MiR-144-5p在胃癌中的表达及其生物学功能

摘 要：［目的］ 探讨miR-144-5p在胃癌组织和细胞中的表达及生物学功能。［方法］ 采用qRT-PCR 检测miR-144-5p在胃癌组织和细胞系中的表达水平,并验证miR-144-5p mimics的转染效率;分别采用CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞仪、Transwell实验检测miR-144-5p mimics对胃癌细胞AGS和HGC-27增殖、克隆形成能力、细胞周期和侵袭能力的影响。［结果］ MiR-144-5p在胃癌组织的表达水平明显低于癌旁组织（0.607±0.257 vs 1.000±0.360,t=5.616,P<0.001）。MiR-144-5p低表达与胃癌患者的肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期显著相关（P<0.05）。MiR-144-5p在胃癌细胞SNU-1、HGC-27、SGC-7901、KATO Ⅲ及AGS中表达水平显著低于正常人胃黏膜上皮细胞GES-1（F=12.17,P<0.001）。转染miR-144-5p mimics后,AGS（t=4.902,P=0.001）和HGC-27（t=4.154,P=0.003）细胞中miR-144-5p的表达水平显著增高;AGS和HGC-27细胞的增殖能力、克隆形成能力、侵袭能力均被抑制（P<0.05）,G1期细胞比例增加、而S期的细胞比例减少（P<0.05）。［结论］ MiR-144-5p在胃癌组织和细胞中表达降低,与胃癌患者的TNM分期较晚和胃癌细胞恶性程度较高有关,提示miR-144-5p在胃癌的恶性进程中起重要作用。     

lncRNA SBF2-AS1 通过调控miR-140-5p/VEGFA 分子轴促进宫颈癌HeLa细胞上皮间质转化

目的：探讨lncRNA SBF2-AS1 通过调控miR-140-5p/血管内皮生长因子A（VEGFA）分子轴对宫颈癌HeLa 细胞上皮间质转化（EMT）的影响。方法：细胞培养和转染后分为NC、miR-140-5p mimic、miR-140-5p mimic+pcDNA-VEGFA、si-lncRNASBF2-AS1+pcDNA-VEGFA及si-lncRNA SBF2-AS1+miR-140-5p mimic组5 组。采用qPCR检测lncRNA SBF2-AS1 在宫颈癌组织及细胞系中的表达水平,双荧光素酶报告基因验让lncRNA SBF2-AS1、miR-140-5p 与VEGFA的靶向关系,WB检测HeLa细胞中VEGFA及EMT标志物N-cadherin、Vimentin 和E-cadherin 的表达水平,Transwell 实验检测HeLa细胞侵袭和迁移能力。结果：lncRNASBF2-AS1 在宫颈癌组织及细胞系中高表达（P<0.05 或P<0.01）,lncRNA SBF2-AS1 靶向结合miR-140-5p,且VEGFA 是miR-140-5p 的靶基因（P<0.05）。敲降lncRNA SBF2-AS1 抑制HeLa细胞侵袭、迁移及EMT。进一步实验证实,lncRNA SBF2-AS1通过miR-140-5p 上调VEGFA的表达水平,从而促进HeLa 细胞侵袭、迁移及EMT（P<0.05 或P<0.01）。结论：lncRNA SBF2-AS1通过miR-140-5p/VEGFA分子轴促进HeLa细胞EMT。     

转染microRNA-330-5p对肺癌细胞侵袭和迁移能力的影响

摘 要：［目的］ 探讨miR-330-5p表达对肺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力等生物学行为的影响,揭示miR-330-5p的作用机制。［方法］ 分析非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系95C和95D的 miRNA表达谱芯片中miR-330-5p的表达情况并用靶标软件预测其靶基因;转染miR-330-5p类似物（mimics）至95D、转染miR-330-5p 抑制剂(inhibitor)至95C中,应用CCK-8法、transwell小室法检测miR-330-5p对肺癌细胞增殖、侵袭迁移等生物学行为的影响;应用Western blot法检测miR-330-5p表达对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表达水平的影响。［结果］ miRNA表达谱芯片显示miR-330-5p在95D中表达明显低于95C;靶标预测软件预测mTOR mRNA可能是miR-330-5p的靶基因;转染miR-330-5p mimics后95D细胞增殖能力显著降低,其24h侵袭穿膜细胞数明显低于对照组,mTOR蛋白表达明显下调(P<0.01);而转染miR-330-5p inhibitor后95C细胞的增殖能力增强,其24h侵袭穿膜细胞数较对照组明显增加,mTOR蛋白表达上调(P<0.01)。［结论］ 提高miR-330-5p表达能够明显抑制肺癌细胞的增殖、侵袭与迁移能力,mTOR mRNA可能是其重要的靶基因。     

miR-377-5p 通过下调HIF-1α 及其相关VEGF 信号通路抑制肝细胞癌HepG2 细胞的增殖和侵袭

目的：探讨miR-377-5p 与缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1,HIF-1α）的靶向关系以及通过控血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）信号通路对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞增殖、侵袭和EMT的调控作用。方法：qPCR检测35 例人HCC组织及癌旁组织标本中miR-377-5p 的表达水平。将HepG2 细胞分为对照组、mimic NC组、miR-377-5p mimic 组,qPCR 检测转染效率;EdU染色、Transwell 和Western blotting（WB）检测miR-377-5p 过表达对HepG2 细胞增殖、侵袭及其增殖相关蛋白Ki-67、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）及上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）标志蛋白E-cadherin、N-cadherin 表达的影响;qPCR、WB检测miR-377-5p 过表达对HepG2 细胞中,缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）表达的影响。荧光素酶报告基因实验验证miR-377-5p 与HIF-1α 基因的靶向关系。结果：HCC 组织中miR-377-5p 表达水平较癌旁组织降低（P<0.01）。与对照组相比,miR-377-5p mimic 组HepG2细胞中miR-377-5p 水平明显升高,细胞的增殖、侵袭能力降低（均P<0.01）,EMT、N-cadherin 表达水平降低（均P<0.01）而E-cadherin 表达水平显著升高（P<0.01）;miR-377-5p mimic 组中HIF-1α mRNA 和蛋白表达水平均降低（P<0.01 或P<0.05）。miR-377-5p 靶向抑制HIF-1α 基因表达,并抑制VEGF通路的激活（均P<0.05）。结论：miR-377-5p 通过靶向抑制HIF-1α 基因表达和下调VEGF信号通路从而抑制HepG2 细胞的增殖、侵袭和EMT。     

骨髓间充质干细胞源外泌体miR-21-5p 通过下调PHLPP2 促进前列腺癌PC-3 细胞的增殖、迁移和侵袭

目的：探讨骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）来源的外泌体对前列腺癌细胞PC-3 的增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法：采用qPCR检测miR-21-5p 在前列腺癌细胞系中的表达水平。采用电子显微镜观察BMSC分离出的外泌体形态,Western blotting 检测外泌体表面标志物的表达以及上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 的表达。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-21-5p 和同源血小板富亮氨酸复重蛋白磷酸酶2（PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase 2,PHLPP2）的靶向调控关系。向PC-3 细胞培养液中加入10 μl 的BMSC外泌体悬液（Exo 组）、转染sh-PHLPP2 或antagomiR,CCK-8 和Transwell 实验检测PC-3 细胞增殖和迁移能力。结果：miR-21-5p 在前列腺癌PC-3 细胞系中高表达。成功分离BMSC培养液上清中的外泌体,透射电子显微镜下观察到外泌体典型的囊泡状结构,且表达CD9、CD63 和CD81 等特异性蛋白。Exo组中PC-3 细胞的增殖、侵袭[ （421.34±22.45）vs（200.09±14.22）个,P<0.05]、迁移能力和N-cadherin、Vimentin和miR-21-5p的表达水平均显著高于对照组（均P<0.05）。证实PHLPP2 是miR-21-5p的靶基因。与对照组相比,Exo 组和sh-PHLPP2 组PC-3 细胞中PHLPP2 的表达明显降低（0.66±0.09、0.42±0.05 vs 1.09±0.08,均P<0.01）,细胞增殖、侵袭和迁移[ （87.23±12.67）%、（82.45±10.13）% vs（66.46±9.13）%]能力均显著提高（均P<0.01）,E-cadherin 表达水平显著降低而N-cadherin 和Vimentin 表达水平显著升高（均P<0.05）。结论：miR-21-5p 在前列腺癌PC-3 细胞系中高表达,BMSC外泌体miR-21-5p通过靶向下调PHLPP2提高PC-3 细胞的增殖、迁移和侵袭能力。     

过表达miR-129-5p通过靶向MAPK1抑制宫颈癌HeLa细胞恶性生物行为

[摘要] 目的：探讨miR-129-5p 对宫颈癌HeLa细胞侵袭、迁移和EMT的作用及其机制。方法：选取宫颈癌HeLa细胞,利用生物信息学预测软件筛选miR-129-5p 的靶基因,双荧光素酶报告基因验证miR-129-5p 和MAPK1 的靶向关系。将miR-129-5p mimic、miR-129-5p inhibitor 和pcDNA-MAPK1 单独或联合转染到HeLa细胞,用qPCR检测HeLa细胞中miR-129-5p 和MAPK1 的表达水平,用Transwell、划痕愈合实验分别检测HeLa 细胞的侵袭、迁移能力,WB检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、MAPK1、STAT3 和Bcl-xL的表达。构建裸鼠HeLa细胞皮下移植瘤模型,观察miR-129-5p 过表达对移植瘤生长的影响,WB检测移植瘤组织中EMT及MAPK1 通路相关蛋白的表达。结果：miR-129-5p 与MAPK1 在3’UTR区存在结合位点,过表达miR-129-5p 靶向抑制MAPK1（P<0.01）。与对照组相比,miR-129-5p mimic 组侵袭细胞数目减少（P<0.01）,划痕愈合率降低（均P<0.01）;细胞中Ecadherin表达上调而N-cadherin、MAPK1、STAT3 和Bcl-xL 表达下调（均P<0.01）;共转染MAPK1 可逆转上述现象。成功建立裸鼠HeLa 细胞移植瘤模型,与对照组相比,miR-128-3p mimic 组肿瘤质量减轻（P<0.01）;瘤组织中E-cadherin 表达水平上调而N-cadherin、MAPK1、STAT3 和Bcl-xL 的表达下调（均P<0.01）。结论：过表达miR-129-5p 通过靶向MAPK1 抑制宫颈癌HeLa细胞的侵袭、迁移和EMT。     

miR-138-5p通过靶向TCF3实现对胃癌细胞SGC-7901侵袭和迁移的调控

目的:探讨miR-138-5p 与T细胞因子3 基因（T cell factor 3, TCF3）的靶向关系及其对人胃癌细胞SGC-7901 侵袭和迁移能力的影响。方法：miR-138-5p 模拟物转染SGC-7901 细胞后,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-138-5p 和TCF3 mRNA的相对表达;生物信息学方法预测miR-138-5p 与TCF3 基因的靶向匹配关系,采用荧光素酶报告基因系统鉴定该关系。miR-138-5p 转染正常胃癌细胞和TCF3 高表达胃癌细胞后,Western blotting 检测TCF3、神经钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、锌指转录因子（Slug）和上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达,Transwell 小室检测胃癌细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力。结果：miR-138-5p 过表达抑制TCF3 mRNA的表达;生物信息学软件预测显示miR-138-5p 与TCF3 mRNA有靶向结合区域,miR-138-5p mimic 降低TCF3 野生型质粒的荧光素酶活性,不影响TCF3 突变型质粒的荧光素酶活性。miR-138-5p 抑制TCF3 蛋白表达,miR-138-5p 减弱TCF3 过表达对SGC-7901 细胞侵袭和迁移能力的促进作用,同时其下调N-cadherin、Vimentin 和Slug 蛋白表达、上调E-cadherin 蛋白表达。结论：miR-138-5p 抑制胃癌细胞SGC-7901 的侵袭和迁移,与直接靶向调控TCF3 的表达有关。     

Circ_0001946靶向miR-671-5p调控Wnt/β-catenin通路对结直肠癌细胞恶性进展的影响

摘 要：［目的］ 探讨circ_0001946对结直肠癌细胞恶性进展的影响。［方法］培养结直肠癌HCT116、SW480、Colo320、HT29细胞和正常结直肠CCC-HIE-2细胞,实时定量PCR检测circ_0001946、miR-671-5p表达量。miRcode和双荧光素酶报告实验分析circ_0001946和miR-671-5p的关系。circ_0001946、miR-671-5p在HCT116细胞中的表达量被上调或下调后,分别检测HCT116细胞生长活性、细胞凋亡率及细胞迁移能力。免疫蛋白印迹法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达。［结果］ HCT116（4.76±0.47）、HT29（2.85±0.57）、SW480（2.75±0.62）、Colo320（3.12±0.68）细胞中circ_0001946表达水平高于CCC-HIE-2细胞（1.24±0.09）（t=7.238、8.129、6.893、6.875,P均<0.05）。下调circ_0001946表达显著降低了HCT116细胞增殖（P<0.05）和迁移能力（P<0.05）,促进了细胞凋亡（P<0.01）; circ_0001946靶向miR-671-5p; circ_0001946表达被上调或miR-671-5p表达被下调后,HCT116细胞增殖和迁移能力显著上升,细胞凋亡率明显降低,Wnt/β-catenin信号通路被激活。［结论］ circ_0001946靶向miR-671-5p激活了Wnt/β-catenin信号通路,促进了结直肠癌细胞恶性进展。     

miR-497-5p通过HMGA2调控食管鳞癌细胞迁移和侵袭

目的:探讨miR-497-5p通过高迁移率族蛋白A2(HMGA2)对食管鳞癌细胞(ESCC)迁移和侵袭能力的影响。方法:利用UALCAN、GEPIA数据库分析miR-497-5p和HMGA2 mRNA在食管癌中的表达。通过生物信息学网站starBase分析miR-497-5p和HMGA2在食管癌样本中表达的相关性。通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-497-5p对HMGA2基因的调控。采用细胞划痕实验和Transwell实验分析miR-497-5p通过HMGA2对ESCC细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:miR-497-5p在食管癌中的表达明显低于其对照样本(P<0.05),HMGA2 mRNA在食管癌中的表达明显高于其对照样本(P<0.05)。miR-497-5p和HMGA2的表达成负相关,miR-497-5p对靶基因HMGA2具有直接调控作用。miR-497-5p mimic组细胞的迁移和侵袭能力明显低于阴性对照(NC)组(P<0.001);而miR-497-5p mimic+HMGA2组细胞的迁移和侵袭能力与miR-497-5p mimic组相比明显上升(P&l...     

Linc00176靶向miR-338-3/SMO轴对肝癌细胞增殖和迁移的影响

摘 要：［目的］ 探讨基因间长链非编码RNA Linc00176靶向miR-338-3p/SMO对肝癌（HCC）细胞增殖和迁移的影响。［方法］ 收集手术切除的肝癌患者的HCC组织和癌旁组织标本各96例,采用荧光定量PCR检测Linc00176和miR-338-3p在HCC组织和癌旁组织中的表达水平;构建shRNA-Control、 shRNA-Linc00176、miRNA-Control和miR-338-3p慢病毒肝癌细胞系,采用生物信息学和双荧光素酶报告基因检测分析Linc00176和miR-338-3p的靶向关系;采用CCK-8法和异种移植瘤实验检测各组细胞的增殖能力;采用Transwell分析各组细胞的迁移能力;采用Western blot检测各组细胞中SMO蛋白的表达水平。［结果］ Linc00176在HCC组织中的mRNA相对表达水平（1.94±0.21）显著高于癌旁组织（0.57±0.10）;miR-338-3p在HCC组织中的mRNA相对表达水平（0.35±0.08）显著低于癌旁组织（1.62±0.15）,差异均有统计学意义（P<0.05）。生物信息学分析显示Linc00176可能通过靶向调控miR-338-3p的表达,进一步影响SMO蛋白的表达。双荧光素酶报告基因检测显示转染Linc00176-WT的miR-338-3p细胞（0.33±0.08）的相对荧光素酶活性显著低于miRNA-Control组细胞（1.25±0.16）,差异有统计学意义（P<0.05）。CCK-8和异种移植瘤实验显示shRNA-Linc00176和miR-338-3p组细胞的增殖活力和成瘤能力与其各自的对照组相比显著下降,差异均有统计学意义（P<0.05）。Transwell结果表明与shRNA-Control组（134.47±12.29）和miRNA-Control组（129.87±13.06）比较,shRNA-Linc00176组（53.17±8.74）和miR-338-3p组（44.61±8.02）细胞的迁移个数均显著下降,差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示,shRNA-Linc00176和miR-338-3p组细胞中SMO的蛋白表达水平较shRNA-Control和miRNA-Control组均显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。［结论］ Linc00176可能通过靶向调控miR-338-3p/SMO的表达促进HCC细胞的增殖和迁移。