小鼠心肌微血管内皮细胞的体外培养

目的建立小鼠心肌微血管内皮细胞培养体系。方法 4～6周的清洁级C57小鼠的心室肌,利用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶消化过滤收集的滤液进行重新悬浮种植于明胶包被的培养瓶中,通过倒置电镜观察细胞的生长形态及生长状态,得出生长曲线,并利用免疫荧光鉴定(心肌微血管内皮细胞特异性抗原vWF)培养出的小鼠心肌微血管内皮细胞。结果通过形态学观察及免疫荧光鉴定证实为小鼠心肌微血管内皮细胞。培养的小鼠心肌微血管内皮细胞第1、2天生长相对缓慢,而到第3、4天细胞呈对数生长,第6、7天细胞达到融合。结论采用明胶包被培养瓶,通过机械剪切、蛋白酶消化、过滤方法,并进行了相关鉴定,可获得较纯的小鼠心肌微血管内皮细胞,这为研究心肌微血管内皮细胞的迁移、血管再生等提供了实验来源。     

大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧模型的建立

目的 对大鼠的心肌微血管内皮细胞(myocardial microvascular endothelial cells,MMVECs)离体培养方法进行改良,建立该细胞的缺氧模型.方法 取出7日龄左右的Wistar大鼠的心脏,用胰蛋白酶和胶原酶二次消化法获得MMVECs,密度梯度离心法纯化细胞,计算细胞纯度;用免疫细胞化学方法检测微血管内皮细胞特异性第Ⅷ因子、CD34及CD31相关抗原;将原代培养的细胞置于持续通人体积分数为1％O2、5％ CO2和94％N2的自制缺氧装置中,并在37℃孵箱中分别缺氧处理4、6、12、18、24h,各时间段均设置正常对照组;用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验检测缺氧对大鼠MMEVCs增值活力的影响,Hoechst33342染色观察缺氧诱导该细胞凋亡形态学变化.结果 细胞形态特征及相关抗原检测证实:与仅用二次消化法培养细胞相比,密度梯度离心纯化后所得MMVECs纯度提高(P＜0.01);MTT比色实验:随着培养时间的延长,与正常对照组相比,各缺氧组OD值均有所降低,其中缺氧12、18和24h的OD值降低显著(P均＜0.01);从缺氧12h开始,各缺氧组的OD值逐渐降低,与12h相比均有显著差异(P＜0.01或P＜0.05);Hoechst33342染色:缺氧12h细胞开始出现核固缩、碎裂、蓝色浓染等典型的凋亡形态学变化,随着缺氧时间延长该变化更为明显.结论 该原代离体培养方法可以获得纯度较高的MMVECs;缺氧对MMVECs的增殖有抑制作用,本方法可以简便、有效地建立MMVECs的缺氧模型.     

缺氧对大鼠心肌微血管内皮细胞与中性粒细胞粘附的影响

研究缺氧对心肌微血管内皮细胞与中性粒细胞粘附的影响。方法：采用细胞培养技术观察体外培养的心肌微血管ＥＣ与未活化的ＰＭＮ粘附，高倍镜计数粘附的ＰＭＮ数；采用免疫组化ＡＢＣ法检测缺氧微血管ＥＣ上细胞间粘附分子的表达。结果：心肌微血管ＥＣ缺氧２和６ｈ与ＰＭＮ的粘附显著增加，分别为对照组的１．４９倍和１．９６倍；进一步用抗ＩＣＡＭ－１和抗淋巴细胞功能和相关抗原单克隆抗体阻断实验发现，两种抗体在５μｇ／ｍｌ     

小鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定

目的:建立小鼠肺微血管内皮细胞体外分离培养方法及对微血管内皮细胞的鉴定.方法:取小鼠肺组织边缘剪成小块,用含有20%新生牛血清、肝素90μg/mL、L-谷胺酰胺4 mmoL/L、青霉素200 U/mL和链霉素200μg/mL的RPMI-1640培养基进行培养.纯化细胞进行Ⅷ因子相关抗原间接免疫组化染色和透射电镜观察Weilel-palade小体.结果:获得的内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态,Ⅷ因子相关抗原间接免疫组化染色阳性而且在透射电镜观察到Weilel-palade小体.结论:成功建立了小鼠肺微血管内皮细胞体外培养方法,并为体外研究肺微血管内皮细胞提供实验模型.     

原代大鼠心肌微血管内皮细胞培养方法优化

目的 探讨大鼠心肌微血管内皮细胞体外培养方法的改良。方法 采用机械剥除,差速游离等措施进行植块法原代培养,胰蛋白酶差速消化和差速贴壁传代以去除杂细胞,并应用倒置相差显微镜和SABC试剂盒对细胞进行形态学和免疫细胞化学染色鉴定。结果 镜下细胞呈短梭形或鹅卵石状生长;Ⅷ因子、CD34相关抗原免疫细胞化学染色鉴定均阳性;该细胞在普通明胶上部分区域可形成管腔样或血管网络状结构。结论 本方法可获得纯度高,结构和功能良好的心肌微血管内皮细胞。     

大鼠缺血心肌微血管内皮细胞的培养和鉴定

目的 建立大鼠缺血心肌微血管内皮细胞（Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs）培养模型,为进一步研究其生物学特征提供实验基础.方法选取220~280 g成年雄性SD大鼠,结扎法建立心肌缺血模型,植块法培养结扎后24 h、3 d、7 d的心肌缺血模型大鼠CMECs,倒置相差显微镜观察培养细胞的形态学特征,观察不同时间点缺血模型CMECs生长状况,免疫细胞化学方法显示CMECs特异性抗原.结果 镜下观察部分CMECs刚游离出组织块时呈星形或多边形,当细胞生长至亚融合状态呈短梭形并呈铺路石样,部分区域可见管腔样或血管网络状结构,具备典型微血管内皮细胞特征;心肌缺血7 d时,缺血心肌组织CMECs密度最大;免疫细胞化学染色鉴定,Ⅷ因子、CD31相关抗原均为阳性,阳性率分别为（95.1±1.2）%、（95.0±1.6）%.结论 本方法可获得纯度高、结构和功能良好的缺血CMECs,为缺血性心血管疾病研究奠定基础.     

冰片对过氧化氢损伤后大鼠心肌微血管内皮细胞的保护作用

目的 研究冰片对心肌微血管内皮细胞的保护作用。方法 体外培养的大鼠心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells, CMECs),采用CCK-8(cell counting kit-8)检测细胞活力,建立过氧化氢H₂O₂损伤CMECs模型,确定实验适宜的H₂O₂浓度及冰片治疗浓度。将CMECs分为对照组、H₂O₂损伤组及冰片治疗组。通过检测氧化应激反应多种中间产物含量及线粒体功能等,观察比较冰片对H₂O₂诱导的CMECs损伤的保护作用。结果 H₂O₂损伤组与对照组比较,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、NADPH氧化酶、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG)含量明显增加,还原型谷胱甘肽(reduced ...     

辐射对小鼠大脑微血管内皮细胞的作用

目的 研究辐射单因素对小鼠大脑微血管内皮细胞的影响,并探索辐射对脑微血管内皮细胞的可能的调控机制.方法 采用原代培养的小鼠大脑微血管内皮细胞,分为3组,辐射剂量分别为0,1,2 Gy.应用TUNEL染色观察小鼠大脑微血管内皮细胞形态学变化和凋亡情况.应用Western blot方法测定MAPKs家族ERK、JYN蛋白的磷酸化水平. 结果 随着辐射剂量增加细胞凋亡比例升高,以2Gy辐射下的细胞凋亡最明显;ERK蛋白磷酸化水平在辐射剂量1 Gy时,出现下降趋势,随辐射剂量增大后呈现升高趋势,JNK蛋白磷酸化水平呈现升高趋势. 结论 辐射可引起小鼠大脑微血管内皮细胞凋亡,且随辐射剂量增加,细胞凋亡率随之上升.MAPK/ERK、MAPK/JNK信号转导通道可能参与辐射对小鼠大脑微血管内皮细胞凋亡的调节过程.     

微血管内皮细胞对小鼠造血干细胞增殖的影响

目的 探索微血管内皮细胞(MECs)对造血干细胞(HSCs)增殖的影响,以建立一种促进HSCs增殖的方法.方法 选取C57BL/6小鼠和C57系GFP小鼠,处死获取肺叶组织.(1)MECs的分离、培养和鉴定:肺组织经Ⅰ型胶原酶消化获得的细胞在含20％胎牛血清(FBS)、2 ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)、100U/mL肝素、0.1 mg/mL青霉素及链霉素的DMEM-F12培养基培养,第8天进行CD31荧光鉴定,“铺路石”细胞用于共培养并以流式细胞仪(FCM)检测八因子相关抗原(vWF)、CD31、CD34、CD45表达率.(2)GFP小鼠HSCs的分离、鉴定:密度梯度离心法和MACs-CD117+磁珠法分选HSCs,FCM检测纯度及CD117 CD34共表达率.(3)MECs促HSCs增殖:设立对照组(HSCs)、共培养组(MECs+ HSCs),培养7d,观察HSCs生长情况并计数、计算扩增倍数;第7天,收集共培养组HSCs,FCM检测CD117 CD34共表达率.结果 (1)肺MECs:第3天形成细胞簇,第6天成“血管样”改变,第14天为“铺路石”外观.培养第8天CD31阳性率为54.5％.vWF、CD31、CD34、CD45阳性率分别为81.39％、45.80％、57.48％、0.17％.(2)平均每只小鼠骨髓经MACs分选后可获约4.7×105个CD117+细胞,纯度为99.51％.(3)随着培养时间的延长,两组HSCs计数均有所增加,但共培养组HSCs扩增倍数大于对照组(P＜0.05).第1～7天共培养组与对照组细胞数相对变化倍数分别为1.21、1.35、1.50、1.72、1.71、1.75和1.78(P＜0.05),第4天变化最明显.共培养7d后HSCs的CD117 CD34共表达率为92.06％.结论 MECs对HSCs增殖有促进作用,共培养第4天促进作用最明显,并且MECs可以促进HSCs CD34的表达.     

肺微血管内皮细胞的培养液对血管平滑肌细胞的效应

目的 观察缺氧条件下培养的肺微血管内皮细胞（ＰＭＥＣ）培养液对大鼠主动脉平滑肌细胞（ＡＳＭＣ）的作用,方法 应用倒置显微镜和电镜观察细胞形态,同位素放射测定＾３Ｈ－胸腺嘧啶核苷（＾３Ｈ－ＴｄＲ）摄取量,流式细胞仪测定细胞的周期和蛋白含量。结果 单纯缺氧可使ＡＳＭＣ Ｇ０／Ｇ１期数目增多,＾３Ｈ－ＴｄＲ摄取量降低,蛋白质含量减少;缺氧的ＰＭＥＣ培养液能促进大鼠ＡＳＭＣ从Ｇ０／Ｇ１期进入Ｓ期,＾３Ｈ－     

无血清培养对小鼠脑微血管内皮细胞凋亡的影响及其机制

目的　研究无血清培养诱导小鼠脑微血管内皮细胞凋亡及其可能机制。方法　培养用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd .3。用流式细胞术检测凋亡细胞的百分比;用免疫细胞化学法检测Bax及Bcl- 2蛋白表达;用WesternBlot检测caspase 3蛋白表达。结果　bEnd .3细胞经无血清饥饿体外培养12 ,2 4 ,36h后细胞凋亡率明显增加,分别为(13.79±0 .99) % ,(17.80±1.39) % ,(2 0 .5 1±0 .5 5 ) % ,与各自正常血清培养的对照组凋亡率相比,P <0 .0 1。Bax表达明显增强,Bcl -2表达明显减弱,caspase 3明显增强。结论　无血清饥饿培养可诱导bEnd .3细胞发生凋亡,其发生机制与Bax/Bcl 2的变化及caspase 3的激活有关。     

大鼠缺血心肌微血管内皮细胞血管新生的生物学特征

[目的]观察大鼠缺血心肌微血管内皮细胞(CMECs)血管新生的生物学特征。[方法]采用结扎法建立大鼠心肌缺血模型,植块法培养CMECs,倒置相差显微镜观察细胞形态学特征,免疫细胞化学法检测CMECs特异性抗原。实验分组将大鼠缺血CMECs作为缺血组(I组),正常大鼠CMECs作为对照组(N组),采用噻唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线并检测细胞增殖能力,划痕法测定细胞迁移能力,倒置相差显微镜观察管腔结构形成情况。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测细胞增殖相关蛋白激酶(ERK)和细胞死亡相关分子(p53)mRNA的表达情况。[结果]大鼠CMECs具备典型微血管内皮细胞特征,Ⅷ因子、CD31相关抗原免疫染色鉴定均为阳性。N组和I组迁移窗口期均为第1天,成管窗口期均为第2天,N组和I组的增殖窗口期分别为第3天、第6天。两组比较,I组迁移率、增殖率和成管率均低于N组,以迁移率降低最为明显(P0.01)。I组ERK、p53 mRNA表达均高于N组(P0.05)。[结论]缺血CMECs的血管新生能力明显降低,血管新生增殖窗口期改变,可能与ERK和p53mRNA表达的变化有关,为进一步研究其基因组学及药物干预提供实验依据。     

益气活血中药对大鼠缺血心肌微血管内皮细胞血管新生功能的影响

目的：观察益气活血中药对大鼠缺血心肌微血管内皮细胞（ CMECs）增殖、迁移、成管功能的干预作用,及其对细胞增殖相关蛋白激酶（ERK）和细胞死亡相关分子（p53）mRNA 表达的影响。方法制备芪参益气滴丸高剂量（QG 组）、中剂量（QZ 组）、低剂量（QD 组）大鼠含药血清,分别与大鼠缺血 CMECs 共孵育,同时制备空白血清,分别与心肌缺血模型大鼠（ MX 组）、正常大鼠（ ZC组）来源的原代 CMECs 共孵育;噻唑蓝比色法检测细胞增殖情况,细胞划痕法检测细胞迁移能力,倒置相差显微镜观察管腔结构的形成情况;实时定量聚合酶链反应（ Real - time PCR）检测 ERK 和 p53 mRNA 的表达情况。结果增殖窗口期 QZ 组、QD 组均为第2天,而 QG 组、ZC 组均为第3天,MX 组为第6天;QG 组、QZ 组、QD 组增殖率、迁移率及成管率均显著高于 MX 组,而 QD 组增高最明显（P ﹤0.01）;与 MX 组比较,QG 组、QZ 组、QD 组 ERK mRNA 表达增加,p53 mRNA 表达降低（P ﹤0.05）。结论益气活血中药可促进大鼠缺血 CMECs 的血管新生功能,但其作用与药物剂量并非成正相关,可能与不同药物浓度干预导致 ERK 及 p53的差异表达有关。     

缺氧复氧对大鼠心肌微血管内皮细胞活力的影响及机制研究

目的:研究缺氧复氧对大鼠心肌微血管内皮细胞(MMECs)活力的影响及机制。方法:培养大鼠MMECs,制作缺氧复氧模型模拟缺血再灌注损伤。随机分为4组(n=24),正常对照组(N组)不作任何处理、缺氧复氧组(HR组)、LY294002预先给药+缺氧复氧组(LY294002组)、PDTC预先给药+缺氧复氧组(PDTC组),均进行缺氧2 h复氧2 h。复氧2 h时后MTT法测定细胞活力,Hoechst染色观察凋亡细胞显微结构。结果:与N组比较,HR组细胞活力降低(P<0.01);与HR组比较,LY294002组细胞活力降低(P<0.05),PDTC组细胞活力降低(P<0.01);与LY294002组比较,PDTC组组细胞活力降低(P<0.01)。结论:缺氧复氧可导致MMECs活力明显降低;PI3K/Akt/NF-κB信号通路参与了缺氧复氧调控过程,该通路可促进MMECs活力增强。     

一种简易稳定的乳小鼠脑微血管内皮细胞原代培养方法

目的 寻找一种简单并稳定的原代小鼠脑微血管内皮细胞的培养方法.方法 采用两次酶消化法及4℃梯度离心法获得细胞,光镜和电镜下观察细胞形态,用检测Ⅷ因子相关抗原等方法鉴定细胞.结果 光镜下细胞呈多角形或短梭形,岛屿样聚集,随细胞生长及不断融合而出现"漩涡状"、"铺路石"样排列.电镜下观察可见紧密连接结构.Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阳性.结论 上述方法可获得纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞,为其原代培养提供了一种经济、简易、重复性好的操作方法,也为进一步的生理、生化、药理及体外血脑屏障或共培养等方面的研究提供了材料来源.     

不同脑部和脑区微血管内皮细胞的培养

培养不同脑部和脑区的微血管内皮细胞。取健康兔或猪的不同脑部或脑区组织，先经胰酶初步消化，浆浆，尼龙筛网过滤和右旋糖酐分离后，用胶原酶消化获到的微血管并进行营养２。用Ⅷ因子相关抗原抗血清进行免疫组织化学染色鉴定。     

红花水提物对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)所致的心肌微血管内皮细胞损伤的影响

目的:观察红花水提物对血管内皮细胞的保护作用,探求其抗氧化的机制。方法:利用大鼠原代心肌微血管内皮细胞(rCMEC)的培养进行试验,并对获得的数据进行方差分析(ANOVA)及多组间比较等。结果:提示呈现红花水提物具有提高抗氧化酶活性、减少氧化产物生成及减轻ox-LDL损伤作用的趋势。结论:通过红花水提物预处理,可以减轻ox-LDL对内皮细胞的氧化损伤。     

人胎盘组织液在小鼠脑微血管内皮细胞增殖中的作用研究

目的:研究人胎盘组织液对小鼠脑微血管内皮细胞增殖的影响。方法:采用细胞计数和MTT法观察不同稀释度人胎盘组织液作用72 h后,小鼠脑微血管内皮细胞增殖情况。同时以免疫组织化学法检测不同稀释度人胎盘组织液对小鼠脑微血管内皮细胞增殖细胞核抗原表达的影响。结果:一定稀释度的人胎盘组织液可促进小鼠脑微血管内皮细胞的增殖,25 ml/L即可发挥作用,200 ml/L作用最明显。小鼠脑微血管内皮细胞PCNA表达阳性率与人胎盘组织液稀释度呈剂量相关性。结论:人胎盘组织液可促进体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞增殖。     

烟曲霉对肺微血管内皮细胞通透性的影响及可能机制

目的 探讨烟曲霉对肺微血管内皮细胞通透性的影响及其机制。方法 利用激光共聚焦扫描显微镜检测人肺微血管内皮细胞肌动蛋白（F-actin）和细胞跨膜电阻仪测定细胞跨膜电位,以观察细胞通透性的改变,并利用p38 MAPK抑制剂、ROCK抑制剂和蛋白激酶C抑制剂探讨其机制。结果 烟曲霉处理后肺微血管内皮细胞F-actin染色的荧光强度显著下降（P<0.01）,烟曲霉处理组也出现细胞跨膜电阻值的显著下降（P<0.01）。与单独烟曲霉处理组比较,SB203580（20μmol/L, p38 MAPK抑制剂）干预组、Y27632（20μmol/L, ROCK抑制剂）干预组以及LY317615（10μmol/L,蛋白激酶C抑制剂）干预组的跨膜电阻值均显著上升（P<0.05）。结论 烟曲霉处理致肺微血管内皮细胞通透性增加,其机制可能涉及p38 MAPK、ROCK激酶以及蛋白激酶C通路。