随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＥＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射生标记制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶ ＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｍｇ ＨＣＭＶ ＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。     

Wistar雄性大鼠DNA基因组的多态性分析

使用一种随机引物“Ｐ２（ＣＧＧＣＣＧＧＴＡ）对正常Ｗｉｓｔａｒ雄性大鼠ＤＮＡ基因组进行ＲＡＰＤ－ＰＣＲ分析，扩增产物呈现出多态性ＤＮＡ图谱，其中ＤＮＡ片段分子大小依次为：１４３９、１３３４、１１２２、７０８、５７５、５３７、４７９、３１６ｂｐ。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术简便、快速。     

用PCR技术标记双链DNA探针

利用ＰＣＲ技术制备生物素或地高辛标记的ＤＮＡ探针，经原位杂交试验及敏感性和特异性检测，均取得满意效果，ＰＣＲ标记法具有经济，快速，简易和标记量大等优点，实践中发现Ｂｉｏ／Ｄｉｇ－１１－ＵＴＰ的质量，ｄＴＴＰ和Ｄ－１１－ｄＵＴＰ的比例及起始ＤＮＡ模板浓度是标记成败的关键。     

肾移植供受者DNA水平人类白细胞抗原—DR配型的研究

探讨利用聚合酶链反应方法，进行人类白细胞抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ基因分型，并应用于肾移植临床的可行性，以准确选择理想配型的供受者，提高移植物长期存活率。方法作者应用分子生物学术技术根据，ＨＬＡ－ＤＲ核苷酸序列设计合成了３０个特异引物，快速盐析法提取模板ＤＮＡ，用分子生物学技术根据ＨＬＡ－ＤＲ核苷酸序列设计合成３０个特异引物，盐析法提取模板ＤＮＡ，借助ＰＣＲ技术建立ＰＣＲ－ＳＳＰ方法，对１７１例紧移植供     

双带PCR提高检测血清HBV—DNA质量的意义

应用双带ＰＣＲ方法（ＤＢ－ＰＣＲ）检测了２４０份血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ。该方法能直接观察和判断假阴性和假阳性结果，提高了检测的准确性，与国内其它ＰＣＲ试剂比较，符合率分别为９４．０５％（ＤＢ－ＰＣＲ／华美产品）和９５．２８％（ＤＢ－ＰＣＲ／长城产品），ＨＢｅＡｇ阳性的血清，经ＤＢ－ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者达９３．５５％（２９／３１）ＰＣＲ产物Ｓｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔ后能与ＨＢＶ－ＤＮＡ探针杂交。     

应用PCR技术检测慢性乙肝病毒性肝病血清及外周血单个核细胞中HBV－DNA

本文应用多聚酶连反应（ＰＣＲ）技术检测了１０４例慢性乙肝病毒性肝病患者血清及外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中ＨＢＶ－ＰＮＡ，并与放免法进行了比较。结果显示，ＰＣＲ检测结果更能客观地反应ＨＢＶ在体内存在的状态，在外周血单个核细胞中有ＨＢＶ感染；１０４例慢性肝病患者外周血单个核细胞中ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出率为２８．８％，而血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ阴性的２０例患者有７例ＰＢＭＣ中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ，占３５％。因此，在检测血清ＨＢＶ标志物及ＨＢＶ－ＤＮＡ的同时检测ＰＢＭＣ中的ＨＢＶ－ＤＮＡ可进一步防止ＨＢＶ传播与输血后肝炎的发生。     

兔的单引物PCR指纹分析

本研究结合ＤＮＡ指纹杂交和随机扩增多态性ＤＮＡ(ＲＡＰＤ)技术 ,探索了适用于动物基因组的操作简捷、快速以及敏感性可靠性强的分子标记方法———单引物ＰＣＲ指纹技术。应用单引物ＰＣＲ指纹技术 ,采用的 1条小卫星引物Ｍ13(5′ＧＡＧＧＧＴＧ ＧＣＧＧＴＴＣＴ3′)和 2条微卫星引物 { (ＧＴＧ) 5、(ＧＡＣＡ) 4}对Ｖｃ Ⅰ系、Ｖｃ Ⅱ系獭兔、日本大耳白兔 (ＺＤＢ)和青紫蓝 (ＱＺＬ)四个品系各8只 ,总计 32个个体的遗传结构进行了分析。根据结构应用ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃＣｏｍｐｕｔｅｒＴｏｏｌｓ软件计算出四个品系间及 32个个…     

恙螨RAPD—PCR初步研究

通过制备恙螨的基因组ＤＮＡ，利用一组１０个碱基序列的单链随机引物，建立恙螨的随机引物ＤＮＡ多态性分析技术（ＲＡＰＤ－ＰＣＲ），为恙螨的种间、种内、种下、种群之间的分子分类、遗传特性、亲缘关系等研究打基础。本研究筛选出Ｎ０１，Ｎ０５，Ｎ０８，Ｎ１０４个随机引物，较适的缓冲液ｐＨ值，Ｍｇ＾２＋浓度和模板ＤＮＡ浓度，以及ＰＣＲ实验参数。     

肾移植供受者DNA水平人类白细胞抗原－DR配型的研究

探讨利用聚合酶链反应方法（ＰＣＲ－ＳＳＰ），进行人类白细胞抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ基因分型，并应用于肾移植临床的可行性，以准确选择理想配型的供受者，提高移植物长期存活率。方法作者应用分子生物学技术根据ＨＬＡ－ＤＲ核苷酸序列设计合成３０个特异引物，快速盐析法提取模板ＤＮＡ，借助ＰＣＲ技术建立ＰＣＲ－ＳＳＰ方法，对１７１例肾移植供受者和１４份标准ＤＮＡ进行ＨＬＡ－ＤＲ基因水平分型。扩增条件为９４℃、３０秒、６０℃、５０秒，７２℃、４０秒，共３４个循环。分型结果采用标准ＤＮＡ，限制性内切酶分析和特异性探针杂交等予以确证。结果所有１７１份样本和１４份标准ＤＮＡ采用ＰＣＲ－ＳＳＰ进行ＨＬＡ－ＤＲ基因分型均获成功。特异性扩增产物与引物设计预期大小相同，无假阳性和假阴性，总耗时５小时。分型结果经标准ＤＮＡ、内切酶分析和探针杂交等证实符合，特异性和重复性为１００％。结论ＰＣＲ－ＳＳＰ用于ＨＬＡ－ＤＲ基因分型是一种快速而精确的方法，适合于器官移植，尤其是尸肾移植供受者配型选择的临床应用。     

高效单链DNA探针在β－珠蛋白基因表达调控研究中的应用

直接以克隆的逆病毒载体为模板，在反应管中加入适当比例的α－３２Ｐ－ｄＡＴＰ及其他三种ｄＮＴＰ，以单引物进行线性聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增，标记与扩增同时进行，经过一轮ＰＣＲ（５０次循环），可得到高度特异及高效的单链ＤＮＡ探针。作者已将其成功地应用于人类β－珠蛋白基因表达调控的研究。     

半套式PCR和DNA探针技术检测Q热立克次体

目的 建立半套式PCR和DNA探针技术由于检测Q热立克次体。方法 依据已知的Q热立克次体的16S和23S rRNA基因及其间区的序列。设计3条引物,建立了扩增16S－23S mRNA基因间区的半套式PCR方法,并将扩增片段制成探针,建立了斑点杂交技术。结果 10株Q热立克次体分离株均可扩增出572bp的PCR条带,而对照菌都为阴性,此半套式PCR方法的灵敏度高达1pg;用九里株扩增片段标记后制成的探针,与10个Q热立克次体分离株的全DNA呈阳性杂交,对照菌为阴性,此杂交方法的灵敏度为0．5ng。结论 基于Q热立克次体16S－23S rRNA基因间区的半套式PCR和DNA探针技术具有较好的特异性和灵敏度,可联合应用于Q热的病原学诊断。     

用PCR和地高辛标记的核酸杂交技术检测女性下生殖道人乳头瘤病毒感染

应用多聚酶链反应(polymerase chain reaction)和地高辛标记的HPVDNA的斑点及Southernblot杂交3种方法,同时检测了17例外阴和宫颈湿疣的标本.检测结果表明PCR结合地高辛标记的斑点杂交技术是目前检测女性下生殖道人乳头瘤病毒HPV感染较为敏感、特异、简便的分子生物学方法.因杂交中所使用的HPVDNA探针为非放射性标记的,弥补了³²P标记探针的缺点,可制成试剂盒在临床推广、应用.从而为临床对HPV感染的诊断提供一条有效的检测方法.     

用PCR和地高辛标记的核酸杂交技术检测女性下生殖道人乳头瘤病毒感染

应用多聚酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）和地高辛标记的ＨＰＶＤＮＡ的斑点及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交３种方法，同时检测了１７例外阴和宫颈湿疣的标本。检测结果表明ＰＣＲ结合地高辛标记的斑点杂交技术是目前检测女性下生殖道人乳头瘤病毒ＨＰＶ感染较为敏感、特异、简便的分子生物学方法。因杂交中所使用的ＨＰＶＤＮＡ探针为非放射性标记的，弥补了３２Ｐ标记探针的缺点，可制成试剂盒在临床推广、应用。从而为临床对ＨＰＶ感染的诊断提供一条有效的检测方法。     

碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒DNA方法的建立及应用

目的 :建立碱性磷酸酶直接 (AlkPhosDirec)标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸 (DHBVDNA)方法。方法 :应用AlkPhosDirec[TM] 将碱性磷酸酶直接标记纯化的DHBVDNA全基因制备探针 ,与目标核酸杂交后加入CDP -Star化学发光试剂 ,用胶片放射自显影检测DHBVDNA。同时检测了探针的灵敏度和特异性。比较了AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针与地高辛标记的DHBVDNA探针检测鸭血清标本 10 0份结果。并用AlkPhosDirec标记探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸的方法考核了活性肽类物质保尔佳 (Polyerga)及其 8种单体体内抗鸭乙型肝炎病毒作用。 结果 :探针灵敏度为10 pg ,无非特异性的结果出现 ,与地高辛探针比较 ,用AlkPhosDirect标记探针检测方法的敏感性为 10 0 % ,特异性为 10 0 % ,符合率为 10 0 % ;抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验表明 ,保尔佳 0 0 1号单体 (CMS0 0 1)能使血清中DHBVDNA明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸方法灵敏、特异 ,与地高辛标记的DHBVDNA探针检测结果完全相符合 ,可作为药物抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验疗效评价的手段。     

淋球菌隐蔽性质粒cppB基因探针=制备及初步应用的研究

应用碱变性法从淋球菌Ｄ参考菌株获得４．２ｋｂ隐蔽性质粒ＤＮＡ，通过ＰＣＲ方法扩增该质粒６２３ｂｐｃｐｐＢ基因，采用ＤＮＡ直接酶标－化学发光自显影技术标记ｃｐｐＢ基因探针，通过斑点及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交加以鉴定并初步应用于临床标本检测。旨在为临床淋病实验室诊断提供一个简便，快速方法。     

PCR引物法及随机引物法标记cDNA探针杂交效率的研究

目的 :为提高原位杂交所用cDNA探针的杂交效率。方法 :采用正义引物PCR法及正义、反义引物PCR法制备地高辛 (Dig)标记的TGF_βcDNA探针。同时采用常规的随机引物法标记上述探针。用斑点杂交及原位杂交法比较三者的效率。结果 :在斑点杂交中 ,正义引物PCR法所标记的单链探针的杂交效率最高 ,高于随机引物法一个数量级。在探针浓度相同条件下 ,正义引物PCR法标记探针的原位杂交效果优于随机引物法标记的探针。正义和反义引物PCR法标记的双链探针的杂交效率次于正义引物PCR法所标记的单链探针     

PCR检测细粒棘球蚴及DIG标记DNA杂交诊断技术的建立

目的：该项研究旨在探讨聚合酶链反应（PCR）技术在细粒棘球蚴检测和诊断中的应用，同时建立Digoxinum(DIG）标记DNA杂交诊断技术。方法：根据细粒棘球蚴基因片断克隆与序列分析，设计了一对特异性引物，P15‘－GGAATGGAGAGAAGTTAC－3‘，P25’－GCAACCTCCGGAACTTGC－3’。以棘球蚴的囊液、子囊及原头蚴为模板，经PCR扩增获得471bp特异性区带。将扩增产物纯化后，用DIG标记DNA，制备成功特异性核酸探针并用于细粒棘球蚴检测。结果：经对大肠杆菌、痢疾杆菌、结核分枝杆菌、猪囊尾蚴、健康人白细胞进行PCR扩增和DIG标记DNA探针斑占交，只有细粒棘球蚴出现单一471bp特异性区带。PCR的灵敏性为可检出单个原头蚴及100-10fg水平的DNA，而斑点杂交的特异性为2500fg。异源性DNA即使提高点膜量，亦不呈现阳性反应。结论：配以DIG标记的PCR技术在细粒棘球蚴的检测中具有特异、敏感、快速、准确的特点。为包虫病的早期诊断和流行病学调查可提供科学依据。     

DETECTION OF HUMAN CYTOMEGALOVIRUS INFECTION BY DNA-DNA HYBRIDIZATION

A rapid detection method has been established to identify human cytomegalovirus (HCMV) in specimens of urine and white blood cells with use of DNA-DNA hybridization technology. Since radioactive labels should be avoided if possible, the DNA-DNA hybridization procedure has also been modified to employ biotin labelled probe. Preliminary experiments for sensitivity and specificity showed that hybridization with the probe HCMV DNA EcoRI J fragment could detect 0.9 pg (~(32)P-probe) or 90 pg (biotin-probe) homologous DNA; 60 cells (~(32)P-probe) or 325 cells (biotin-probe) of HCMV infected fibroblasts, and 0.3125 TCID_(50) HCMV-AD_(169). The labelled probe failed to hybridize to DNA from ather herpesviruses, uninfected human lung fibroblasts and human placental DNA. Some specimens have been detected for HCMV by DNA hybridization with ~(32)P-probe. Of 76 urine specimens and 46 white blood cell specimens from 51 newborn infants with clinically suspected cogenital HCMV infection, 11 (12%) and 9 (19%) were positive for HCMV DNA, respectively. Of 11 white blood cell specimens from normal women of childbearing age and 47 white blood cell specimens from blood donors, 6 (55%) and 30 (63%) were positive for HCMV DNA, respectively.     

用聚合酶链反应检测宫颈癌组织中人巨细胞病毒DNA相关序列

为建立检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）感染的ＰＣＲ方法并探讨ＨＣＭＶ与宫颈癌的关系，从石蜡包埋和活检宫颈癌组织中提取ＤＮＡ，用聚合酶链反应体外扩增ＨＣＭＶＥｃｏＲＩＤ片段上一段长１５２ｂｐ的核酸序列，再用地高辛末端转移酶标记法标记和扩增片段互补的ＨＣＭＶ寡核苷酸探针，用该探针证实扩增片段的特异性。检测宫颈癌标本４３例，阳性率为２５．６％（１１／４３），正常宫颈组织８例，阳性率为０。宫颈癌标本阳性率高于正常宫颈标本，提示ＨＣＭＶ与宫颈癌的发生有关。