大鼠耳蜗大上皮嵴的形态学演变

目的 观察不同胚胎期的大鼠和新生大鼠耳蜗大上皮嵴形态上的变化。方法选取胚胎期14、16、18、20天和出生后当天、2、5、7、10、14天等10个时间段的大鼠耳蜗，分别进行冰冻切片和HE染色。结果毛细胞的分化成熟是从底回向顶回进行，顶回较底回有1～2天的延迟。大上皮嵴结构重排、细胞减少从腔侧开始，出生后2周左右当毛细胞分化成熟时消失。结论胚胎期14天前后是大上皮嵴形态演变的关键时期。大上皮嵴是耳蜗形态不成熟的标志之一。     

大鼠耳蜗大上皮嵴及小上皮嵴细胞永生细胞系的建立

目的：建立大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生细胞系。方法：取P1大鼠耳蜗,分离出耳蜗上皮薄片组织,并与含SV40-LT抗原的逆转录病毒共培养,从而实现细胞的永生化。利用单克隆法纯化细胞系,并通过形态学、免疫组织化学等方法对细胞系进行鉴定。结果：大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生细胞系基本保持了细胞原代的表型特征：呈现上皮细胞样的多角形外观;不同世代的细胞均表达Isletl及SV40-LT抗原。该系目前已培养3个月,超过20代,传代时间为3～4d,传代比例为1：5。结论：本实验成功建立了大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞的永生细胞系,这为大、小上皮嵴细胞生物学特性及相关功能,特别是毛细胞再生及前体细胞移植治疗感音神经性聋方面的研究奠定了坚实的实验基础。     

p27Kip1在不同时期大鼠耳蜗大上皮嵴的表达

目的观察p27Kip1在不同时期大鼠耳蜗的大上皮嵴中的表达情况,探讨p27Kip1在毛细胞分化和再生过程中的作用.方法对胚胎期12天、13天、14天、16天、18天、20天和出生后当天、2天、5天、7天、10天、14天等12个年龄段的大鼠耳蜗进行冰冻切片,然后以1:100抗p27Kip1小鼠单克隆抗体为一抗,1:200异硫氰酸荧光素标记山羊抗小鼠IgG为二抗,进行免疫荧光组织化学检查.结果①胚胎期14天时,p27Kip1开始在蜗管表达,其表达限于原始柯蒂氏器.原始柯蒂氏器中全部细胞均着色.②胚胎期20天左右时,p27Kip1开始在大上皮嵴细胞表达,而在毛细胞中停止表达,但在支持细胞中仍有表达.③出生后7天时,p27Kip1在大上皮嵴的表达达到最强,之后其表达减弱,直至出生后2周时大上皮嵴结构消失.④p27Kip1在耳蜗发育成熟后仍在支持细胞中表达.结论p27Kip1可以作为听感觉上皮的一个标记物.p27Kip1在大上皮嵴细胞中表达,对正常数目毛细胞的产生和耳蜗嵌合体的形成有重要作用.p27Kip1在支持细胞中长期表达是哺乳类毛细胞不能再生的原因之一.     

转基因诱导新生大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞分化为毛细胞样细胞实验

目的通过转染Hathl基因诱导大鼠耳蜗大上皮嵴细胞（greater epithelial ridge,GER）和小上皮嵴细胞（1esser epithelial ridge,LER）分化为毛细胞样细胞。方法取出生后第l天的大鼠耳蜗,利用机械分离和酶消化相结合的方法分别分离出纯的GER和LER细胞,并转染Hathl基因,培养后做免疫组化染色观察。结果GER和LER体外培养并转染Hathl基因后,免疫组化检测显示肌球蛋白（myosinVIIa）染色阳性,表达毛细胞的特异标记物。提示GER和LER已分化为毛细胞样细胞。结论GER和LER细胞作为毛细胞前体细胞可以实现体外培养,转染Hathl后．可分化为毛细胞样细胞。     

三种基因转录因子在大鼠耳蜗大上皮嵴的表达

目的检测Mathl、Hesl及Hess在大鼠耳蜗大上皮嵴（greater epithelial ridge，GER）的表达，初步探讨各基因对毛细胞分化和再生的作用。方法分别取出生当天（P0），出生后第1天（P1）、第3天（P3）、第4天（P4）和第5天（P5）大鼠耳蜗，利用机械分离和酶消化相结合的方法分离出相对纯化的GER细胞。Trizol法提取GER细胞总RNA，逆转录聚合酶链反应检测Mathl、Hesl及Hes5在GER的表达，琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果Mathl在P0—P5大鼠GER均有表达，Hesl只在P0～P3大鼠GER有表达，而Hes5在P0—P5大鼠GER中均无表达。结论Mathl的表达水平可能只有累积至一定量，才能诱导GER增殖、分化成毛细胞，并且此过程可能同时受Hesl的控制。     

大鼠耳蜗大上皮嵴细胞体外培养的实验观察

目的建立大鼠耳蜗大上皮嵴（greater epithelial ridge，GER）细胞体外培养体系，探讨其在离体培养条件下的生物学特性、生长模式及超微结构。方法取生后1d大鼠耳蜗，利用机械分离和酶消化相结合的方法分离出纯GER细胞，分别于无血清和含10％胎牛血清的DMEM培基中进行培养，观察细胞生长特性，并对培养物进行溴脱氧尿苷（BrdU）、鬼笔环肽（phalloidin）、Z01、钙视网膜蛋白（calretinin）及肌球蛋白VIIa（myosin VIIa）免疫组化鉴定及扫描电镜观察。结果GER体外培养细胞呈现典型的上皮样多角形外观，细胞间连接紧密，具有明显的增殖能力，在含血清培养基中易形成贴壁细胞岛，而在无血清培养条件下则易形成悬浮细胞球。GER细胞呈现BrdU、phalloidin以及Z01染色的阳性反应，而calretinin及myosinVIIa则表现为阴性。扫描电镜显示GER细胞表面可见微绒毛和中心体，但未见毛细胞特异性结构纤毛束。结论GER体外培养细胞具有增殖能力，在不同培养条件下可分别呈现贴壁细胞岛及悬浮细胞球生长特性，GER细胞表达上皮细胞来源标记物，但不表达毛细胞特异性标记物。     

大鼠耳蜗毛细胞前体细胞与耳蜗间质细胞共培养的实验研究

目的探讨耳蜗间质细胞对耳蜗毛细胞前体细胞--大上皮嵴（greater epithelial ridge,GER）细胞的诱导分化作用。方法取出生后第1天大鼠20只,随机分为2组,每组各10只,利用酶消化和机械分离相结合的方法分别分离出纯耳蜗GER细胞和耳蜗间质细胞,并进行体外混合培养及形态学的观测,对共培养10天的标本行抗Calretinin（标记幼稚毛细胞）及抗p27抗体（标记支持细胞）的免疫细胞组织化学染色鉴定。结果混合培养的耳蜗GER细胞和间质细胞易形成片状细胞岛,共培养10天后,有部分细胞表达Calretinin,亦有少数细胞表达p27,但无Calretinin及p27双标记者。结论GER细胞与耳蜗间质细胞共培养,可以诱导GER细胞分化为毛细胞及支持细胞表型。     

诱导新生大鼠耳蜗大上皮嵴细胞分化为毛细胞样细胞

目的大鼠耳蜗大上皮嵴细胞（greater epithelial ridge,GER）转染Hath1基因,与耳蜗间质细胞共培养诱导分化为毛细胞样细胞。方法取出生后第1天的大鼠耳蜗,利用机械分离和酶消化相结合的方法分离出纯的GER细胞,与耳蜗间质细胞共培养或转染Hath1基因培养,做免疫组化和扫描电镜观察。结果GER体外培养具有增殖能力,GER与耳蜗间质细胞共培养或转染Hath1基因后,免疫组化MyosinVIIa阳性,扫描电镜部分细胞的表面可见不成熟的纤毛样结构,提示GER已分化为毛细胞样细胞。结论GER细胞作为毛细胞前体细胞可以实现体外培养,与耳蜗间质细胞共培养或转染Hath1后,可分化为毛细胞样细胞。     

大鼠多通道人工耳蜗植入模型的建立

目的:建立多通道人工耳蜗植入的大鼠动物模型.方法:5只正常听力的Hooded Wister大鼠经药物致聋后,采用在前期研究中所创立的新手术步骤,在鼓阶内植入多通道电极.对双极电刺激诱发的听性脑干反应(EABRs)进行分析,对耳蜗组织学切片进行评价.结果:在电极植入后,顺利描记到正常EABRs波形,从而确认了有效的人工耳蜗功能状态.组织学观察表明,电极植入后的大鼠耳蜗内未见组织结构的严重损伤.结论:本文介绍的大鼠多通道人工耳蜗植入法有效,安全,所建立的大鼠动物模型为进行多通道人工耳蜗植入研究提供了一个新的途径;也为其他小啮齿动物(如沙鼠和小鼠)的实验性耳显微外科研究提供了思路.     

Hath1基因诱导新生大鼠大上皮嵴细胞形成毛细胞样细胞

目的 探讨Hathl(human atonal homolog 1)基因对大鼠耳蜗大上皮嵴(greater epithelialridge,GER)细胞的诱导分化作用.方法 取出牛后1 d大鼠耳蜗,利用酶消化和机械分离相结合的方法分离出GER细胞,并行体外培养.以腺病毒为载体,对GER细胞培养物进行Hath1基因和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因(ad-Hath1-EGFP)的转染,单纯转染EGFP(ad-EGFP)作为对照组,对感染后不同灭数的标本行毛细胞特异性标记物myosin Ⅶa免疫组化染色鉴定.结果 ad-Hathl-EGFP组中的GER细胞中出现了myosin Ⅶa和EGFP双标记细胞,并且从感染后第5天开始出现myosin Ⅶa阳性细胞,随后阳性细胞的数量有所增加,但增加不明显;而ad-EGFP组感染后3～12 d的GER标本均未见myosin Ⅶa阳性细胞.结论 GER细胞可能是耳蜗毛细胞的前体细胞,Hath1基冈过表达可以诱导GER细胞向毛细胞样细胞(myosin Ⅶa阳性)分化.     

大上皮嵴与哺乳类耳蜗毛细胞的分化和再生

位于感觉上皮外的大上皮嵴细胞经诱导能产生大量异位毛细胞,这是毛细胞再生的一条新的途径,将来也许有助于感音神经性聋的治疗。本文概述了大上皮嵴中异位毛细胞的产生及其分子水平机制,最后介绍目前存在的问题及将来的发展趋势。     

人类耳蜗感觉细胞自然培养方法探讨

目的在体外对人类耳蜗感觉细胞进行成功培养。方法参照用于豚鼠的有关技术,选择死亡6 h内的新生儿尸体,取出其耳蜗,采用微分离技术分离耳蜗感觉上皮细胞块并对细胞块酶解,加入可分量的细胞培养液制成含低密度的分离细胞混悬液,分置培养皿中,置培养箱中培养。结果获得了对人类耳蜗感觉细胞进行分离和培养的技术。结论成功分离出耳蜗感觉细胞并使用自制的细胞培养液进行了长期自然培养,为以后进一步研究耳蜗感觉细胞（包括耳蜗干细胞）积累了经验。     

荧光定量PCR测定水杨酸钠作用后大鼠耳蜗基因的表达

目的了解HSP27基因在大剂量水杨酸钠作用后大鼠耳蜗中表达水平,并探讨其在水杨酸钠耳毒性中的意义。方法将Wistar大鼠各15只分成水杨酸钠作用组和正常对照组,应用SYBR GREEN I实时监测的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),检测大鼠耳蜗中HSP27基因在长期大剂量水杨酸钠作用后和正常对照组中的表达,并用管家基因β actin作为内参。结果水杨酸钠作用后大鼠耳蜗中HSP27基因的表达水平高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01)。结论SYBR GREEN I定量PCR法可以作为一种良好的方法对来源珍贵的微量组织的基因表达进行检测, 水杨酸钠能够明显诱导HSP27基因在大鼠耳蜗中的表达。