迷迭香酸激活Parkin介导的线粒体自噬并抑制高糖诱导的心肌细胞肥大

目的 评估迷迭香酸对高糖培养下心肌细胞线粒体自噬水平以及细胞肥大的影响。方法 体外培养H9c2大鼠心肌母细胞,分为对照组（葡萄糖5.5 mmol/L）、高糖组（葡萄糖25 mmol/L）、高糖+迷迭香酸组（葡萄糖25 mmol/L+迷迭香酸50 μmol/L）、高糖+迷迭香酸+Parkin-siRNA组（葡萄糖25 mmol/L+迷迭香酸50 μmol/L+Parkin-siRNA转染）;Western blot法测定PINK1、Parkin、LC3II/LC3I蛋白表达水平,透射电子显微镜下观察线粒体自噬体形成情况,流式细胞术检测活性氧物质（ROS）与凋亡水平,分光光度法检测细胞线粒体呼吸链复合酶活性,荧光酶标法检测线粒体膜电位水平,3H-亮氨酸标记法检测细胞蛋白质合成速率,光学显微镜下检测心肌细胞表面积。结果 迷迭香酸可提高高糖培养下心肌细胞内PINK1、Parkin、LC3-II/LC3-I蛋白表达水平（P<0.05）,增多线粒体自噬体数量,并抑制高糖诱导的ROS生成、恢复线粒体呼吸链复合酶活性与线粒体膜电位水平（P<0.05）,抑制高糖诱导的细胞凋亡（P<0.05）,并降低心肌细胞表面积与蛋白质合成速率（P<0.05）。利用Parkin-siRNA抑制心肌细胞线粒体自噬,则阻断了迷迭香酸对高糖培养下心肌细胞氧化应激与心肌细胞肥大的保护作用（P<0.05）。结论 迷迭香酸可通过激活Parkin介导的线粒体自噬,对高糖诱导心肌细胞的氧化应激损伤有保护作用,并改善心肌细胞肥大。     

miR-1通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对高糖诱导的H9c2心肌细胞自噬的影响

目的 探讨miR-1对高糖诱导的H9c2心肌细胞自噬及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的影响。方法H9c2细胞随机分为4组。正常组使用普通培养基培养,未转染;诱导组使用含33 mmol/L葡萄糖的培养基诱导,未转染;miR-1 NC组使用含33 mmol/L葡萄糖的培养基诱导,转染miR-1 NC;miR-1 inhibitor组使用含33 mmol/L葡萄糖的培养基诱导,转染miR-1 inhibitor。在加入葡萄糖诱导前48 h,使用Lipofectamine 3000转染试剂盒进行转染。实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测H9c2细胞和高糖诱导的H9c2细胞中miR-1表达水平;CCK-8法检测各组H9c2细胞增殖活性;蛋白免疫印记法（Western blot）检测各组H9c2细胞中Beclin1、p65、PI3K蛋白表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以及AKT、mTOR蛋白磷酸化水平;生物信息学预测和双萤光素酶验证miR-1和PI3K的靶向关系。结果与正常组相比,诱导组的H9c2细胞中,miR-1表达水平显著升高（P<0.05）,PI3K蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。与正常组相比,诱导组H9c2细胞Beclin1蛋白表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高,自噬小体增多,细胞增殖率、p62蛋白表达以及PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平显著降低（P<0.05）;与诱导组和miR-1 NC组相比,miR-1 inhibitor组H9c2细胞miR-1水平、Beclin1蛋白表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低,自噬小体减少,细胞增殖率、p62蛋白表达以及PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.05）;miR-1和PI3K间存在靶向关系。结论在高糖诱导的H9c2细胞中,miR-1表达水平升高,抑制miR-1,可通过靶向激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,抑制高糖诱导的H9c2心肌细胞自噬。     

高剂量葡萄糖对小鼠肌管细胞自噬表达的影响

目的：探讨高剂量葡萄糖对肌管细胞自噬表达的影响。方法：使用分化培养基诱导小鼠成肌细胞分化成肌管细胞,分正常剂量（5.5 mmol/L）和高剂量（17 mmol/L和30 mmol/L）葡萄糖浓度的3组培养基培养肌管细胞,于6、12、24、36、48、60、72 h后分别收集细胞,检测自噬相关蛋白和mRNA表达量,并用串联荧光标记LC3（mRFP-GFP-LC3）慢病毒转染小鼠成肌细胞,动态监测自噬流。结果：高剂量葡萄糖条件下肌管细胞自噬表达存在2个阶段,30 mmol/L组培养24 h自噬表达下降,LC3和Beclin-1蛋白表达水平比5.5 mmol/L组低（P＜0.05）;而在30 mmol/L葡萄糖条件下培养48、60和72 h后自噬水平增强,LC3和Beclin-1的基因表达均明显升高（P＜0.05）。肌管细胞GFP和RFP荧光斑点的定位与数量分析也证明30 mmol/L葡萄糖浓度的培养基培养48、60和72 h后可显著增加自噬体和自噬溶酶体的合成。结论：高剂量葡萄糖对肌管细胞自噬表达有重要影响,不同时间自噬表达存在差异,长期高血糖状态可诱导自噬过度活化。     

低糖培养对H9c2心肌细胞的自噬功能和细胞凋亡的影响

目的 研究低糖培养对H9c2心肌细胞自噬活性的影响及此时自噬功能对细胞凋亡水平的影响。方法 用33.3mmol/L葡萄糖浓度的培养基培养H9c2细胞后用2.5mmol/L葡萄糖浓度培养基处理细胞4h作为低糖组（LG组）,高糖组（HG组）维持33.3mmol/L的葡萄糖浓度,对照组（Con组）维持5.5mmol/L的葡萄糖浓度;LG组加入自噬抑制剂3-MA作为抑制剂组（LG+3-MA组）。采用LDH检测试剂盒检测细胞毒性;MTT法检测H9c2细胞增殖能力; Western blot法检测caspase3、LC3、Beclin-1的表达量。结果 与Con组和HG组相比,LG组LDH活性显著增加,细胞增殖能力显著降低,caspase3、LC3-Ⅱ和Beclin-1表达显著增加;而与LG组比较,抑制剂组LC3-Ⅱ、Beclin-1表达降低,同时caspase3以及细胞毒性降低,细胞活力增加。结论 低糖培养通过激活H9c2心肌细胞的自噬活性引起细胞凋亡。     

高糖后低糖过程通过ERK1/2信号途径增强H9c2心肌细胞自噬的功能

目的 研究高糖后低糖H9c2心肌细胞自噬活性的影响及ERK1/2在此过程中对自噬的调节作用。方法 用25mmol/L葡萄糖浓度的培养基培养H9c2细胞后用2.5mmol/L葡萄糖浓度培养基处理细胞2h作为低糖组（LG组）,高糖组（HG组）维持25mmol/L的葡萄糖浓度,空白对照组（Con组）维持5.5mmol/L的葡萄糖浓度;低糖组加入ERK抑制剂U0126作为抑制剂组。采用MTT法检测H9c2细胞增殖能力;LDH检测试剂盒检测细胞毒性;Western blot法检测 ERK、p-ERK、LC3、Beclin-1的表达量。结果 与Con组和HG组相比,LG组细胞增殖能力降低,LDH活性增加;与Con组相比,HG组LC3-Ⅱ、Beclin-1表达量升高,p-ERK表达无显著改变;与Con组和HG组相比,LG组p-ERK、LC3-Ⅱ和Beclin-1表达显著增加;而与LG组比较,抑制剂组p-ERK明显降低,同时LC3-Ⅱ、Beclin-1表达以及细胞毒性降低,细胞活力增加。结论 ERK1/2信号途径促进了高糖后低糖过程中H9c2心肌细胞的自噬活性。     

法舒地尔对高糖培养肾小管上皮细胞增殖和纤维化的影响#br#

目的：探讨法舒地尔（Fasudil）对高糖培养的肾小管上皮细胞（HK-2）增殖和纤维化的影响。方法：将HK-2细胞分为正常对照组（NG组,葡萄糖浓度5.5 mmol/L）、高张组（HM组,葡萄糖浓度5.5 mmol/L+甘露醇54.5 mmol/L）、高糖组（HG组,葡萄糖浓度60 mmol/L）、高糖+小剂量法舒地尔干预组[FA（5）组,D-葡萄糖60 mmol/L+法舒地尔5μmol/L]、高糖+中剂量法舒地尔干预组[FA（10）组,D-葡萄糖60 mmol/L+法舒地尔10μmol/L];⑥高糖+大剂量法舒地尔干预组[FA（20）组,D-葡萄糖60 mmol/L+法舒地尔20μmol/L]。四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定HK-2细胞增殖;免疫共沉淀法检测p-MYPT1-Thr853;Western印迹法检测结缔组织生长因子（CTGF）的表达;ELISA法检测细胞培养上清液转化生长因子β1（TGF-β1）和纤维连接蛋白（Fn）的含量。结果：与NG组比,HG组HK-2细胞出现增殖增加,p-MYPT1-Thr853、TGF-β1、CTGF和Fn的表达增加。与HG组比,FA（5）组、FA（10）组、FA（20）组均抑制了HK-2细胞的过度增殖,p-MYPT1-Thr853、TGF-β1、CTGF和Fn的表达均减少。结论：法舒地尔可能通过抑制Rho激酶活性抑制高糖培养的肾小管上皮细胞增殖和纤维化。     

姜黄素对高糖诱导人肾小管上皮细胞线粒体自噬的影响

目的:观察姜黄素(Curcumin, Cur)对高糖环境下人肾小管上皮细胞(Human kidney 2,HK-2)线粒体自噬及氧化应激的影响,探究姜黄素对HK-2细胞的保护作用及机制。方法:体外培养HK-2细胞,随机分为4组：对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)、姜黄素组(5.5 mmol/L葡萄糖+10μmol/L姜黄素)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、姜黄素高糖组(30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L姜黄素)。各组干预刺激48 h,收集细胞的总蛋白,采用Western blot检测线粒体自噬相关蛋白Pink1、Parkin、LC3B以及beclin1的表达;JC-1检测各组线粒体膜电位水平;采用活性氧检测试剂盒检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)生成情况。结果:与对照组比较,姜黄素组各项指标无明显改变(P>0.05);与姜黄素组比较,高糖组Pink1、Parkin、LC3B、beclin1蛋白表达降低(P<0.01),细胞内ROS表达升高(P<0.01),线粒体膜电位活性下降(P<0.01);与高糖组比较...     

高糖条件下沉默LRP6通过Wnt/β-catenin途径抑制大鼠视网膜Müller细胞的自噬与凋亡

目的:探究在高糖作用下大鼠视网膜Müller细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的表达及其对高糖条件诱导的Müller细胞自噬与凋亡的作用和机制。方法:体外培养大鼠视网膜Müller细胞,采用RT-PCR与Western blotting检测高糖条件下Müller细胞中LRP6 mRNA和蛋白的表达水平;利用siRNA干扰技术沉默Müller细胞中的LRP6,并分别在葡萄糖浓度为5.6 mmol·L^-1(NG)与35 mmol·L^-1的DMEM培养液(HG)中进行培养,按处理方式的不同将Müller细胞分为葡萄糖浓度为5.6 mmol·L^-1的DMEM培养的正常葡萄糖组(NG组)、葡萄糖浓度为35 mmol·L^-1的DMEM培养的转染si-NC组(HG+si-NC组)和si-LRP6的Müller细胞组(HG+si-LRP6组);采用Western blotting检测各组Müller细胞中自噬相关蛋白P62的表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ之值、Beclin1与Atg12-Atg5复合体的表达;共...     

线粒体ALDH2对高糖处理的乳鼠心肌成纤维细胞中自噬相关蛋白影响

目的探讨自噬是否介导乙醛脱氢酶（ALDH）2对高糖处理的乳鼠心肌成纤维细胞的作用。方法无菌条件下取出生3d内 SD大鼠乳鼠心脏,剪碎并用胰蛋白酶和胶原酶2混合酶消化成单个细胞,经差速贴壁后并传代培养,当传至3代时进行处理。应 用免疫荧光检测培养的乳鼠心肌成纤维细胞内波形蛋白以此鉴定原代培养心肌成纤维细胞纯度;实验涉及如下分组：5.5 mmol/L 糖对照组（F）、30 mmol/L高糖组（FH）、30 mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2激动剂（Alda-1）组(FHA)、30 mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2 抑制剂（Daidzin）组（FHD）、30 mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2激动剂（Alda-1）和乙醛脱氢酶2抑制剂（Daidzin）（FHAD）;Western blot检测ALDH2、微管相关蛋白1轻链3B亚基（LC3B）、Beclin-1的蛋白表达;羟脯胺酸试剂盒测定细胞培养液中羟脯胺酸含量; CCK-8试剂盒测定心肌成纤维细胞增殖能力。结果与F组相比,FH组ALDH2蛋白表达降低,Beclin-1、LC3B蛋白表达降低,细 胞培养上清液内羟脯胺酸含量、细胞数目增高;与FH组相比,FHA组Beclin-1、LC3B蛋白表达、ALDH2蛋白表达增加,细胞数 目、细胞内羟脯胺酸含量降低,与此同时FHD组ALDH2蛋白及Beclin-1、LC3B表达降低,细胞数目、细胞内羟脯胺酸含量增高。 结论线粒体ALDH2抑制高糖诱导的乳鼠心肌成纤维细胞增殖作用,其机制可能与ALDH2对自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B的 上调作用有关。     

黄芪甲苷对高糖诱导肾小管上皮细胞凋亡及线粒体自噬相关蛋白表达的影响

【目的】探讨黄芪甲苷对高糖诱导肾小管上皮细胞凋亡及线粒体自噬相关蛋白表达的影响。【方法】将大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E分为3组:正常对照组、高糖刺激组(给予葡萄糖30 mmol/L,作用48 h)及黄芪甲苷干预组(给予葡萄糖30 mmol/L刺激的同时加用黄芪甲苷100μmol/L,48 h)。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞增殖能力;采用Westernblot法检测促凋亡蛋白cleaved-caspase-3及同源性磷酸酶张力蛋白诱导的激酶1(PINK1)/帕金蛋白(Parkin)介导的线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的表达。【结果】黄芪甲苷可有效缓解高糖对细胞增殖的抑制作用(P 0.01)。高糖可上调NRK-52E细胞促凋亡蛋白cleaved-caspase-3,线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin的表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(均P 0.01);而黄芪甲苷干预可显著下调上述促凋亡蛋白及线粒体自噬相关蛋白的表达(P 0.05或P 0.01)。【结论】黄芪甲苷可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞NRK-52E的凋亡,减轻其由PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。     

IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白降低软骨细胞的自噬功能

目的 探究肌醇依赖性激酶1α（IRE1α）通过调控内质网钙稳态蛋白（CHERP）影响软骨细胞自噬功能的相关机制。方法 衣霉素（TM）处理人软骨细胞C28/I2,Western blot检测不同时间点的内质网应激和自噬相关蛋白指标。4μ8c、雷帕霉素（Rapa）处理C28/I2（分为：NC组、4μ8c组、Rapa组、4μ8c+Rapa组）,Western blot检测自噬相关蛋白指标。分别从软骨组织特异性ERN1基因敲除小鼠（ERN1 CKO）和对照小鼠（Control）软骨组织分离原代软骨细胞,qPCR检测ERN1及自噬相关蛋白ATG5、ATG7的mRNA 水平,Western blot 检测 IRE1α/p- IRE1α、CHERP 表达水平,流式细胞术检测胞内钙离子含量。巴佛洛霉素 A1 （Bafilomycin A1）处理原代软骨细胞（分为Control组、Control+Bafilomycin A1组、ERN1 CKO组、ERN1 CKO+Bafilomycin A1 组）,Western blot检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的表达。自噬双荧光病毒在Rapa处理下检测自噬流（分为Control+Rapa组、ERN1 CKO+Rapa组）。C28/I2中过表达CHERP与IRE1α,免疫荧光检测自噬水平。结果 TM处理C28/I2细胞后,内质网应激相关标志蛋白表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）,p62表达下调（P<0.05）。相较对照组,Rapa上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（P<0.001）,4μ8c+Rapa组相较Rapa组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P<0.05）。相较于对照组,原代软骨细胞中敲除ERN1/IRE1α后,ERN1（P<0.01）、ATG5（P<0.001）、ATG7（P<0.001）mRNA水平显著下调。IRE1α/p-IRE1α蛋白表达缺失或显著下调（P<0.01）,CHERP蛋白表达上调（P<0.05）,胞内钙离子含量显著上升（P<0.001）。巴佛洛霉素 A1 处理原代软骨细胞后,Control+Bafilomycin A1 组较Control组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.01）,ERN1 CKO+Bafilomycin A1组较ERN1 CKO组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）、较Control+Bafilomycin A1组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降（P<0.05）。自噬双荧光病毒处理后,ERN1 CKO+Rapa组较Control+Rapa组未淬灭LC3-GFP荧光增强（P<0.05）。C28/I2细胞中过表达CHERP降低LC3荧光强度,过表达IRE1α增强LC3荧光表达并能部分挽救CHERP导致的荧光降低情况。结论 IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白,升高胞内钙离子含量,进一步导致软骨细胞的自噬功能受损。     

lncRNA MEG3调控mTOR介导的自噬在糖尿病心肌病中的作用

目的 探究lncRNA MEG3调控mTOR介导的自噬在糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)中的作用。方法构建C57BL/6 DCM小鼠模型,设置正常组和DCM组,心脏超声和Masson染色检测小鼠左心房功能结构变化。实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测lncRNA MEG3在小鼠心肌组织中的表达水平,Western blot法检测p62、LC3-Ⅱ、Beclin1、p-mTOR、mTOR表达量。分离C57BL/6小鼠乳鼠心肌细胞,高糖诱导心肌细胞损伤。转染si-NC、si-MEG3后高糖处理,设置为正常组、高糖组、高糖+si-NC组、高糖+si-MEG3组,RT-qPCR检测lncRNA MEG3在心肌细胞的表达水平,Western blot法检测p62、LC3-Ⅱ、Beclin1、p-mTOR、mTOR、p-ERK、ERK表达量。CCK-8、LDH、ROS、GSH-Px试剂盒检测心肌细胞损伤。结果 DCM小鼠心功能出现异常。与正常组比较,DCM组小鼠心肌细胞p62表达显著升高,LC3-Ⅱ和Beclin1表达显著降低,p-mTOR表达升高。细胞实验中,高糖诱导的心肌细胞比正常组p62表达显著升高,LC3-Ⅱ和Beclin1表达显著降低,p-mTOR和p-ERK表达升高;细胞活力和GSH-Px活性降低,LDH和ROS活性显著升高。下调lncRNA MEG3后,高糖+si-MEG3组逆转了高糖+si-NC组自噬相关蛋白以及细胞损伤指标的变化。结论 下调lncRNA MEG3抑制了ERK/mTOR信号通路的激活,高糖诱导的心肌细胞自噬得以恢复,且糖尿病心肌损伤被缓解。     

银杏内酯K调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨银杏内酯K（GK）调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响。方法 取对数生长期的MCF-7细胞,设置分组为对照组、GK低浓度（GK-L,12.5 μg/mL）组、GK中浓度（GK-M,25 μg/mL）组、GK高浓度（GK-H,50 μg/mL）组、GK-H+AMPK抑制剂（Compound C,50 μg/mL GK+50 μmol/L Compound C）组。观察各组细胞形态以及细胞增殖、凋亡、自噬状况并分析自噬相关基因LC3、P62、Beclin1 mRNA表达以及AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、LC3、P62、Beclin1表达。结果 与对照组相比,GK-L、GK-M、GK-H组细胞自噬泡数量增多,增殖率、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、p62表达显著下降,凋亡率、LC3、Beclin1表达、AMPK蛋白表达显著增加（P＜0.05）;与GK-H组相比,GK-H+Compound C组细胞自噬泡数量减少,增殖率、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、p62显著增加,凋亡率、LC3、Beclin1表达、AMPK蛋白表达显著降低（P＜0.05）。结论 GK可以诱导乳腺癌细胞自噬和凋亡、抑制其增殖,可能与激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路有关     

棕榈酸通过cGAS-STING-IRF3通路降低心肌细胞的自噬功能

目的 探究棕榈酸（PA）对心肌细胞自噬功能的影响及潜在机制。方法 提取大鼠乳鼠心肌细胞（NRCMs）并体外培养24 h,分别加入 10%BSA 以及不同浓度的 PA（0、0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L）共培养 24 h。Western blotting 检测 NRCMs 中自噬指标（PINK1、Parkin、p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）以及cGAS、STING、p-IRF3/IRF3的蛋白表达水平。CCK8法检测细胞活性,筛选0.7 mmol/LPA用于后续实验。进一步将cGAS siRNA转染入NRCMs中以敲降cGAS的表达,将NRCMs细胞分为：空白对照组（Control组,无特殊处理）、阴性对照组（NC组,转染NC序列）、cGAS siRNA组（转染cGAS-siRNA敲降cGAS）、PA组（0.7 mmol/L PA处理24 h）、cGAS siRNA+PA组（转染cGAS-siRNA后予以0.7 mmol/L PA处理24 h）。Western blot检测NRCMs自噬相关蛋白指标表达变化,CCK8法检测细胞活性,免疫荧光检测p62和LC3阳性着色情况。结果 经不同浓度PA作用24 h后,NRCMs中PINK1、Parkin,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ+Ⅱ蛋白表达量明显降低（P<0.05）,p62蛋白表达量明显增高（P<0.05）,且心肌细胞活性明显下降（P<0.05）。将cGAS敲降后,可明显逆转PA诱导的NRCMs自噬功能降低,并改善心肌细胞活性（P<0.05）。结论 PA通过介导cGAS-STING-IRF3通路激活,抑制心肌细胞的自噬功能,导致细胞活性降低。     

法舒地尔对高糖培养肾小管上皮细胞增殖和纤维化的影响

目的：探讨法舒地尔（Fasudil）对高糖培养的肾小管上皮细胞（HK-2）增殖和纤维化的影响。方法：将HK-2细胞分为正常对照组（NG组,葡萄糖浓度5.5 mmol/L）、高张组（HM组,葡萄糖浓度5.5 mmol/L＋甘露醇54.5 mmol/L）、高糖组（HG组,葡萄糖浓度60 mmol/L）、高糖＋小剂量法舒地尔干预组[FA（5）组,D-葡萄糖60 mmol/L＋法舒地尔5μmol/L]、高糖＋中剂量法舒地尔干预组[FA（10）组,D-葡萄糖60 mmol/L＋法舒地尔10μmol/L];6高糖＋大剂量法舒地尔干预组[FA（20）组,D-葡萄糖60 mmol/L＋法舒地尔20μmol/L]。四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定HK-2细胞增殖;免疫共沉淀法检测p-MYPT1-Thr853;Western印迹法检测结缔组织生长因子（CTGF）的表达;ELISA法检测细胞培养上清液转化生长因子β1（TGF-β1）和纤维连接蛋白（Fn）的含量。结果：与NG组比,HG组HK-2细胞出现增殖增加,p-MYPT1-Thr853、TGF-β1、CTGF和Fn的表达增加。与HG组比,FA（5）组、FA（10）组、FA（20）组均抑制了HK-2细胞的过度增殖,p-MYPT1-Thr853、TGF-β1、CTGF和Fn的表达均减少。结论：法舒地尔可能通过抑制Rho激酶活性抑制高糖培养的肾小管上皮细胞增殖和纤维化。     

高糖对体外培养的足细胞自噬的影响

目的:研究不同葡萄糖浓度?不同作用时间对体外培养的足细胞自噬的影响?方法:体外培养小鼠永生性足细胞系,给予不同浓度的葡萄糖(5.6?11.0?20.0?30.0 mmol/L)刺激,作用时间分别为6?12?24?36 h?Western blot检测足细胞自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ的表达;透射电镜观察足细胞自噬小体的形成;荧光显微镜观察足细胞转染GFP-LC3荧光蛋白后绿色荧光蛋白颗粒的变化?结果:①与0 h相比,30 mmol/L葡萄糖刺激后足细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达随着作用时间的延长逐渐增加,到24 h时增加最明显,差异有显著性(P < 0.05)?24 h时,透射电镜下足细胞自噬小体形成最多;荧光显微镜下足细胞转染GFP-LC3绿色荧光蛋白颗粒最多?②与对照组5.6 mmol/L相比,随着葡萄糖刺激浓度的增加足细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达明显增加,30 mmol/L浓度时最明显,差异有显著性(P < 0.05)?结论:高糖呈浓度和时间依赖性增加体外培养的足细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达?诱导足细胞自噬体的形成?     

含活血通络方血清对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞增殖作用的研究

目的 探究含活血通络方血清调控IncRNA MEG3对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelialcells,hRMECs）增殖及凋亡的影响作用。方法 选取20只SD大鼠,采用随机数字表法对10只大鼠灌胃活血通络方,10只灌胃等量生理盐水。灌胃结束1h后制备相应血清。分别采用5mmol/L葡萄糖或30mmol/L的D-甘露醇、葡萄糖溶液对hRMECs细胞进行诱导24h。按照诱导情况将细胞分为正常对照组（5mmol/L葡萄糖,n=6）、等渗组（30mmol/LD-甘露醇,n=6）、高糖组（30mmol/L葡萄糖,n=6）、高糖+2.5%含药血清组（n=6）、高糖+7.5%含药血清组（n=6）、高糖+10%含药血清组（n=6）,相应血清干预24h。采用CCK-8法、酶联免疫吸附法检测细胞增殖情况及丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase,GSH-Px）含量;采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time fluorescence...     

自噬在葛根素促成骨细胞分化调节中的作用

目的探讨自噬在葛根素调节h FOB1.19人成骨细胞分化过程中的作用。方法将成骨细胞分为A组(成骨分化诱导组)、B组(A组+10^-8 mol/L葛根素3 h)和C组[B组+5 mmol/L自噬抑制剂3-甲基嘌呤(3-MA) 1 h]。采用碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色检测成骨细胞的分化及钙化;透射电镜检测成骨细胞内自噬小体的改变情况;免疫荧光染色检测自噬微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)在细胞内的分布情况;Western blotting检测成骨细胞内成骨分化和自噬相关蛋白的表达情况。结果 ALP和茜素红染色显示,葛根素(10-8 mol/L)能够明显促进成骨细胞的分化,加入3-MA后葛根素的促成骨细胞分化作用受到抑制;葛根素促进成骨细胞自噬小体增加,3-MA抑制自噬小体增加;免疫荧光显示葛根素促进LC3-Ⅱ在细胞核表面的聚集,加入3-MA后,这种现象被抑制;葛根素促进成骨分化蛋白矮小相关转录因子2 (RUNX 2)、骨保护素(OPG)和自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、BECLIN 1的表达,3-MA抑制LC3-Ⅱ和BECLIN 1的表达。结论葛根素通过自噬调节成骨细...     

自噬在电离辐射诱导的小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用

目的 探讨自噬在电离辐射诱导小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用.方法 将小鼠精母细胞GC-2分为空白对照组和不同剂量(2、4和8 Gy)60Co辐射处理组.采用原位末端转移酶标记法(TUNEL法)和流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过蛋白质印迹实验观察自噬相关蛋白LC3(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)和Beclin1表达水平的改变,使用荧光显微镜观察C,C-2细胞内自噬小体的变化.用5mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,观察自噬抑制剂联合电离辐射对细胞凋亡率的影响以及自噬相关蛋白表达水平的改变.结果 与空白对照组相比,GC-2细胞经60Co辐射处理后细胞凋亡率升高(P＜0.05),荧光显微镜下可见细胞自噬体明显增多,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平增加(P＜0.05).预先用5mmol/L 3-MA处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平与未经3-MA处理组相比降低(P＜0.05),细胞凋亡率升高(P＜0.05).结论 电离辐射可以诱导精母细胞发生自噬,抑制细胞自噬后可增强电离辐射对精母细胞的杀伤作用.     

细胞自噬在三氧化二砷诱导肝癌细胞凋亡中的作用研究

【摘要】 目的 研究细胞自噬在三氧化二砷（ATO）诱导的肝癌细胞死亡中的作用,观察调控细胞自噬对ATO诱导的细胞凋亡有何影响。方法 以人肝癌HepG2细胞为研究对象,在ATO作用于HepG2细胞的基础上,加入自噬激动剂〔雷帕霉素（Rap）〕和自噬抑制剂〔三甲基腺嘌呤（3-MA）〕进行调控。以MTT法检测细胞生存率,透射电镜观察自噬体结构,免疫印迹法分析自噬相关蛋白LC-3和Beclin1的表达;流式细胞术检测细胞凋亡。结果 5~20 μmol/L ATO与10 mmol/L 3-MA联用时HepG2细胞存活率比同剂量ATO单独作用时降低（P <0.05）,凋亡率增加（P <0.05）,细胞内呈现典型凋亡反应特征,自噬蛋白LC3和Beclin1表达低于ATO单独作用组（P <0.05）。相反,5~20 μmol/L ATO与0.25 μmol/L Rap联用时,HepG2细胞的存活率比ATO单独作用时显著增加（P <0.05）,凋亡率降低（P <0.05）,细胞内出现大量自噬体结构,自噬蛋白LC3和Beclin1的表达较ATO单独作用组有增加趋势,但差异无统计学意义（P >0.05）。结论 特异性自噬抑制剂能显著增强ATO杀伤肝癌细胞的敏感性,其机制与增强肝癌细胞凋亡有关。