Melatonin inhibits the proliferation of human osteosarcoma cell line MG-63

It seems established that the onset of osteosarcoma and the reduction in melatonin production run in parallel; this suggests that the decline in the cancer-inhibiting agent, melatonin, may contribute to the occurrence of osteosarcoma and that melatonin supplementation may have promise for preventing the development and progression of this condition. There is, however, no direct evidence regarding an antiproliferative effect of melatonin in osteosarcoma cells. In the current study, we examined whether melatonin inhibits the proliferation of human osteosarcoma cell line MG-63. MTT staining showed that at 4 mM–10 mM concentrations, melatonin significantly reduced the MG-63 cell proliferation in a dose-dependent and time-dependent manner. Flow cytometry documented that 4 mM melatonin significantly increased the fraction of cells in the G₀/G₁ phase of the cell cycle, while simultaneously reducing the proportion in the S and G₂/M phases. Western blot and real-time PCR analyses further confirmed that melatonin's inhibitory effect was possibly because of downregulation of cyclin D1 and CDK4, related to the G₁ phase, and of cyclin B1 and CDK1, related to the G₂/M phase. There was no downregulation of cyclin E, CDK2, and cyclin A, which are related to G₁/S transition and S phase. These findings provide evidence that melatonin may significantly inhibit human osteosarcoma cell proliferation in a dose-dependent and time-dependent manner and this inhibition involves the downregulation of cyclin D1, CDK4, cyclin B1 and CDK1.     

噻莱昔布(celecoxib)对人骨肉瘤细胞MG-63增殖与凋亡的影响

目的:研究环氧化酶2(cyclooxygenase2,COX2)抑制剂celecoxib对人骨肉瘤细胞MG63抑制增殖及诱导凋亡的作用。方法:MTT比色观察celecoxib的细胞毒性作用及其浓度依赖性;Hoechst33258荧光染色、透射电子显微镜和TUNEL观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率及其时间依赖性。结果:celecoxib分别以10、20、40、80μmol/L作用后,细胞生长受到不同程度抑制;荧光显微镜、电镜和TUNEL观察到细胞胞浆浓缩、核凝聚、核碎裂和凋亡小体形成。流式细胞仪显示celecoxib40μmol/L作用24、48、72h后,细胞凋亡率分别与对照组比较有非常显著性差异(P<0.01)。结论:celecoxib能抑制人MG63细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用

[目的]探讨人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用及其具体作用机制。[方法]MG-63细胞分为空白对照组和CK药物处理组。采用MTT法检测细胞活性及增殖能力,倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验检测药物CK对细胞的诱导凋亡作用;Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-9、Bcl-2及BAX的表达,研究其具体凋亡机制。[结果]CK能够显著降低MG-63的体外活性及生存率(P<0.05);细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验证明CK可诱导MG-63凋亡(P<0.05);CK处理后MG-63细胞表达的Caspase-9及BAX表达上调,相反Bcl-2表达下调(P<0.05)。[结论]人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63具有凋亡诱导作用,而以Caspase-9为关键因素的线粒体凋亡途径在此凋亡中起着决定性作用。     

人可溶性TRAIL蛋白诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的 初步观察并探讨人重组可溶性TRAIL蛋白诱导MG-63骨肉瘤细胞凋亡的作用，并通过实验初步探讨TRAIL对肿瘤细胞的选择性杀伤作用。方法 MTT法测定TRAIL对MG-63细胞、MRC-5人肺二倍体细胞及L-02人肝细胞的抑制率；电镜观察与FACS分析TRAIL蛋白诱导MG-63骨肉瘤细胞凋亡的作用；用RT-PCR检测TRAIL受体在MG-63骨肉瘤细胞、MRC-5人肺二倍体细胞及L-02人肝细胞上的表达，并初步分析TRAIL诱导MG-63骨肉瘤细胞凋亡的机制。结果 MTT还原试验表明：作用24h后500ng/ml TRAIL的抑制率为10.1％，1μg/ml TRAIL的抑制率为24.3％，2μg/ml TRAIL的抑制率为50.6％，5μg／ml TRAIL的抑制率为95％以上，其半数抑制浓度为2μg/ml。而TRAIL对MRC-5人肺二倍体细胞株及L-02人肝细胞株无明显作用。细胞形态学观察显示：MG-63骨肉瘤细胞经TRAIL作用3～8h后即有部分细胞开始变小、变圆，24h后大量细胞变圆、脱落，漂浮于培养液中。透射电镜可观察到核固缩，染色质浓聚于核膜形成新月状小体。流式细胞仪检测显示2μg／ml的TRAIL处理MG-63骨肉瘤细胞6h，即可在二倍体峰前出现较明显的凋亡峰。结论 人可溶性TRAIL蛋白可以迅速地选择性杀伤MG-63骨肉瘤细胞，具有潜在的临床应用价值。     

靶向Survivin的小分子干扰RNA对骨肉瘤细胞的体内外抑制作用

目的 观察靶向Survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体对人骨肉瘤细胞MG-63的体内外抑制作用.方法 体外构建Survivin siRNA表达载体pSilence2.1-neo-Survivin,转染骨肉瘤细胞株MG-63、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学(SP)法检测转染前后Survivin mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡,建立裸鼠移植瘤模型,记录瘤体形成时间及肿瘤生长.结果 转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降,转染后mRAN表达抑制率为85.08%,增殖指数为空白组的28.20%;细胞周期分析显示:shRNA组G0/G1期细胞明显增多,而G2/M期、S期细胞数目减少;吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变,转染组凋亡率为24.54%;稳定转染组细胞裸鼠体内致瘤能力降低,转染组成瘤时间为(13.2±2.0)d,空白组为(6.5±1.6)d,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).4周时同空白组相比转染组瘤体体积小62.89%(P＜0.01),重量轻59.07%(P＜0.01).结论 靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖,促进细胞凋亡;明显抑制人骨肉瘤细胞的致瘤活性及裸鼠移植瘤的生长.     

甲氨蝶呤对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及28Livin和Caspase-3表达的影响

目的 观察甲氨蝶呤(MTx)对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及Livin和Caspase-3表达的影响.方法 体外培养骨肉瘤MG-63细胞株,用0、50、100、200和400μmol/L的MTX作用于骨肉瘤MG-63细胞24、48、72 h后,用噻唑蓝(MTT)比色法检测骨肉瘤MG-63细胞的增殖活性,用流式细胞仪测细胞的凋亡率,用Western blot检测不同浓度MTX作用于骨肉瘤MG-63细胞24 h后各组细胞的Livin和Caspase-3蛋白表达水平.结果 随MTX浓度增加骨肉瘤MG-63细胞的增殖活性降低,同时细胞的凋亡率增加(P＜0.05),随MTX浓度增加各组细胞中Livin蛋白的表达降低,Caspase-3蛋白表达增加(P＜0.05).结论 MTX诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡,其机制可能与下调Livin表达继而上调Caspase-3表达有关.

Abstract：

Objective To observe the effect of Methotrexate (MTX) on apoptosis and expression of Livin and Caspase-3 in human osteosarcoma cell line MG-63. Methods After treatment of MG-63 cells with MTX at different concentrations (0, 50, 100,200,400 μmol/L) for 24, 48 and 72 h, methyl thiazol tetrazolium(MTT) assay was used to observe the growth inhibition of MG-63. The apoptosis was assessed by flow cytometry. The protein expression of Livin and Caspase-3 was detected by Western blotting. Results When MTX was added, growth inhibition and increased apoptosis of MG-63 cells were detected,which was showed in a dose- and time-dependent manner. MTX also down-regulated the level of the protein expression of Livin (P＜0.05), and elevated the protein expression of Caspase-3 (P＜0.05). Conclusion MTX can induce apoptosis of MG-63 cells, by down-regulating Livin expression and subsequently up-regulating Caspase-3 expression.     

塞来昔布协同顺铂P13K/Akt途径诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡的实验研究

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响及作用机制.方法 塞来昔布(50 μmol/L或100 μmol/L)和(或)顺铂(10 μg/ml)作用骨肉瘤MG-63细胞48 h后,MTT法测定细胞增殖的抑制率,电子显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测基因水平COX-2表达变化,Western blot检测COX-2及凋亡相关蛋白表达变化.P13K抑制剂Wortmannin作用MG-63细胞48 h,检测蛋白表达变化.结果 塞来昔布导致MG-63细胞阻滞在G1期,通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9的内源性凋亡途径诱导细胞凋亡;顺铂单药作用后骨肉瘤MG-63细胞凋亡率为5.93%,而联合应用塞来昔布50μmol/L或100 μmol/L后,凋亡率分别为6.66%和37.15%,与顺铂联合具有明显的协同作用;COX-2蛋白表达未降低.塞来昔布联合顺铂明显降低P13K/Akt、survivin、Bcl-2的表达,检测到caspase-9、caspase-3的激活和PARP裂解片段.Wortmannin作用MG-63细胞48 h,检测到pAkt(Thr308)、Bcl-2、survivin表达下调.结论 塞来昔布可通过非COX-2途径诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡,与P13K/Akt、survivin、Bcl-2蛋白相关,并且PI3K/Akt途径在survivin、Bcl-2表达调控中发挥重要作用.这可能是塞来昔布药物干预的中心环节.     

不同转移特性人成骨肉瘤MG-63细胞亚系的建立及特征

目的：建立高低不同转移特性人成骨肉瘤MG-63细胞亚系并研究其生物学特性。方法：通过体外克隆技术和体内移植，筛选并建立了6个细胞亚系，测量其细胞电泳率，细胞增殖率，利用琼脂克隆形成实验和裸鼠体内成瘤实验，比较各细胞亚系的转移特性。结果：A2、A3、A16亚系的细胞电泳率、细胞增殖率、琼脂克隆形成能力和肺转移灶形成率均明显高于A1、A6、A20亚系。结论：通过体外克隆技术和体内移植的方法可建立不同转移特性的MG-63细胞亚系，有助于骨瘤转移机理的进一步研究。     

肼苯哒嗪对人骨肉瘤细胞的生长抑制及对WWOX基因的调控作用研究

 目的 通过观察肼苯哒嗪、5’-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷酸(5’-aza- 2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)及其联合使用对人成骨肉瘤细胞MG-63的生长抑制作用,并检测对骨肉瘤细胞中WWOX基因表达的调控作用,初步明确肼苯哒嗪对骨肉瘤细胞的作用机制。方法 取对数生长期的人骨肉瘤细胞株MG-63制成细胞悬液,计数板计数5×10⁴个/ml,加入96孔板。分为肼苯哒嗪组(药物浓度为0.1、l.0、10 μmol／L)、5-Aza-CdR组(药物剂量为5、10、20 μmol／L)、肼苯哒嗪联合5-Aza-CdR组(药物剂量为0.1　μmo/L+5 μmo/L、l.0 μlmol／L+10 μlmol／L、10 μmol／L+20 μmol／L)及对照组(培养基)。噻唑蓝(MTT)比色法检测药物对MG-63细胞生长抑制作用;流式细胞仪检测药物对细胞周期分布作用及凋亡影响; Real-Time PCR 技术检测WWOX mRNA表达改变情况;Western-blot检测药物处理后各组细胞中WWOX蛋白表达水平。结果 肼苯哒嗪、5-Aza-CdR及其联合应用对MG-63细胞的增殖均有明显抑制作用,且呈浓度依赖性并与作用时间相关;联合应用较单用抑制作用明显增强,且各组差异有统计学意义。肼苯哒嗪、5-Aza-CdR可诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡,联合应用时诱导凋亡作用加强。肼苯哒嗪、5-Aza-CdR对骨肉瘤MG-63细胞中WWOX 基因表达有促进作用,联合作用使WWOX表达明显增强。结论 肼苯哒嗪可明显抑制骨肉瘤细胞的增殖并诱导其凋亡,并促进WWOX基因的表达,其作用机制可能为肼苯哒嗪能够使抑癌基因WWOX基因甲基化状态逆转,表达增加,从而抑制MG-63细胞的增殖。     

Notch1 siRNA对乏氧环境骨肉瘤细胞MG-63增殖及周期的影响

[目的]探讨Notch1 siRNA对乏氧环境人骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖和周期的影响。[方法]将骨肉瘤细胞株MG-63细胞置于乏氧(37℃、1%O2、5%CO2)环境下培养作为实验组,以正常氧环境(37℃、21%O2、5%CO2)下培养作为对照组,培养72 h,应用MTT方法检测不同时间乏氧培养对MG-63细胞增殖的影响;采用Notch siRNA转染乏氧环境中的MG-63细胞,MTT方法检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞周期的变化;Western blot检测细胞HIF-1a、Notch1蛋白表达变化。[结果]乏氧培养可促进MG-63细胞增殖,48 h常氧及乏氧对细胞增殖的作用可见明显差异(2.164±0.075 vs 1.421±0.086)(P<0.01)。流式细胞分析显示实验组、对照组MG-63细胞培养48 h G1/G2期细胞比例分别为(41.79±3.25)%和(53.87±2.31)%(P<0.05),乏氧可以促进细胞周期进展,Notch1 siRNA有效下调乏氧MG-63细胞Notch1蛋白表达,Notchl siRNA作用48 h后乏氧环境MG-63细胞周期阻滞于G1/G2期。Western-blot结果显示乏氧环境下MG-63细胞HIF-1a、Notch1蛋白表达增高。[结论]乏氧环境能通过促进MG-63细胞周期进展,从而明显促进细胞增殖,阻断Notch可逆转乏氧对MG-63细胞促增殖作用,提示Notchl是治疗骨肉瘤的有效分子靶点。