大青转录组测序及生物信息学分析

【目的】 利用高通量测序技术获得大青的转录组信息特征。【方法】 通过高通量测序平台Illumina HiSeqTM 2500 对大青进行转录组测序,采用Trinity软件de novo组装获得Unigene,并基于序列同源性对Unigene 进行功能注释,得到大青转录组的遗传信息。【结果】 测序数据经过质控后共获得26 394 223个高质量的Reads,通过de novo组装获得100 191个Unigene,N50长度为1 055 bp,平均长度724.4 bp。其中59 690个（59.58%）Unigene 在NR、SwissProt、KOG、GO、KEGG数据库中均得到注释。其中KEGG数据库注释到38 260个Unigene,涉及136条代谢通路。在大青转录组中共鉴定到407个Unigene参与萜类化合物的生物合成,165个Unigene 涉及类黄酮生物合成,29个Unigene参与黄酮和黄酮醇生物合成,37个Unigene参与异黄酮生物合成,同时,还鉴定到210类转录因子。MISA分析发现6 680个Unigene 包含8 640个简单重复序列。【结论】 利用高通量测序技术和生物信息分析获得了大青的转录组信息特征,这些数据可为后期开展功能基因鉴定、解析黄酮类化合物次生代谢途径及其调控机制奠定研究基础。     

利用转录组分析款冬萜类化合物生物合成关键酶基因及表达特征

目的挖掘与款冬萜类化合物生物合成途径相关的关键酶基因。方法利用Illumina HiSeq2500测序平台对野生款冬花蕾和叶进行转录组测序,使用Trinity软件de novo从头组装,并通过基因功能注释、差异表达基因分析等生物信息学方法进行分析,挖掘款冬中萜类化合物生物合成途径相关的酶基因。结果转录组测序获得39 912 371条高质量reads(SRA号:SRR9113366,SRR9113367),组装获得91 118条Unigene,55 830条Unigene在NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG等数据库得到注释。鉴定出参与款冬萜类化合物生物合成相关酶基因的129个Unigene,包括91个参与三萜骨架生物合成酶基因,32个萜类合成酶基因,6个细胞色素P450基因,其中差异表达基因25个,涉及上游MVA途径的4个差异基因在花蕾中表达量高于叶,MEP途径的5个差异基因在叶中表达高于花蕾,另外还有10个基因在叶中高表达,9个基因在花蕾中高表达。根据差异基因HMGR、TPS、AS、CYP450基因在花蕾中高表达,推测可能与花蕾中萜类物质含量高有关。结论从款冬转录组数据库中初步获得了可能参与萜类化合物生物合成途径的候选关键酶基因,为进一步阐明款冬萜类化合物生物合成的分子机制奠定基础。     

三叶青根与茎叶转录组和差异性表达分析

目的采用Illumina Hi Seq 4000测序技术获得三叶青转录组数据,为三叶青分子生物学研究提供重要分子信息。方法以三叶青根和茎叶为材料,进行转录组测序,对测试数据进行基因功能注释、代谢途径及微卫星等的生物信息学分析。结果共获得24.13 Gb Clean Data,拼接组装得到84 433条Unigene,与7个基因数据库进行比对,最终获得47 766个有注释信息的Unigene。在GO数据库中注释27 790条,其根和茎叶的差异表达基因数目为4989个,其中上调为3511个,下调为1478个;COG数据库得到16 152条三叶青Unigene的同源序列,共分为25个类别;在KEGG数据库有14 511条Unigene获得对应的Ko编号,可分为130个信号代谢分支,其中核糖体合成途径的Unigene数量最多,有1042条,而异黄酮的生物合成途径只有1条Unigene。结论对三叶青转录组进行拼接、组装和功能注释得到大量转录本信息,为三叶青分子生物学研究提供基因组数据库资源。     

盾叶薯蓣转录组分析及其皂苷元生物合成关键酶基因的挖掘

目的分析比较盾叶薯蓣根茎与叶片的转录组,挖掘与盾叶薯蓣中皂苷元生物合成途径相关的关键酶基因。方法利用Illumina Hi Seq2000高通量测序技术对盾叶薯蓣根茎与叶片进行转录组测序,对测序结果进行注释分析;并结合根茎与叶片中皂苷元的含量测定结果,挖掘与盾叶薯蓣中皂苷元生物合成途径相关的关键酶基因;最后利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对部分候选基因的表达模式进行分析。结果共获得了81 660个Unigene,有64.33%在NT、NR、Swiss-Prot、KOG、GO、KEGG数据库中得到注释;根据其表达量与代谢通路分析筛选出29种共227个可能参与盾叶薯蓣中皂苷元生物合成途径的催化酶基因,部分催化酶基因的表达模式与皂苷元含量具有一定相关性;并发现5个盾叶薯蓣内生菌基因。结论研究初步获得了盾叶薯蓣中参与皂苷元生物合成的候选关键酶基因,部分候选酶基因可能参与盾叶薯蓣中皂苷类成分的后修饰过程,并发现盾叶薯蓣根茎中内生菌可能参与其皂苷元的生物合成,为进一步阐明盾叶薯蓣中皂苷元生物合成的分子机制奠定基础。     

夏枯草的转录组测序与次生代谢产物生物合成相关基因的挖掘

目的获得夏枯草转录组信息,探索夏枯草次生代谢产物生物合成的分子基础。方法利用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术对夏枯草果穗、茎和叶等部位进行转录组测序,经Trinity软件组装后获得Unigene,并进行系统的生物信息学分析。结果共获得77 863条Unigene,平均长度为716.72 nt。通过与NR、Swiss-Prot、COG等7个公共数据库进行BLAST比对,共有41 367个Unigene获得注释,注释率为53.13%。在KEGG数据库中,有1 406条Unigene被注释到次生代谢产物合成。通过对转录组数据深入挖掘发现,参与夏枯草三萜类骨架合成的Unigene共有60个,参与酚酸类合成的Unigene共有24个,参与次生代谢后修饰的Unigene共有259个,参与其他次生代谢合成的Unigene共有118个。结论夏枯草转录组数据为探索夏枯草次生代谢产物的生物合成机制提供了重要的资源,也为利用代谢工程增加夏枯草中重要次生代谢产物含量提供了基础信息。     

茜草转录组分析及其蒽醌类化合物合成相关基因的挖掘

目的获得茜草Rubia cordifolia转录组学信息及挖掘其蒽醌类化合物生物合成的关键酶基因,为茜草的功能基因克隆与分析提供参考。方法采用Illunima Hiseq TM 2000 150PE高通量测序技术对茜草进行转录组测序,使用Trinity软件完成Unigene的de novo拼接,基于BLAST实现Unigene的分类、功能注释、代谢通路分析和蛋白功能注释等。结果最终获得7.3 Gb数据,通过de novo拼接注释得到Unigene 66 646条,平均长度为1 424 bp,所有Unigene能被NCBI nonredundant protein sequences(NR)、NCBI nucleotide sequences(NT)、kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)、A manually annotated and reviewed protein sequence database(Swissprot)、gene ontology(GO)、eu Karyotic ortholog groups(KOG)和protein family(Pfam)数据库所注释,注释成功率100%,找到与茜草蒽醌类化合物生物合成相关的基因64条。结论首次对茜草转录组进行了分析,并获得了茜草蒽醌类化合物生物合成相关的候选基因,为茜草的分子生物学研究提供了丰富的数据资源,也为后期开展茜草蒽醌类化合物次生代谢途径解析奠定了基础。     

基于转录组分析华细辛甲基丁香酚生物合成途径的相关基因

目的获得华细辛Asarum sieboldii转录组数据库和差异表达基因,识别华细辛甲基丁香酚生物合成相关基因。方法以华细辛地下部分(根)和地上部分(叶片)2个样本作为供试材料,采用Illumina Hiseq 4000进行转录组测序,并从头拼接,对Unigene进行功能注释和差异性分析。结果共获得12.25 Gb数据,拼接得到129 003个Unigene,可归类于52个GO分类,涉及363条KEGG代谢通路。分析发现,共有439个差异表达基因,其中上调基因占38.3%,下调基因占61.7%,差异较大;136个Unigene与苯丙素类次生代谢途径相关,其中44个Unigene参与甲基丁香酚的生物合成过程。结论本研究得到大量华细辛转录本信息,所发掘的与甲基丁香酚生物合成相关的Unigene为相关基因的分离、功能验证及其表达调控机制的阐明提供了重要依据。     

基于比较转录组的夏枯草组织差异表达分析

目的分析夏枯草Prunella vulgaris果穗、茎、叶片转录组,挖掘夏枯草次生代谢产物生物合成的功能及调节基因。方法利用Illumina高通量测序技术对夏枯草不同组织进行转录组测序,并从差异表达的基因中鉴定次生代谢物生物合成的相关酶基因。结果在夏枯草的3个不同组织的转录本中,共有8 270个Unigenes在至少2个样品间差异显著。对不同组织差异表达的基因进行KEGG富集分析,结果表明,不同组织中苯丙素类生物合成的基因表达均有较大的变化。在夏枯草差异基因中分别搜索三萜类和酚酸类生物合成途径的关键酶,共鉴定到31个三萜类生物合成相关的Unigene,16个酚酸类生物合成相关的Unigenes,113个P450相关的Unigenes。结论本研究为后续发掘夏枯草次生物质代谢合成途径相关功能基因提供依据,也为夏枯草次生代谢物的生物合成调控研究奠定基础。     

基于转录组数据对七叶树中三萜皂苷合成途径的研究

七叶树是七叶树科七叶树属高大乔木,集药用与观赏于一身。七叶树种子是其主要的药用部位,主要有效成分为齐墩果烷型三萜皂苷类化合物七叶皂苷。为了解七叶树三萜化合物生物合成的分子基础,该研究采用Illumina Hi Seq 2000高通量测序获得七叶树种子与花的转录组数据,并对其代谢途径相关基因进行挖掘;使用Trinity软件实现unigene的de novo拼接;并将转录组的测序结果运用KEGG数据库进行注释,从而预测七叶树三萜代谢的具体途径。结果显示七叶树转录组共有2个三萜代谢途径相关数据集,分别为萜类物质前体代谢途径(途径编号为ko00900)和倍半萜与三萜代谢途径(途径编号为ko00909),对应的基因分别有47,27条。进一步根据催化酶与活性产物的总结比较分析发现萜类物质前体代谢途径相关酶共有8种,三萜代谢途径相关酶有3种。该研究首次在七叶树中解析出5条与三萜环化酶对应的基因,它们可能参与β-香树精合成进而形成七叶皂苷。通过种子与花的转录组表达差异分析显示,ko00900和ko00909途径相关的差异基因有33个;相对于花器官,种子中有17个unigenes表达量上调,16个unigenes表达量下调。该研究运用qRT-PCR实验对SQE(Unigene25806),HMGS(Unigene36710),β-AS(Unigene33291) 3个差异显著的关键酶基因的表达进行了试验验证,实验结果qRT-PCR结果与转录组数据一致。该研究所发现的七叶树的三萜皂苷合成相关候选基因能对七叶树三萜代谢合成与调控方面提供理论依据。     

杜仲愈伤组织转录组分析及其类黄酮合成相关基因的qRT-PCR分析

目的分析光、暗培养的杜仲愈伤组织转录组测序结果,验证杜仲愈伤组织转录组测序结果中与类黄酮合成相关基因的表达水平。方法利用Illumina Hi SeqTM 2500测序平台对光暗培养的2种杜仲愈伤组织进行转录组高通量测序,利用Trinity软件对测序结果进行De novo组装,使用BLAST软件将Unigenes序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG、Pfam等数据库比对,利用FPKM值估算基因表达丰度,利用qRT-PCR验证与类黄酮合成相关基因的表达水平。结果杜仲愈伤组织转录组测序共获得13.00 Gbp的clean data。De novo组装后共获得62 030条Unigenes,平均长度为736.40 bp。使用BLAST软件将Unigenes序列与相关数据库比对,共获得25 417条Unigenes的注释结果。其中,25 167条Unigenes注释到Nr。4 794条Unigenes和它们相关的酶(enzyme commission numbers)注释到82条KEGG通路。共获得差异表达基因1 986条。在白光(光强为12 000 lx,16 h光照,8 h黑暗)培养的愈伤组织中,有1 139条基因表达上调,847条基因表达下调。在KEGG富集分析中发现,有7个Unigenes与类黄酮合成相关,其中有6个Unigenes在白光培养的杜仲愈伤组织中上调表达,它们编码的酶分别为查耳酮异构酶(EC 5.5.1.6,chalcone isomerase,CHI),查耳酮合成酶(EC 2.3.1.74,chalcome synthase,CHS),类黄酮3′-羟化酶(EC 1.14.13.21,flavonoid3′-monooxygenase,F3’H),反肉桂酸4-单加氧酶(EC 1.14.13.11,trans-cinnamate 4-monooxygenase,CYP),黄酮醇合成酶(EC 1.14.11.23,flavonol synthase,FLS),莽草酸邻羟基肉桂转移酶(EC 2.3.1.133,shikimate-O-hydroxycinnamoyl transferase,HQT)。1个Unigene下调表达,它编码的酶为无色花青素加氧酶(EC 1.14.11.19,leucocyanidin oxygenase,LDOX)。qRT-PCR分析表明,与类黄酮合成相关的7个Unigenes的表达情况与转录组测序分析结果是一致的。结论白光条件(光强为12 000 lx,16 h光照,8 h黑暗)可以促进类黄酮代谢途径中相关化合物的积累。     

苗药八爪金龙转录组测序与次生代谢产物合成相关基因的挖掘

目的对八爪金龙根进行转录组测序,挖掘次生代谢合成相关基因,探索八爪金龙次生代谢产物生物合成的分子基础。方法采用IlluminaHi Seq4000高通量测序技术,对八爪金龙根进行转录组测序。使用Trinity软件对获得的Unigenes数据进行过滤组装,运用KEGG数据库对Unigenes进行注释。结果共获得52249条Unigenes,其中31391条被公共数据库成功注释,1507条Unigenes被注释到次生代谢产物合成。通过对转录组数据深入挖掘发现,参与八爪金龙苯丙素生物合成的Unigenes共有126条,参与萜类化合物骨架生物合成的Unigenes数量为73条,参与黄酮类化合物生物合成Unigenes有58条,参与次生代谢后修饰的Unigenes共有253条。筛选出9条Unigenes编码4个与八爪金龙香豆素生物合成的关键酶,23条Unigenes编码8个与黄酮生物合成的关键酶,39条Unigenes编码19个与萜类生物合成的关键酶,140条CYP450基因和113条UGT基因可能参与次生代谢物的修饰。微卫星识别软件(microsatellite identification tool,MISA)分析发现八爪金龙转录组包含17 400个简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)。结论通过高通量转录组测序,初步揭示了参与八爪金龙次生代谢产物合成相关的基因,为进一步研究八爪金龙次生代谢产物合成途径关键酶的功能及其调控机制奠定了基础。     

基于转录组测序揭示适度干旱胁迫对丹参基因表达的调控

目的对丹参进行转录组测序,分析丹参不同组织响应适度干旱胁迫的分子机制。方法以栽培4个月的丹参为材料,设置适度干旱胁迫组(土壤相对含水量55%～60%)和对照组(土壤相对含水量75%～80%),应用IlluminaHi Seq2000分别对根和叶进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)筛选和共表达网络分析等。结果转录组测序共获得58085条Unigene。其中28846条被注释,根和叶中的DEGs分别有1853、1457个。GO富集结果表明,丹参根和叶中的DEGs在GO功能部位中的分布基本一致,均在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。KEGG途径富集分析表明,根中DEGs显著富集在DNA复制、植物激素信号转导、植物-病原菌相互作用、胡萝卜素合成等途径,叶中DEGs则主要富集在氨基酸、生物碱、苯丙烷类生物合成等途径。适度干旱胁迫能促进丹参叶中苯丙烷类、根中萜类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进丹参有效成分累积的基础。AP2/ERF、b HLH、b ZIP、WRKY、MYB类转录因子在根和叶中差异表达均较显著,基因共表达网络分析预测了在适度干旱胁迫下可能参与调控萜类基因表达的转录因子。结论通过高通量转录组测序,揭示了适度干旱胁迫对丹参不同组织基因表达的调控特征,可为深入研究丹参药效成分的生物合成机制和在栽培中的合理灌溉提供科学依据。     

款冬叶不同发育阶段的转录组学分析

目的比较不同生长时期款冬叶中苯丙素类成分生物合成相关基因的表达,推测苯丙素类成分的最佳合成积累时期,为款冬叶资源的合理利用提供科学依据。方法利用Illumina Hi Seq2500测序技术对不同时期的款冬叶进行转录组测序,获得转录组数据后进行基因功能注释等生物信息学分析,对苯丙素类生物合成相关基因在不同时期的表达进行比较。结果通过转录组测序技术获得46 793个Unigenes,平均长度为952.144 8 bp,其中有4 774个可以被NR、Swiss-Prot、eggNOG、GO、KEGG等公共数据库共同注释。对注释得到的Unigenes进行KEGG代谢通路分析,结果显示款冬叶转录组中有144条Unigenes参与萜类、黄酮类和苯丙素类生物合成,其中萜类65条,苯丙素类64条,黄酮类15条。进一步对参与苯丙素类生物合成相关基因进行动态比较,发现其关键酶PAL、4CL、HCT、CCoAOMT等在9月的表达量最高,即苯丙素类成分在9月的生物合成量可能最高。结论为苯丙素类成分的生物合成途径及调控分析奠定了基础,也为款冬叶资源的开发利用奠定了科学依据。