调野生型p53蛋白表达,增加BEL-7402／5-FU细胞对5-氟尿嘧啶敏感性,从而成为治疗肝癌耐药治疗的一个方法。     

肝癌细胞系中SLIT2、DAPK、RIZ1、CHFR、EDNRB、3-OST-2基因甲基化状态

目的 了解SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B和HepG2 5种肝癌细胞系中SLIT2、DAPK、RIZ1、CHFR、EDNRB和3-OST-2 6种基因启动子区域甲基化状态.方法 体外培养以上5种肝癌细胞系,应用甲基化特异性PCR(MSP)技术,检测5种肝癌细胞系SLIT2、DAPK、RIZ...     

MiR-18B-5p调节BTG3及其下游信号通路促进肝细胞癌的发生发展

目的 本研究旨在探讨miR-18B-5p在肝癌中的作用及其机制。 方法 检测miR-18B-5p在肝癌患者血清中的表达水平,对其临床意义进行分析。下调miR-18B-5p表达水平,检测miR-18B-5p在肝癌细胞系增殖、迁移和侵袭中的作用,用实时荧光定量聚合酶链反应和荧光素酶报告法探讨其作用机制。 结果 低miR-18B-5p表达组患者生存率高于高miR-18B-5p表达组（P＜0.05）,多因素分析结果显示,miR-18B-5p的表达水平（RR:2.064,95%CI:1.522~2.800）和年龄（RR:1.762,95%CI:1.347~2.305）是患者生存的影响因素,HepG2细胞表达的miR-18B-5p水平高于Bel-7402组、MHCC97组和Hep3B组（P＜0.05）,Si-miR-18B-5p细胞系的Si-miR-18B-5p表达和细胞增殖低于HepG2细胞系（P＜0.05）,在Si-miR-18B-5p细胞系miR-18B-5p下调,细胞迁移和侵袭能力低于HepG2细胞系（P＜0.05）,Si-miR-18B-5p细胞中BTG3的mRNA表达高于HepG2细胞系（P＜0.05）,BTG3 WT相对荧光素活性低于BTG3 Mut（P＜0.05）。 结论 MiR-18B-5p可作为肝癌新的治疗靶点和预后标志物。     

应用SELDI-TOF-MS技术筛选人肝癌细胞多药耐药相关差异表达蛋白

【目的】通过SELDI-TOF-MS技术筛选体外培养人肝癌细胞多药耐药相关差异表达蛋白。【方法】采用体外培养人肝癌细胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶细胞Bel-FU,MTT法检测Bel-FU的多药耐药性;SELDI-TOF-MS技术结合CM-10芯片检测Bel-7402与Bel-FU蛋白质指纹图谱。【结果】细胞Bel-FU对于5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、长春新碱、阿霉素、柔红霉素的耐药指数分别为:89.6倍、3.9倍、37.2倍、16.5倍、3.7倍。在质荷比(M/Z)2 000～50 000的范围内,Bel-FU与Bel-7402间共检测到8个差异蛋白(P<0.05),其中上调蛋白有3个,下调蛋白有5个。【结论】SELDI-TOF-MS技术为筛选肝癌MDR蛋白标志物提供了一个简便、有效的方法。     

趋化因子受体CXCR7在人肝癌细胞株中的表达及意义

目的探讨趋化因子受体(Chemokine receptor,CXCR7)在不同肝癌细胞株中的相对表达强度及意义。方法采用RT-PCR、Western blot法,检测8株不同转移潜能肝癌细胞中趋化因子受体CXCR7在mRNA及蛋白水平的表达情况。结果 CXCR7在8株肝癌细胞中的表达水平差异存在统计学意义,无论是mRNA水平还是蛋白水平,高转移潜能肝癌细胞株(MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3)CXCR7的表达明显高于普通转移潜能肝癌细胞株(HepG2、PLC/PRF/5、SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B),P<0.01。结论 CXCR7与肝癌的发生、发展及预后有一定的相关性。     

MiR-195对BEL-7402/5-FU细胞5-氟尿嘧啶耐药性的影响

目的 探讨miR-195对BEL-7402/5-FU细胞5-氟尿嘧啶药物敏感性的影响。方法采用qRT-PCR检测BEL-7402细胞与BEL-7402/5-FU细胞中miR-195的表达水平。将miR-195质粒载体瞬时转染至BEL-7402/5-FU细胞;MTT检测细胞药物敏感性的改变。结果相比于BEL-7402细胞,miR-195在BEL-7402/5-FU细胞中表达水平下调;miR-195转染组的细胞增殖抑制率较miRNA阴性对照组及未转染组明显增高。结论MiR-195能够增加BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶的药物敏感性,抑制细胞增殖。     

GCF2选择性剪接区在肝癌组织及细胞株中的表达及意义

目的：研究肿瘤相关抗原GCF2选择性剪接区在人肝癌细胞株、肝癌组织、癌旁组织及正常成人肝细胞及组织中的表达及意义.方法：采用RT PCR检测GCF2 5个选择性剪接区（D1～D5）在人肝癌细胞株、43例肝癌组织、相对应的癌旁组织,以及正常成人肝细胞株及9例肝组织中的表达.结果：GCF2 4个选择性剪接区（D1～D4）在所检测的细胞株、肝癌组织、癌旁组织和正常成人肝组织中均未检测到表达;GCF2选择性剪接区D5仅在人肝癌细胞株检测到阳性表达;在43例肝癌组织及相应的癌旁组织中,有41例肝癌组织GCF2选择性剪接区D5呈阳性表达,阳性表达率为95.35％ （41/43）,而9例正常肝组织均未检测到GCF2选择性剪接区D5表达.结论：GCF2 D5选择性剪接区在肝癌组织中有较高阳性表达,GCF2选择性剪接区D5可能与肝癌的发生发展有关.     

MiR-503靶向bcl-2增强BEL-7402细胞对顺铂的敏感性

目的：探讨miR-503是否能通过调控bcl-2的表达增强BEL-7402细胞对顺铂的敏感性。方法：采用实时荧光 定量PCR检测肝癌细胞中miR-503和bcl-2 mRNA的表达水平;Western印迹观察肝癌细胞中Bcl-2蛋白的表达水平;脂质 体转染法将miR-503模拟物瞬时转染至BEL-7402细胞;生物信息学软件预测miR-503潜在靶基因;双荧光素酶活性验证 miR-503潜在的靶位点;MTT法检测细胞药物敏感性的改变。结果：相比于HL-7702细胞,miR-503在BEL-7402细胞中 表达水平下调,Bcl-2蛋白的表达水平上调;miR-503能够与bcl-2靶向结合,下调bcl-2的表达;miR-503转染组的细胞活 力较miRNA阴性对照组显著降低。结论：MiR-503可能通过靶向bcl-2增强BEL-7402细胞对顺铂的药物敏感性,抑制肝 癌细胞增殖。