人易感H6N1禽流感病毒血凝素蛋白的B细胞抗原表位预测及进化分析

目的预测人易感H6N1禽流感病毒血凝素蛋白的B细胞抗原表位,并分析其进化特征。方法从GISAID和Gen Bank两大数据库获得人易感H6N1病毒的血凝素蛋白及近缘序列,采用多款预测软件分别预测了其B细胞线性和构象型抗原表位,并分析了这些表位的保守性、适应性和进化特征。结果综合各种因素共预测出4个线性表位(表位A、B、C和D)和2个构象型表位(表位E和F)。表位C和位点41、157、186、187在进化过程中易发生突变,其余表位较为保守,其中表位D最保守;位点157受到强烈的正选择作用,它可能是H6N1病毒逃避宿主免疫系统攻击的一个关键位点。结论人易感H6N1禽流感病毒血凝素蛋白拥有5个保守的B细胞抗原表位(3个线性、2个构象型)和1个正选择作用位点,将为其疫苗的研制、致病机制的理解和病毒防治提供理论基础。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞表位预测及抗原性分析

目的:预测H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞相关抗原表位,并初步分析其抗原性.方法:依据近年H5N1亚型禽流感病毒流行趋势,下载得到相关HA蛋白氨基酸序列.进行生物信息学综合分析预测,获得Th和B细胞相关抗原表位,并比较其保守性和特异性.通过BALB/c小鼠和SPF鸡H5N1亚型禽流感病毒阳性血清,初步鉴定候选表位抗原性.结果:综合多项预测及空间构象模拟结果,我们获得了三条候选Th和B细胞表位,分别为HA141～155、HA206～223、HA302～316.候选表位处于H5N1亚型禽流感HA1 蛋白序列上相对保守的区域内,且与目前流行的H5N1亚型禽流感病毒HA相应区域具有较好的一致性.而不同候选表位在BALB/c小鼠和SPF鸡H5N1亚型禽流感病毒阳性血清反应中显示了不同抗体结合能力,预示了其成为功能表位的可能.结论:所筛选的表位具有成为H5N1亚型禽流感病毒HA Th和B细胞相关抗原表位的可能.本研究为深入揭示流感病毒感染与免疫机制,H5N1亚型禽流感功能表位认知及表位疫苗研究奠定了基础.     

广东新型甲型H1N1病毒血凝素基因分子进化与变异

目的 揭示广东地区2009-2011年新型H1N1病毒血凝素基因(HA)进化特征及抗原表位变异特征.方法 采用时空抽样方法抽样,检测2009-2011年广东分离的24株新型H1N1病毒HA基因核苷酸序列,与GenBank中44株国外相应序列比较;比对HA基因核苷酸序列,分析基因分子变异,构建分子遗传动力学MCMC进化树;同时分析2009-2011年广东毒株HA基因的抗原表位变异情况.结果 68株HA基因进化树显示,广东毒株进化树主干至少分为6大分支;其中2011年毒株聚类为2个(Ⅴ和Ⅵ)主要分支,各具基因特征.变异频率较高的位点包括391、467、202和214位,正向选择位点包括8、145和391;广东毒株抗原表位区发生S145L/P、L208I、Q240R、S160G和G187R位点变异.2009年广东毒株HA基因分支Ⅰ毒株可能于2010年传播到亚洲、欧洲和澳洲地区.结论 广东新型H1N1病毒HA基因变异具有传播特征(Ⅰ)和地区特征(Ⅵ),位于抗原表位Ca、Sa和Sb的氨基酸发生变异,其中位点145等变异频率较高,承受着正向选择压力.     

禽流感病毒(H5N1型)血凝素(HA)T细胞抗原表位的预测

目的：应用免疫信息学的方法寻找不同来源的H5NI型禽流感病毒血凝素（HA）的共同抗原决定簇，为发展H5NI型禽流感病毒的表位疫苗打基础。方法：从GeneBank下载不同来源的H5NI型禽流感病毒血凝素（HA）的氨基酸序列，先使用Clustal W1．83生物软件对这些氨基酸序列进行同源性比较，然后使用SYFPEITHI生物学软件分析不同来源氨基酸序列的MHCI类分子提呈的抗原肽（抗原决定簇），最后寻找共同的、且和MHCI类分子结合比较强的抗原肽。结果：不同来源的氨基酸序列同源性虽然不尽相同，但是，他们之间也有一些相同的、并且和MHCI类分子结合比较强的抗原肽。结论：利用这些相同的、并且和MHCI类分子结合比较强的抗原肽有可能发展H5NI型禽流感病毒表位疫苗，用来预防H5NI型禽流感。     

H1N1亚型流感病毒血凝素Th和B细胞表位预测及抗原性分析

目的:应用生物信息学方法预测H1N1亚型流感病毒血凝素Th和B细胞相关抗原表位,并初步分析其抗原性,为研制H1N1亚型流感病毒的表位疫苗奠定基础.方法:依据近年流感病毒流行趋势,从GenBank下载具有代表性的H1N1亚型流感病毒HA蛋白氨基酸序列.进行生物信息学综合分析预测,获得Th和B细胞相关抗原表位,并比较其保守性和特异性.通过Balb/c小鼠H1N1亚型流感病毒阳性血清与表位肽的结合试验,初步鉴定候选表位抗原性.结果:综合多项预测及空间构像模拟结果,我们获得了三条候选Th和B细胞表位,分别为HA_(73～87)、HA_(125～139)、HA_(188～205).候选表位处于H1N1亚型流感HAI蛋白序列上相对保守的区域内,且与目前流行的H1N1亚型流感病毒HA相应区域具有较好的一致性.而不同候选表位在BMB/e小鼠H1N1亚型流感病毒阳性血清反应中显示了不同抗体结合能力,预示了其成为功能表位的可能.结论:所筛选的表位具有成为H1N1亚型流感病毒HA Th和B细胞相关抗原表位的可能.此研究为深入揭示流感病毒感染与免疫机制,H1N1亚型流感功能表位认知及表位疫苗研究奠定了基础.     

H5N1型高致病性禽流感病毒血凝素蛋白及神经氨酸酶的B细胞抗原表位预测

目的预测H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白和NA蛋白的B细胞表位,为基于B细胞表位的预防性疫苗设计提供依据。方法基于HA蛋白和NA蛋白的蛋白质序列,采用Kyte-Doolittle的亲水性方案,Emini方案,Karplus方案和Jameson-wolf抗原指数方案,并辅以MAGE蛋白的二级结构柔性区域分析,预测HA蛋白和NA蛋白的B细胞表位。结果分别预测出了6条血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)以及6条神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)B细胞优势表位。结论这些B细胞表位可为禽流感疫苗的研制提供实验依据。     

我国分离人H5N1禽流感病毒血凝素基因特性的研究

目的 分析我国分离的人高致病性禽流感H5N1病毒的抗原性以及基因特性.方法 对所分离的H5N1病毒的血凝素基因和神经氨酸酶基因进行序列测定.结果 对血凝素基因的序列测定结果表明从我国分离的H5N1病毒具有较高的同源性,但是与越南、泰国等国家分离的H5N1病毒明显不同.序列测定的结果同时表明无论是受体特异性还是连接肽都是禽源的.结论 目前我国分离的H5N1病毒属于同一个组,与泰国、越南分离毒株不同,并且发现病毒的特性仍然是禽源的,没有发现从禽到人的重组或者重配。     

整合深圳人源H5N1禽流感病毒株血凝素蛋白的假型逆转录病毒的构建

目的 构建整合深圳人源H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)株血凝素(HA)的假型逆转录病毒.方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增深圳人源H5N1禽流感病毒株HA基因,将扩增产物与pGEM-T载体连接,在经过酶切及测序鉴定后,通过Sal Ⅰ与BamHⅠ酶切位点将HA基因克隆至真核表达载体CMV/R,然后协同转移载体pHR-Luc、包装载体pCMV&8.2通过磷酸钙共沉淀法转染人胚肾细胞(293T),72 h后收集假病毒上清,超速离心后通过Western blot鉴定假病毒颗粒HA、P24蛋白的表达,同时测定HIV-HA假病毒对犬肾传代细胞(MDCK)、宫颈癌上皮细胞(HeLa)、中国仓鼠卵母细胞(CHO)和293T等4种不同细胞株的感染活性.结果 深圳人源HSN1禽流感病毒株A/Shenzhen/406H/06属于subelade2.3,其HA基因开放读码框编码567个氨基酸,在GenBank登录号为EF137706.经Sal Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切鉴定HA基因成功克隆至真核表达载体CMV/R.将pHR-Luc、pCMV&8.2、CMV-HA共转染293T细胞后,所收集的假病毒经Western blot证实假病毒颗粒不仅含有HIV基质蛋白P24,还可以整合AIV HA蛋白,并且能够由前体蛋白HA0裂解为具有生物活性的HA1和HA2蛋白.HIV-HA假病毒可以感染MDCK、HeLa、CHO、293T等4种靶细胞,表明所构建的假病毒具有感染活力,且具有广泛的宿主范围.结论 本研究成功构建整合A/Shenzhert/406H/06 HA蛋白的假型逆转录病毒,并且HIV-HA假病毒具有良好的感染活性,从而为下一步筛选中和抗体及抗原表位分析奠定基础.     

广东地区人禽流感H5N1毒株的核蛋白基因变异和进化

目的通过对人禽流感H5N1毒株核蛋白（NP）基因序列的变异分析，揭示毒株NP基因变异与进化。方法检测广东地区人禽流感H5N1毒株NP基因核苷酸序列，同时检索全球人禽流感H5N1毒株NP基因序列，采用DNAStar5．0软件对检索的人禽流感H5N1毒株NP基因核苷酸序列进行比对和分析；并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析。结果1997--2006年45株毒株胛基因核苷酸序列同源性分成3类，1997--1998年毒株为第1类，2004--2005年毒株为第2类，2003年毒株和2006年毒株为第3类；NP基因35个氨基酸位点全部置换，占7．03％（35／498）；2003—2006年H5N1毒株通过氨基酸第430位（1〈430T）位点的置换，增加一个糖基化位点（NGT430-432；GD—01—06毒株第370位发生N3加S变异；增加一个糖基化位点（NES368.370）。同义变异中，NP基因Ks（同义变异速度）值为2．03×10^-5～2．55×10^-5核苷酸／d，Ka（错义变异速度）值为1．58×10^-6～3．10×10^-6核苷酸／d，检验发现进化无明显选择性压力存在。结论1997--1998年毒株、2004--2005年毒株、2003年毒株和2006年毒株NP基因核苷酸有差异；2003--2006年人禽流感H5N1毒株NP基因增加一个糖蛋白位点、GD-01—06毒株再增加一个糖蛋白位点可能改变毒株抗原性。人禽流感H5N1毒株在自然界变异频繁，随着其自然进化，H5N1毒株具有人．人传播能力的概率较大。     

MD-2的B细胞抗原表位预测

目的 利用生物信息学预测髓样分化蛋白-2（myeloid differentiation protein-2，MD-2）的B细胞抗原表位，为MD-2特异性抗体的制备提供实验基础。方法 采用多种生物软件和互联网服务器，以单参数（亲水性、抗原性、可及性及可塑性）预测为基础，二级结构预测初步筛选，抗原指数最终确定的方法预测MD-2的B细胞抗原表位。结果 96～110序列（RGSDDDYSFCRALK）的亲水性和抗原指数（AI=0．043）显著高于其他候选片断；65～76序列（YIPRRDLKQLYF）和107～117序列（ALKGETVNTTI）的A1分别为0．0063和0．0036。结论 96—110序列（RGSDDDYSFCRALK）是MD-2的B细胞优势抗原表位。     

人Izumo蛋白的二级结构及B细胞抗原表位预测

目的:预测人Izumo蛋白的二级结构及B细胞抗原表位.方法:以人Izumo基因序列为基础,按Chou-Fasman和Gamier-Robson方法预测其编码蛋白的二级结构,采用Karplus-Schulz方法预测Izumo蛋白骨架区的柔韧性;按Kyte-Doolittle方法预测其亲水性、Emini方法预测蛋白质表面可能性及Jameson-Wolf方法预测抗原性指数.结果:Chou-Fasman及Gamier-Robson两种方法预测的结果均表明,Izumo蛋白含较多的α螺旋,蛋白第6～17、30～40、88～99、103～120、153～160、173～188、249～260、283～297、334～338和339～346区段可能是α螺旋中心,第21～25、198～200、245～248和320～323区段可能是β折叠中心.用Kyte-Doolittle、Emini和Jameson-wolf方法分别对Izumo蛋白B细胞抗原表位进行预测结果表明,蛋白质第36～42、62～66、94～99、118～122、129～132、151～154、161～164、173～177、205～208、212～216、256～265、271～276、283～288、314～318和336～350区段附近很可能为B细胞表位优势区域.结论:该研究结果有助于确定Izumo蛋白的B细胞优势表位及发挥免疫避孕的活性部位.     

人偏肺病毒黏附蛋白的二级结构及B细胞表位初步预测

目的预测人偏肺病毒G蛋白的二级结构及B细胞表位。方法分别采用SOPMA方法及HMMTOP程序预测G蛋白的二级结构和跨膜区域；综合分析蛋白的柔性结构、亲水性、表面可及性与抗原性指数，预测G蛋白的抗原表位。结果G蛋白的二级结构主要为柔性区域，占62．1％；廿螺旋占22．37％；β-折叠占15．53％；N端第32～51位氨基酸残基为跨膜区。B细胞表位位于G蛋白N端55—77、80-104、111～126、130～167、178—210区段。结论应用多参数预测G蛋白的二级结构与B细胞表位，为进一步研究蛋白特征、单克隆抗体制备及表位疫苗研制奠定了基础。     

应用合成肽研究柯萨奇B病毒衣壳蛋白VP1共的抗原表位

对柯萨奇Ｂ４病毒（ＣＶＢ４）衣壳蛋白ＶＰ１保守区的亲水性和二级结构进行分析和预测，选择可能代表优势抗原表位的肽段进行合成（ＶＰ１－１肽，ＲＩＹＦ ＫＰＫＨＶＫ ＡＹＶ），并截取了该肽段的前１２个残基（ＶＰ１－２肽）用同样方法进行合成。用ＶＰ１－１肽免疫家兔制备出高效阶抗体，应用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测，这些抗体与ＣＶＢ１－６病毒均有结合反应，ＶＰ１－１肽与型特异性ＣＶＢ１－６抗体均有良好的     

禽流感病毒血凝素H5特异性单克隆抗体的制备及ELISA捕获法的建立

目的 制备和鉴定禽流感病毒(H5N1)血凝素(H5)特异性单克隆抗体(mAb),建立H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法.方法 以H5血凝素和携带H5全长基因的质粒免疫Balb/c小鼠制备mAb,利用血凝抑制(HI)实验筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验筛选捕获抗体和检测抗体,建立测定H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法.结果 获得16株特异性针对H5的单克隆抗体,与A型流感病毒H1、H3、H7、H9和B型流感病毒的血凝素无HI交叉反应,对H5血凝素的血凝抑制效价为1:100～1:51 200;通过配对实验,建立以单克隆抗体H5M9为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记单克隆抗体H5M11为检测抗体的双抗体夹心ELISA;检测多株H5N1病毒和H5血凝素的最低检出值为1/32血凝单位,检测A型流感病毒H1N1、H3N2、B型流感病毒以及H7、H9血凝素均为阴性.结论 建立了一种灵敏度高、特异性强的测定H5抗原的ELISA捕获法,可应用于禽流感病毒H5N1感染的实验室早期诊断.     

2009-2011年广东省甲型H1N1流感病毒血凝素基因的进化特征

目的 了解2009-2011年广东甲型H1N1流感病毒血凝素基因的HA1进化特征。方法 选取广东甲型H1N1流感病毒83株,提取病毒RNA,经RT-PCR反应扩增HA1并测序,测定的序列用生物信息软件分析,与GenBank中相关序列比较,并对推导的编码氨基酸序列进行进化分析。结果 2009-2011年广东甲型H1N1流感病毒HA1基因的进化速率是5.2× 10-3,高于人季节性H1N1病毒;变异氨基酸多数位于HA蛋白表面,其中部分位于抗原决定簇;在两例死亡病例分离株HA1的第222位氨基酸发生D222G/D222N变异。结论 遗传进化分析表明,甲型H1N1流感病毒发生了一定程度的变异,造成2011年初在广东的再次流行。HA1的第222位氨基酸变异可能与疾病的严重程度有关。     

人乳头瘤病毒外壳蛋白B—细胞表位的研究进展

本文以HPV16的L1及L2为中心 ,就HPV外壳蛋白B 细胞表位研究的一般方法、实验方法与B 细胞表位确定的关系、交叉反应与共同表位之间的关系以及B 细胞构像表位位点的确定等四个方面 ,综述了国外近些年关于L1和L2蛋白B 细胞表位的研究现状。     

噬菌体文库与计算机模拟筛选H1N1 流感病毒血凝素结合位点的比较

目的:对H1N1 流感病毒血凝素HA 的抗原表位初步筛选。方法:用噬菌体展示文库对2 株抗体的结合位点进行筛选,将筛选的抗原位点结合HA 序列进行多肽合成,免疫小鼠制备单克隆抗体,通过分子生物学手段对4 株抗体的轻链和重链可变区基因进行调取,通过计算机模拟抗体序列结合的抗原的结构域,推测抗体结合的氨基酸位点。结果:噬菌体文库筛选得出抗体的结合序列富含组氨酸和精氨酸,将针对多肽的单克隆抗体的序列和前期获得的2 株抗HA 单克隆抗体的序列比对分析,发现A1-8 和anti-14p 结合的HA 抗原序列相一致,H1-13 和anti-11p 结合的HA 抗原序列相一致。结论:通过将噬菌体展示文库技术和计算机模拟预测抗原抗体结合,可以有效筛选抗原表位,为流感病毒HA 抗原表位预测方法的完善提供理论基础。