抗肿瘤基因工程单链抗体及其免疫毒素的研究

抗体VH基因和VL基因经寡核苷酸接头连接成ScFv基因，转入原核或真核表达系统中表达ScFv。ScFv具有亲本抗体相同的抗原结合特性和能力．且抗原性大大减弱。ScFv分子量小,易穿入肿瘤和实体组织内部，也易进入病毒峡谷。ScFv与药物、毒素、同位素或酶等偶联构成的导向治疗制剂在血中清除迅速，不残留于正常组织，尤其不在肾脏中积聚，因而毒副作用很小。PCR技术的应用，使制备单链免疫毒素在二周内即可实现，大大缩短了导向药物的制备时间。改善培养条件，E-coli能表达并装配和折叠成具有生物活性的双价ScFv及其免疫毒素。     

单链抗体及其在肿瘤免疫上的应用

随着分子生物学的进一步发展，抗体技术也逐步由细胞工程抗体向基因工程抗体演替，特别是单链抗体（ScFv）在理论和应用方面的研究令人尤为关注。ScFv应用范围的不断扩大和研究的不断深入，它在肿瘤的研究中也发挥了越来越大的作用。现综述ScFv的构建、表达及其在肿瘤免疫诊断和免疫治疗中的研究应用。     

单链抗体及其在肿瘤免疫上的应用

随着分子生物学的进一步发展,抗体技术也逐步由细胞工程抗体向基因工程抗体演替,特别是单链抗体(ScFv)在理论和应用方面的研究令人尤为关注。ScFv应用范围的不断扩大和研究的不断深入,它在肿瘤的研究中也发挥了越来越大的作用。现综述ScFv的构建、表达及其在肿瘤免疫诊断和免疫治疗中的研究应用。     

特异性抗肝癌噬菌体单链抗体的应用研究

目的体外观察特异性抗肝癌(HCC)噬菌体单链抗体(ScFv)对HCC细胞生长和凋亡的影响.方法通过构建的特异性抗HCC噬菌体ScFv库在大肠杆菌HB2151中表达,制备游离ScFv,应用细胞培养、DNA凝胶电泳和流式细胞仪(FCM)技术检测抗体对HCC细胞生长和凋亡的影响.结果特异性抗HCC噬菌体ScFv处理的HCC细胞的生长速度明显减慢,克隆形成和附壁能力减弱,细胞存活率降低,DNA凝胶电泳可见典型凋亡梯状带;FCM检测发现抗体处理后HCC细胞凋亡率达32.6%,明显高于对照组(P＜0.01).结论应用噬菌体表面呈现技术和基因克隆技术构建的特异性抗HCC噬菌体ScFv具有抑制HCC细胞生长、促进HCC细胞凋亡的功能.     

整合NGR肽抗EGFR单链抗体制备及其抗肿瘤活性研究

目的：利用大肠埃希菌表达基于抗表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR）单链抗体和靶向CD13环状NGR肽的双靶点重组融合蛋白ER（Fv）-NGR,研究其对肿瘤细胞的亲和能力和体内外抑制作用。方法：用基因工程的方法构建重组质粒pET-scfv-ngr,转入大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达带有His-tag标签肽的重组蛋白ER（Fv）-NGR,用Ni离子亲和柱进行纯化。运用细胞免疫荧光检测ER（Fv）-NGR与肿瘤细胞的结合;流式细胞术分析重组蛋白与肿瘤细胞的亲和力;克隆形成实验测定重组蛋白对肿瘤细胞体外增殖的抑制作用;利用人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤模型对ER（Fv）-NGR的体内抗肿瘤活性进行研究。结果：重组蛋白ER（Fv）-NGR由抗EGFR单链抗体和3个连续的环状NGR肽构成,相对分子质量约为27×10^4,以包涵体形式在大肠埃希菌内表达,表达量约为5mg／L。细胞免疫荧光结果表明,重组蛋白与EGFR和CD13皆高表达MCF-7细胞有较强的结合能力,而与正常HEK293细胞结合较弱。ER（Fv）-NGR与MCF-7细胞结合的解离常数为8．4×10-7nmol／L。ER（Fv）-NGR在体外对肿瘤细胞的增殖有抑制作用,作用于MCF-7和A549细胞的Ic50值分别为1．2×10^-6和4．7×10-mol／L。在体内对人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤有生长抑制作用,在10mg／kg药物剂量下28d对照组与实验组瘤体积分别为（1．06±0．17）和（0．63±0．11）cm2,F-18．7,P=0．003;瘤质量分别为（0．95±0．12）和（0．52±0．07）g,F=42．7,P〈0．001;抑瘤率为45．4％。结论：成功制备了基于单链抗体和靶向肽的双靶点融合蛋白ER（Fv）-NGR,其对肿瘤细胞具有良好的亲和力和体外增殖抑制作用,能够有效抑制裸鼠移植瘤的生长,为研制新型双靶点抗肿瘤药物提供依据。     

肿瘤基因工程抗体研究进展

综述单链抗体、抗体融合蛋白、抗独特型抗体、双特异性抗体的研究进展，显示它们在临床肿瘤治疗方面的良好应用前景。     

单链抗体及其融合蛋白在肿瘤诊治中的应用

单链抗体由于分子量小,免疫原性低,组织穿透力强,特异性好等优点,与单克隆抗体相比,在肿瘤的诊断和治疗方面展示了更好的应用前景.全文对近年来单链抗体及其融合蛋白在肿瘤导向诊断和治疗,肿瘤基因治疗和肿瘤疫苗方面应用研究进展做一综述.     

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体的表达及其对肿瘤细胞侵袭的抑制作用

目的：制备抑制肿瘤细胞侵袭转移的单链抗体片段,用于构建小型化的免疫偶联物。方法：应用噬菌体呈现技术,以产生抗Ⅳ型胶原酶单抗的杂交瘤细胞为基础克隆构建单链抗体（scFv)基因。以表达质粒pET-30a（＋）为载体在大肠杆菌中进行诱导表达。ELISA法测定表达产物的免疫反应性,明胶酶谱法测定表达产物对靶酶活性的影响。Boyden Chamber测定表达产物对肿瘤细胞侵袭的影响。结果：表达的单链抗体以包涵体形式存在,经变性和复性后,检测表明表达产物保留了对抗原的免疫反应性,对高转移性人肺癌PG细胞分泌的Ⅳ型胶原酶有抑制作用。同时在体外能抑制肿瘤细胞的侵袭,抑制率与表达产物的剂量浓度相关,1mg/ml浓度的片段具有68％的抑制率。结论：运用基因工程手段获得的单链抗体片段保留了亲本抗体的若干特性,对Ⅳ型胶原酶有抑制作用,并能抑制肿瘤细胞的侵袭。     

抗人大肠癌单链抗体基因的克隆与表达

背景与目的：单链抗体相对于完整抗体具有免疫源性低、对肿瘤组织穿透力强的特点,日益成为肿瘤诊断和治疗的良好导向载体。本研究的目的是将抗人大肠癌单克隆抗体ND－1的重链可变区VH和轻链可变区VL基因借助一短肽序列（Gly4Ser)3进行重组,构建单链抗体基因ND－1scFv,并使其在大肠杆菌中表达。方法：采用RT－PCR技术从能够分泌ND－1单抗的鼠杂交瘤细胞中扩增VH和VL基因,通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,体外构建ND－lscFv基因,经过常规转化和筛选,将其克隆至PET－28a( )表达载体,由IPTG诱导在大肠杆菌BL21中表达为ND－lscFv与His-Tag的融合蛋白。表达产物用Ni-NTA resin亲和层析方法纯化,并采用ELISA方法检测其免疫活性。结果：序列分析表明,ND－lscFv基因全长732bp,VH354bp位于上游;VL330bp位于下游。SDS－PAGE显示,重组蛋白相对分子量30kDa,与预期结果一致。scFv表达产物以不溶性包涵体形式存在,经亲和层析纯化后蛋白纯度达94％。ELISA结果显示scFv保留了与亲本抗体ND－1相似的免疫活性。结论：成功地构建了抗人大肠癌单链抗体ND－lscFv,并在大肠杆菌中获得了较高水平的功能性表达。     

单链抗体在肿瘤诊断、治疗中的应用研究

单链抗体是由免疫球蛋白的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)通过一段连接肽连接而成的重组蛋白,它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段。它分子小,容易进入肿瘤内部,免疫原性低,可用基因工程大量生产,克服了单克隆抗体在人体内应用的许多不足。在单链抗体C末端引入毒素、细胞因子、前体药物降解酶等构建双功能单链抗体,或者构建双特异抗体,在肿瘤诊断和治疗方面具有潜在的巨大的临床应用价值,目前国外的一些抗肿瘤单链抗体已进入临床Ⅰ期试验阶段。本文主要介绍了单链抗体在肿瘤诊断和治疗方面研究的新进展。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的：对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定，筛选肝癌抗体，同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法：PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定；通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果：ScFv基因插入率为70％。在亲和筛选过程中，肝癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定，均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC-7721呈阳性反应，阳性率为90％，15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明，以正常胎肝细胞L-02为对照，ScFv与肝癌结合比率为41．3％。特异性鉴定表明，其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论：利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因，且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

单链抗体在肿瘤治疗中的应用

单链抗体 (single- chain Fv,Sc Fv)是由抗体轻链和重链可变区基因 (VH、VL)通过一段编码连接肽基因拼接后表达形成的重组蛋白 ,是具有抗原结合能力的最小抗体片段。由于 Sc Fv分子量小 ,仅为Ig G的 1 /6 ,没有 Fc段 ,所以它与传统单克隆抗体相比具有组织穿透能力强、免疫原性低的优点 ;而且 ,作为一种基因工程抗体 ,Sc Fv具有较强的可塑性 ,容易改造 ,如抗体人源化、构建双功能抗体等。Sc Fv可以通过基因工程方法大量制备 ,克服了单克隆抗体腹水制备的有限性 ,因而制备方便 ,生产成本低。目前国内外已经研制出许多有关肿瘤的 Sc Fv…     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附洗脱扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果ScFv基因插入率为70%。在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定,均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC7721呈阳性反应,阳性率为90%,15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明,以正常胎肝细胞L02为对照,ScFv与肝癌结合比率为41.3%。特异性鉴定表明,其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

胃癌相关的人源单链抗体基因文库的构建

目的　构建胃癌相关的人源单链抗体基因文库。方法　应用DNA重组技术 ,从胃癌患者的转移淋巴结及其脾细胞mRNA中构建出组合单链抗体 (ScFv)cDNA文库。将cDNA文库克隆到噬菌粒载体 pCANTAB5 ,并转化大肠杆菌TG 1。随机对所得细菌克隆进行序列分析。结果　cDNA文库克隆到噬菌粒载体pCANTAB5后转化大肠杆菌TG 1,得到 2 .5× 10 7个氨苄青霉素菌落。ScFv序列分析结果证实VH 属于人源抗体VHⅢ亚群 ,VL 属于VκⅢ亚群。结论　胃癌相关的人源单链抗体基因文库的构建为进一步构建噬菌体单链抗体库奠定了基础     

基因工程抗体与IL-2融合蛋白研究的进展

利用基因重组技术构建抗肿瘤的小抗体／JL-2融合蛋白是肿瘤导向治疗中的一种新探索，这种策略治疗可增加肿瘤局部的IL-2浓度，减少其毒副作用．延长蛋白在体内的半衰期，更好地发挥IL-2介导的免疫细胞的抗肿瘤作用。本文就此融合蛋白的构建策略及表达、纯化的技术作一介绍。     

人源性肺癌噬菌体展示单链抗体库的构建

目的:构建人源性肺癌噬菌体单链抗体库,为筛选肺癌相关抗原的抗体奠定基础。方法:提取肺癌转移淋巴结总RNA,用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在体外将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,电转化至感受态的大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,形成噬菌体单链抗体库,采用限制性内切酶鉴定其多样性。结果:从肺癌转移淋巴结中成功提取RNA,逆转录PCR扩增出人可变区基因,连接形成单链抗体,最终构建了库容为1.2×108的抗人肺癌单链抗体库。BstNⅠ酶切法证明构建的抗体库具有良好的多样性。结论:成功地构建了噬菌体展示的抗人肺癌单链抗体库,为进一步筛选肺癌相关蛋白的可溶性抗体奠定了基础。     

基因工程抗体及免疫毒素抗肿瘤研究进展

基因工程免疫毒素由于具有高特异性、高细胞毒活性 ,是肿瘤治疗的方法之一。现就基因工程抗体及免疫毒素的改造、构建及其抗肿瘤研究进展作简要阐述     

基因工程抗体及免疫毒素抗肿瘤研究进展

基因工程免疫毒素由于具有高特异性、高细胞毒活性，是肿瘤治疗的方法之一。现就基因工程抗体及免疫毒素的改造、构建及其抗肿瘤研究进展作简要阐述。     

全人源食管癌单链抗体scFv 基因文库的构建

 目的 制备全人源化食管癌单链抗体scFv基因文库。方法 取食管癌病人癌肿周围淋巴结作为B细胞的来源，提取总RNA，用RT-PCR的方法获得抗体可变区基因cDNA文库。首先分别网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对，以cDNA为模板扩增VH和VL基因片段，再以它们为模板分别扩增VH-linker与VL-linker，用SOE-PCR技术将它们拼接成SCFv，再引入酶切住点Sfi I和Not I，胶回收PCR产物获得SCFv。将SCFv基因克隆入噬菌粒载体pCANT心5E后电转入Ecoli TG1。PCR法鉴定抗体基因插入率，1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物。结果 食管癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的28S、18S条带；VH基因的大小约为450bp。VL基因为350bp，组装后的scFv基因约为850bp。PCR连接产物的转化效率为2×10^7efu／μg，SCFv的阳性插入率为91．7％（22／24）。结论 食管癌相关的人源单链抗体基因文库的构建为进一步筛选单链抗体库奠定了基础。     

免疫毒素的抗肿瘤研究及其改善策略

免疫毒素由特异性的单克隆抗体或生长因子与具有杀伤作用的毒素分子通过化学交联构建而成.它通过抑制癌细胞的蛋白合成或促进癌细胞凋亡发挥抗癌作用.与其他抗肿瘤药物相比,具有毒性强和特异性高的优点,在肿瘤治疗中显示出巨大的应用前景.但进入临床应用还存在很多限制性因素.