规模化引种场进口奶牛隐孢子虫种类、基因亚型鉴定及其生物安全评价

目的为了解进口奶牛寄生的隐孢子虫对引种场污染情况及是否影响隐孢子虫种类和基因型在当地的分布。方法采用PCR方法检测河南省某规模化引种场奶牛隐孢子虫感染情况。结果基于18S rRNA基因位点进行PCR检测,奶牛隐孢子虫总感染率为17.8%(90/507),鉴定出4种隐孢子虫,分别为微小隐孢子虫、牛隐孢子虫、芮氏隐孢子虫和安氏隐孢子虫,隐孢子虫感染率随牛年龄增长而呈递减趋势,差异有统计学意义(P<0.01)。断奶前犊牛以微小隐孢子虫为优势感染种,断奶前犊牛腹泻与微小隐孢子虫感染呈正相关性,差异有统计学意义(P<0.01)。基于gp60基因位点,43份微小隐孢子虫阳性样品成功扩增出35份,序列分析显示35个微小隐孢子虫均为人兽共患基因亚型IIdA19G1, 而奶牛引种地(澳大利亚)的牛源微小隐孢子虫均为IIa亚型家族存在显著不同。结论证实微小隐孢子虫为犊牛腹泻病原之一,IId亚型为中国独特分布的微小隐孢子虫亚型,其基因亚型存在地理隔离遗传特征,引种青年牛和成年牛不影响当地重要人兽共患虫种微小隐孢子虫基因亚型分布,从这个角度考虑不具有生物安全重要性。     

开封地区奶牛隐孢子虫种类及基因型鉴定

目的探讨开封地区奶牛隐孢子虫感染情况和种类分布。方法采用饱和蔗糖溶液漂浮法检查新鲜粪便样本的隐孢子虫卵囊,用18S rRNA基因对隐孢子虫进行PCR扩增和限制性片段长度多态性分析;基于gp60基因位点对微小隐孢子虫进行基因亚型鉴定。结果粪便样本中隐孢子虫阳性率为8.4% (52/622),不同调查点、年龄段和养殖条件下奶牛隐孢子虫感染率具有统计学意义(P<0.01)。基于18S rRNA基因位点成功扩增出50个样本,分别经Ssp I和MboII酶切进行鉴定,发现安氏隐孢子虫为优势虫种,为23份,微小隐孢子虫、牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫分别为5份、12份和6份,4份为牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫混合感染。序列分析显示5个微小隐孢子虫均为人兽共患基因亚型IIdA19G1。结论开封地区奶牛感染人兽共患微小隐孢子虫基因亚型,具有人兽共患传播的可能性。     

合肥地区奶牛源隐孢子虫的分离与鉴定

目的分离合肥地区奶牛源隐孢子虫,并鉴定其种类。方法采集安徽省合肥市某奶牛场285头成年母牛粪样,采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检测牛粪中隐孢子虫卵囊,并分离纯化隐孢子虫阳性粪样中的卵囊,抽提其基因组DNA作为模板,根据隐孢子虫18S rRNA和HSP70基因设计引物,用PCR和巢式PCR方法扩增目的片段,对巢式PCR产物进行克隆、测序,并运用DNAStar软件对序列进行同源性比对,构建系统进化树。结果两种方法检测均为阳性的粪样有5份,感染率为1.8%(5/285)。隐孢子虫卵囊呈椭圆或卵圆形,饱和蔗糖溶液漂浮法分离的隐孢子虫卵囊大小为7.37μm×6.13μm,形状指数(长/宽)为1.20;改良抗酸染色法检获的隐孢子虫卵囊大小为7.58μm×6.20μm,形状指数为1.22。巢式PCR扩增出的18S rRNA和HSP70基因片段分别为250 bp和325 bp。合肥奶牛源隐孢子虫5株分离株18S rRNA基因与安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)DQ989573序列一致性最高,两者在系统进化树上为同一分支。这5株分离株的HSP70基因序列与安氏隐孢子虫AY954892和D...     

宁波市腹泻患者隐孢子虫分子鉴定及基因特征分析

目的通过了解宁波市某哨点医院临床腹泻患者隐孢子虫感染情况及基因特征分析,为临床探究腹泻病因提供新思路。方法2019年11月—2021年7月,收集宁波市某哨点医院临床腹泻患者粪样650份,提取粪样中基因组DNA,巢式PCR扩增隐孢子虫核糖体小亚基RNA (SSU rRNA)基因,产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增出条带的阳性粪样DNA进行60-kDa糖蛋白（gp60）基因的巢氏PCR扩增,产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。将与目的条带大小相近的PCR扩增产物进行双向测序,根据GenBank公共数据库资源行BLAST分析,使用Clustal X 2.1软件比对和校准,根据序列分析结果进行隐孢子虫虫种鉴定和亚型分型。运用Mega 11.0软件,以neighbour-joining (N-J)法绘制系统进化树。结果收集的粪样中男性腹泻患者369份（56.8%）,女性腹泻患者281份（43.2%）;年龄分布为1～99岁。经SSU rRNA基因扩增,仅1份DNA样品在830 bp左右出现特异性条带,呈隐孢子虫阳性。患者为53岁的男性,农民,水样便。经核苷酸序列分析,鉴定为火鸡隐孢子虫感染,与上...     

中国奶牛源微小隐孢子虫分子流行病学及其亚型分布

在全球范围内,大多数微小隐孢子虫亚型为人兽共感染虫株。奶牛是微小隐孢子虫自然感染的重要宿主,也是人隐孢子虫病的重要传染来源。本文阐述了奶牛源微小隐孢子虫分子流行病学研究进展,分析中国奶牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型的分布特征和多样性分布规律,探讨Ⅱd亚型变异发展趋势,这对微小隐孢子虫病的防控具有重要意义。     

人源隐孢子虫分离株种类鉴定与种系发育关系分析

目的确定郑州某医院分离到1株隐孢子虫(PRHN)所属种/基因型。方法用PCR对该分离株18S rRNA、HSP70、Cpn60和AOX进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序,扩增序列经用DNAstar和ClustalX与GenBank参考序列比对,用PAUP4.0构建种系发育进化树,以确定该分离株与其他隐孢子虫虫种之间的亲缘关系。结果通过18S rRNA、HSP70基因分析该分离株与Cryptosporidium parvum(C.parvum)鼠基因型同源性最高,分别为99.9%和99.2%,在种系发育树上,PRHN均与C.parvum鼠基因型亲缘关系最近;对Chaperponin 60(Cpn60)和Alternative oxidase(AOX)进行序列分析时,该分离株与本实验室分离到的猪隐孢子虫(C.suis)亲缘关系最近。结论该分离株为C.parvum鼠基因型。     

基于凝集素基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定

目的 为了解隐孢子虫凝集素基因在不同分离株的序列差异及其遗传进化关系,以SSU rRNA基因作参照,评价Lectin基因位点作为隐孢子虫基因分型和进化关系分析的可行性。方法 采用巢式PCR,分别在Lectin和SSU rRNA位点处对本实验室分离保存的多个隐孢子虫分离株进行PCR的扩增。用Clustalx对扩增序列与参考序列进行比对,用MEGA5中的邻近法(Neighbor joining method NJ),进行进化树的构建。结果 基于Lectin基因位点,在C. parvum、C. hominis、C. cuniculus及其在SSU rRNA 处与人源C. hominis极为相近的horse genotype、驴源C. hominis均成功扩增出了大小在450 bp左右的目的 条带,并进行了进化树的分析,不同种类和同种不同动物来源的隐孢子虫分布在不同的分支上。结论 Lectin基因位点可很好的区分SSU rRNA序列极为相似的几种隐孢子虫,有望为人兽共患隐孢子虫分类和遗传研究提供新的基因靶标。     

哈尔滨一牛源赖氏隐孢子虫分离株的分子鉴定

目的对来源于哈尔滨某奶牛场一头3月龄奶牛的一个隐孢子虫分离株进行了分子鉴定。选择隐孢子虫基因分型常用的18SrRNA和actin基因位点,设计引物,用巢氏PCR方法分别扩增出约840bp和1066bp目的片段。PCR产物经双向测序后用ClustlX、DNAstar和PHLIP软件进行序列分析。结果表明在18SrRNA基因位点上,此分离株与报道的牛源C.ryanae分离株(DQ871345、AY587166、EU410344)同源性最高,达到100%。在actin位点,此分离株和美国牛源C.ryanae分离株(EU410345)和隐孢子虫鹿样基因型(AY741309)同源性也为100%。种系发育分析显示所获得的分离株在两个基因位点上均和C.ryanae处于同一进化分支。这些分析表明此次分离获得的隐孢子虫分离株为C.ryanae。鉴定结果为研究我国牛源隐孢子虫种类分布以及评价其公共卫生意义提供了重要参考。     

天津地区奶牛感染隐孢子虫情况的调查

目的调查天津市周边区县奶牛隐孢子虫感染情况。方法对5处奶牛粪样进行检查，采用改良抗酸染色法初筛，对检出的可疑阳性样本采用金胺-酚染色、金胺酚-改良抗酸染色、蔗糖不连续梯度离心法及饱和硫酸锌漂浮等方法进一步观察确定。结果个体养殖户奶牛粪检隐孢子虫阳性率西青区为8.33%（3/36），东丽区为70.00%（7/10），津南区为6.67%（1/15）。中型奶牛场奶牛粪样75份，其中武清县35份，蓟县40份，均为阴性。检出的隐孢子虫经初步鉴定分别为鼠隐孢子虫与微小隐孢子虫。结论天津地区奶牛有一定程度的隐孢子虫感染，需进一步加强小型养牛户的卫生防疫。     

微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫Rhomboid基因部分序列的克隆和分析

目的获得我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因（CPRho和CARho）部分序列并确定与国外分离株相应序列的同源性。方法应用RT-PCR技术扩增微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因片段,然后将其克隆到pMD18-T载体中,测得序列应用DNAMAN软件进行序列分析。结果经RT-PCR扩增出微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,大小均为723bp。经DNAMAN软件分析,表明我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid核苷酸序列同源性为99．6％,氨基酸同源性为99．2％。二者与GenBank公布的相应序列核苷酸同源性分别为99．9％和99．7％,而氨基酸同源性均为99．6％。结论获得了微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,为继续研究该基因的侵入功能等奠定了基础。     

上海养殖场奶牛感染隐孢子虫的调查

目的 对上海地区养殖场奶牛的隐孢子虫感染状况进行调查分析. 方法 采集上海市奉贤区、金山区和青浦区5个养殖场的奶牛粪便,过滤沉淀,应用商品化试剂盒提取DNA,基于隐孢子虫18S rRNA基因进行巢式PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定,对阳性PCR产物进行测序,鉴定虫种,并统计相应的感染率和构成比. 结果 共采集奶牛粪便样本204份,其中奉贤123份,金山43份和青浦38份,共发现36个隐孢子虫阳性样本,阳性率为17.65％ （36/204）;经测序鉴定,奶牛感染的主要虫种为安氏隐孢子虫（Cryptosporidium andersoni）,占94.44％ （34/36）,少量为牛隐孢子虫（Cryptosporidium bovis）,占5.56％ （2/36）. 结论 安氏隐孢子虫是该地区奶牛感染的主要隐孢子虫虫种,存在潜在的公共卫生危害.     

隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR-RFLP分析

目的　建立用巢式聚合酶链反应 (NestedPCR) 限制片段长度多态性 (Restrictionfragmentlength polymor phism ,RFLP)检测、鉴别微小隐孢子虫 (Cryptospordium parvum)和安氏隐孢子虫 (C .andersoni)的方法。　 方法　用巢式PCR技术扩增长春市人和牛粪便中C .parvum与C .andersoni的Small SubunitrRNA (SSUrRNA)部分基因 ,并克隆和测序。扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切 ,进行RFLP分析 ,并与GenBank上的 17株隐孢子虫相应序列进行对比分析和系统发育分析。　结果　C .parvumHCC1、C .parvumBOCC1和C .andersoniBOCC1扩增产物片段大小分别为 83 0bp、83 0bp和 82 8bp ,经SspⅠ和VspⅠ分别单酶切后形成 2种不同的RFLP图谱 ,根据RFLP图谱可鉴别C .parvum与C .andersoni。序列分析结果显示 ,C .parvumHCC1与国外牛源C .parvumBOH 6、C .parvumGCH1、鹿源C .parvumDR1相应序列同源性均为 99.3 % ;C .parvumBOCC1与国外牛源C .parvumBOH6、C .parvumGCH1、鹿源C .parvumDR1相应序列同源性均为 99.5 % ;C .andersoniBOCC1与国外C .andersoni相应序列同源性为 99.9%。系统发育分析结果显示 ,隐孢子虫虫种形成了 2个群 ,1个群包括C .parvum、C .baileyi、C .meleagridis、C .felis和C .wrairi,另 1个群包括C .a     

哈尔滨市污水处理厂原水中安氏隐孢子虫的分子鉴定

目的对哈尔滨市污水处理厂原水中隐孢子虫进行分子鉴定。方法提取污水处理厂原水中的隐孢子虫基因组DNA,对其18S rRNA基因进行巢式PCR扩增,通过序列分析确定隐孢子虫虫种,并与GenBank的参考序列进行同源性分析。结果从哈尔滨市污水处理厂原水中分离鉴定出安氏隐孢子虫,该虫株18S rRNA基因序列与文献报道的安氏隐孢子虫序列(EU926592)同源性为100%。结论哈尔滨市污水处理厂原水中存在安氏隐孢子虫,对当地畜牧业的发展构成严重威胁,但对当地人群危害较小。     

隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR-RFLP分析

目的建立用巢式聚合酶链反应(Nested PCR)-限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)检测、鉴别微小隐孢子虫(Cryptospordium parvum)和安氏隐孢子虫(C．andersoni)的方法。方法 用巢式PCR技术扩增长春市人和牛粪便中C．parvum与C．andersoni的Small—Subunit rRNA(SSU rRNA)部分基因，并克隆和测序。扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切，进行RFLP分析，并与GenBank上的17株隐孢子虫相应序列进行对比分析和系统发育分析。结果C．parvum HCCl、C．parvum BOCCl和c．andersoni BOCCl扩增产物片段大小分别为830bp、830bp和828bp，经SspI和Vspl分别单酶切后形成2种不同的RFLP图谱，根据RFLP图谱可鉴别Cparvum与C．andersoni。序列分析结果显示，C．parvum HCCl与国外牛源C．parvum BOH6、C．parvum GCHl、鹿源C．parvum DRl相应序列同源性均为99．3％；C．parvum BOCCI与国外牛源C．parvum BOH6、C．parvum GCHl、鹿源C．parvum DRl相应序列同源性均为99．5％；C．andersoni BOCCl与国外Candersoni相应序列同源性为99．9％。系统发育分析结果显示，隐孢子虫虫种形成了2个群，1个群包括C．parvum、C．baileyi、C．meleagridis、C．felis和C．wrairi，另1个群包括C．andersoni、C．muris和C．serpentis。结论用巢式PCR技术可扩增隐孢子虫基因组DNA中特异片段，根据RFLP图谱可鉴别C．parvum和C．andersoni，表明本实验建立的检测、鉴别C．parvum和C．andersoni的巢式PCR—RFLP方法有效，为我国隐孢子虫分类、隐孢子虫病的分子流行病学研究和诊断打下了良好基础。     

隐孢子虫基因分型技术的研究进展

隐孢子虫是一种属于顶复门的寄生性肠道原虫,主要寄生于人或动物的消化道上皮并引起腹泻,对公共卫生造成很大威胁.随着近年来分子生物学的迅猛发展,越来越多的基因分型技术因其分辨率、敏感性及特异性较高而被广泛应用于隐孢子虫研究中,进而为追溯传染源、调查传播途径及制定有效干预举措提供重要理论依据.该文就几种主要基于PeR的隐孢子虫基因分型技术的研究进展作一简要综述.     

感染隐孢子虫奶牛血液免疫和抗氧化指标的变化

目的检测感染隐孢子虫奶牛血液免疫和抗氧化体系指标。方法对安徽省某奶牛场325头奶牛粪样采用饱和蔗糖溶液漂浮法检测隐孢子虫感染情况。选择隐孢子虫感染强阳性的7头奶牛作为感染组,同时取7头隐孢子虫粪检阴性奶牛作为对照组,早晨饲喂前从奶牛颈静脉采血,分别测定总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、免疫球蛋白(IgG、IgM和IgA)、中性粒细胞吞噬率、T淋巴细胞转化率、白细胞介素-2(IL-2)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、甘油三脂(TG)、Cl-和Ca2+等19项指标。结果 325头奶牛隐孢子虫感染率为31.7%(103/325),根据卵囊的形态和大小,初步鉴定为安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)。与对照组相比,感染组奶牛血清中TP、ALB、IgM、IgA、GSH-Px、ALT、AST、ALP和Cl-含量无显著变化(P>0.05);血清中MDA和NO含量分别升高59.9%和28.1%(P<0.05或0.01);而血清中IgG、SOD、GLU、TG、Ca2+和IL-2含量,以及T淋巴细胞转化率和中性粒细胞吞噬率分别降低了32.9%、11.1%、18.6%、78.9%、14.5%、7.0%、22.0%和20.2%(均P<0.05)。结论感染隐孢子虫奶牛部分免疫指标下降,抗氧化酶活性降低,清除体内自由基的能力减弱。     

微小隐孢子虫重组BCG-Cp23疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定微小隐孢子虫Cp23基因卡介苗重组疫苗。方法用微小隐孢子虫感染免疫抑制BALB/c小鼠,用蔗糖密度梯度离心法纯化其粪便中的卵囊,酚-氯仿法提取微小隐孢子虫的基因组DNA,PCR扩增Cp23基因片段,然后将其克隆TA载体;通过酶切、测序鉴定后,将Cp23基因片段用限制性内切酶切下克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV262结核杆菌热休克蛋白(HSP)启动子下游,构建重组质粒pMV262-Cp-23,用电穿孔将该质粒导入野生卡介苗(BCG-WT)构建微小隐孢子虫Cp23基因卡介苗重组疫苗。结果扩增出约360bp的微小隐孢子虫Cp23基因片段并成功构建pMV262-Cp23质粒,通过PCR扩增和提取质粒、酶切表明质粒正确导入BCG-WT中。结论成功构建微小隐孢子虫Cp23基因卡介苗重组疫苗。     

微小隐孢子虫的基因检测实验研究

目的　探讨聚合酶链反应 (PCR)检测微小隐孢子虫 (Cryptosporidium parvum)感染的特异性和敏感性。　方法用 Sheather's蔗糖梯度离心法从微小隐孢子虫感染者粪便标本中分离纯化卵囊。用酚 -氯仿法抽提卵囊总 DNA。针对本虫 18S r RNA基因片段设计 1对引物 ,对模板 DNA进行 PCR扩增 ,同时以蓝氏贾第鞭毛虫 (Giardia lamblia)、溶组织内阿米巴 (Entamoeba histolytica)、阴道毛滴虫 (Trichomonas vaginalis)、刚地弓形虫 (Toxoplasma gondii)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)和旋毛虫 (Trichinella spiralis) ,以及人体血细胞等 DNA样本为对照。用琼脂糖电泳和溴乙腚染色对 PCR产物进行检测。　结果　仅微小隐孢子虫 DNA被扩增出一 5 0 0 bp的 DNA片段。其它对照 DNA样本均未出现扩增反应。　结论　PCR对隐孢子虫检测的特异性可高达 10 0 % ,敏感性也很强 ,可检测到 2 0 pg微小隐孢子虫卵囊的DNA。表明本实验建立的检测微小隐孢子虫的 PCR方法有效     

抗猪隐孢子虫单克隆抗体的制备及鉴定

目的筛选特异性强、亲和力高的抗猪隐孢子虫(Cryptosporidiumsuis)单克隆抗体(McAb),并探讨其生物学活性。方法将纯化的猪隐孢子虫卵囊冻融和超声波处理后免疫BALB/c小鼠,取阳性免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合;经间接ELISA法筛选,有限稀释法进行克隆;用间接ELISA叠加试验、间接免疫荧光试验鉴定McAbs的免疫反应活性。结果获得3株能稳定分泌抗猪隐孢子虫McAbs的杂交瘤细胞株,命名为1E1C5、1E11A5、2B7A1,分别属于Ig M、IgG3和IgG2a类;其细胞培养上清效价分别为1∶3200、1∶1600和1∶3200,小鼠腹水效价分别为1∶1.6×105、1∶1.6×105和1∶0.8×105;ELISA叠加试验表明3株单抗可识别两个不同抗原位点,1E1C5有较高的亲和力;免疫荧光试验结果显示3株单抗均能与猪隐孢子虫卵囊壁反应,但与艾美耳球虫、人隐孢子虫(C.hominis)有微弱的交叉反应。结论获得了3株可识别猪隐孢子虫卵囊壁的McAbs,为进一步开展猪隐孢子虫快速诊断研究奠定了基础。     

内蒙古东部部分奶牛场奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定及毒力基因检测北大核心CSCD

目的检测内蒙古东部奶牛场奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌感染情况,并鉴定其毒力基因携带情况。方法采集61份临床型乳房炎奶牛的牛奶样品进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定。利用PCR方法检测分离株金黄色葡萄球菌的nuc、clfA、fnbA、fnbB、tsst-1、sea、seb、sec、sed、seg、see、seh、sei、和sej 14种毒力基因,并对其中1株进行16S rRNA基因序列分析、生化检测、药敏试验以及动物致病性试验。结果成功分离到20株金黄色葡萄球菌。从分离菌中共检测到11种毒力基因,其中nuc、clfA、fnbB、sea、sed、sei 6种毒力基因检出率均超过50%。随机挑选1株分离菌,将其命名为TLXG01。16S rRNA基因序列分析显示,分离菌与已报道的MF511713.1 H2处于同一分支且相似度均高于99%。药敏敏验显示,该分离菌对14种常用抗生素敏感,对多粘菌素和链霉素耐药。动物致病性试验显示,该分离株对小鼠具有较强的致病性。结论内蒙古东部5个奶牛场乳房炎奶牛均有金黄色葡萄球菌感染,该病原菌携带毒力基因的数量和种类不同,且存在多种毒力基因组合,可为当地奶牛场奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎的防治提供参考。