应用Dil标记的氧化高密度脂蛋白观察人单核细胞源性的树突状细胞成熟的研究

目的探讨氧化修饰高密度脂蛋白(OxHDL)和高密度脂蛋白(HDL)对人单核细胞源的树突状细胞(DCs)免疫功能的影响。方法从人外周血清中离心提取高密度脂蛋白,经氧化后,分别用Dil荧光标记。将人外周血分离的单核细胞加入包含rhGM-CSF(20ng/mL)和rhIL-4(20ng/mL)的培养基中培养,使其分化为DCs。以PBS作阴性对照,分别与50μg/mL的标记好的OxHDL和HDL混合培养48h后,动态观察DCs成熟过程中的形态学变化,流式细胞术检测DCs成熟表型(CD1#、CD80、CD86、HLA-DR)。结果使用Dil标记的方法良好地显示了DCs摄取OxHDL的形态学变化,OxHDL可促进DCs成熟表型HLA-DR、CD1$的表达(P<0.05),而HDL无此作用。结论Dil是适合DCs形态学研究的良好的荧光标记物,OxHDL可促进DCs成熟。     

氧化修饰低密度脂蛋白促进人单核细胞源树突状细胞的成熟及活化

目的　探讨氧化修饰低密度脂蛋白 (oxidized lowdensitylipoprotein ,oxLDL)和低密度脂蛋白 (lowdensi tylipoprotein ,LDL)对人单核细胞源的树突状细胞 (monocytederiveddendriticcells,MDCs)免疫功能的影响。 方法　采用免疫磁珠法分离人外周血CD14 单核细胞 ,经含rhGM CSF(10 0ng/mL)和rhIL - 4 (2 0ng/mL)的Cell gro培养 ,使其分化为MDCs。分别以PBS和LPS(5 0 0 μg/mL)作阴性和阳性 (成熟 )对照 ,观察经5 0 μg/mL的oxLDL和LDL干预 4 8h后 ,流式细胞术检测MDCs表型 (CD1a、CD4 0、CD86、HLA DR) ,混合T淋巴细胞反应检测MDCs对淋巴细胞增殖的影响 ,FITC Dextran检测MDCs吞噬功能 ,ELISA检测细胞培养上清细胞因子 (IL -12、IL - 10和TNF α)浓度。结果　与PBS相比 ,5 0 μg/mLoxLDL干预的MDCs,不但可明显上调共刺激分子CD86的高表达 ,而且反映MDCs成熟程度的CD1a也表达增强 ,与此同时经oxLDL处理的MDCs吞噬作用却明显减弱 ,进一步的混合T淋巴细胞反应显示经过oxLDL刺激的MDCs促T细胞增殖作用明显增强 (P <0 .0 5 ) ;此外 ,oxLDL可明显促进MDC分泌细胞因子TNF α、IL - 10和IL - 12 (P <0 .0 5 ) ,但明显弱于LPS组 ,而LDL无此作用。结论　oxLDL在促进DCs成熟的同时 ,DCs激活T淋巴细胞的能力也明显增     

应用DiI标记的氧化低密度脂蛋白观察人单核细胞源性的树突状细胞成熟的研究

目的 探讨氧化修饰低密度脂蛋白(oxLDL)和低密度脂蛋白(LDL)对人单核细胞源的树突状细胞(DCs)免疫功能的影响.方法 从人外周血清中离心提取低密度脂蛋白,经氧化后,分别用DiI荧光标记.将人外周血分离的单核细胞加入包含rhGM-CSF(20 ng/ml)和rhIL-4(20 ng/ml)的培养基中培养,使其分化为DCs.以PBS作阴性对照,分别与50 μg/ml的标记好的oxLDL和LDL混合培养48 h后,动态观察DCs成熟过程中的形态学变化,流式细胞术检测DCs成熟表型(CDla,CD80,CD86,HLA-DR),混合T淋巴细胞反应检测DCs对淋巴细胞增殖的影响.结果 使用DiI标记的方法良好地显示了DCs摄取OxLDL的形态学变化.OxLDL可促进DCs成熟表型CD86,CDla的表达,T细胞增殖作用明显增强(P＜0.05).结论 DiI是适合DCs形态学研究的良好的荧光标记物.OxLDL可促进DCs成熟,并增加DCs的免疫活性.     

青藤碱对小鼠骨髓树突状细胞免疫功能的影响

目的研究青藤碱对小鼠骨髓树突状细胞(dendritic cell DC)免疫功能的影响.方法小鼠骨髓细胞用GM-CSF培养7 d,再加入不同浓度青藤碱培养12 h.流式细胞仪检测细胞表达HLA-DR的能力,ELISA检测细胞产生的细胞因子,混合淋巴细胞培养检测细胞提呈抗原的能力.结果青藤碱刺激后的DC细胞表达HLA-DR、产生细胞因子和刺激同种同基因T细胞增殖的能力显著低于正常DC细胞.结论青藤碱可抑制DC的发育成熟和免疫应答功能.     

天然和氧化修饰型脂蛋白对培养人动脉平滑肌细胞形态的影响

在建立人主动脉平滑肌细胞（ＳＭＣ）体外培养方法的基础上，观察了各种天然和氧化修饰型脂蛋白对培养人ＳＭＣ形态以及表型的影响。在氧化修饰低密度脂蛋白（ＯＸ－ＬＤＬ），氧化修饰高密度脂蛋白（Ｏｘ－ＨＤＬ）和氧化修饰极低密度脂蛋白（ＯＸ－ＶＬＤＬ）的作用下，ＳＭＣ形态发生以下变化：胞体变大，由梭形变为不规则多边形，突起细而长，而且“谷”、“峰”样生长方式也发生改变；ＬＤＬ和ｖＬＤＬ对ＳＭＣ的形态亦有影响，但不如氧化修饰脂蛋白明显；ＨＤＬ则无影响。电镜下观察，在ＯＸ－ＬＤＬ的诱导下，ＳＭＣ胞浆中的肌丝较对照组明显减少，而高氏器，内质网和线粒体则明显增多。上述结果说明，ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＯＸ－ＬＤＬ、ＯＸ－ＶＬＤＬ和ＯＸ－ＨＤＬ的致动脉粥样硬化作用可能与刺激ＳＭＣ表型由“收缩”型向“合成”型转化有关。     

C反应蛋白与酶修饰低密度脂蛋白对树突状细胞成熟的影响

目的 探讨在动脉粥样斑块硬化进程中C反应蛋白(CRP)和酶修饰低密度脂蛋白(E-LDL)对外周血中树突状细胞(DC)分化成熟的影响.方法 梯度离心法分离人外周血单核细胞,用含rhGM-CSF和rhIL-4的Cellgro培养液培养5 d,使其分化为DC.分别用CRP、E-LDL及CRP加E-LDL刺激DC 48 h后,采用流式细胞术检测DC表型(CD1a、CD80、CD86、HLA-DR)的表达,ELISA法检测DC上清液中IL-12、TNFα、IL-2和IL-10的含量,并进行比较.结果 CRP抑制DC的CD1a、CD80表达及IL-12、TNFα分泌,E-LDL促进DC的CD1a、CD80、CD86和HLA-DR表达及IL-12、TNFα分泌,CPR加E-LDL结果与E-LDL类似.结论 CRP抑制DC的活化,E-LDL可促进DC的分化成熟,E-LDL激活DC的作用强于CRP的抑制作用.     

C57 BL/6 J小鼠黑质小胶质细胞的增龄性变化

目的 观察C57BL/6J小鼠相关代谢指标和黑质小胶质细胞增龄性变化规律,探讨帕金森病临床前期老化和炎症的相互关系.方法 40只健康雄性C57/6J小鼠,分为青年组(3个月)、中年组(9个月)、老年组(16个月)和造模组(16个月),每组10只.造模组采用慢性给药(MPTP)5周.测量小鼠体质量、饮食、饮水等代谢指标.通过免疫组织化学方法检测黑质区酪氨酸羟化酶(TH)和小胶质细胞的表达,光镜下分析比较4组小鼠黑质区激活型小胶质细胞数量及其占小胶质细胞总量的比例.结果 造模组的饮食、饮水量和体质量相比于其他组明显降低(P<0.05).小鼠黑质激活型小胶质细胞计数和所占小胶质细胞总量的百分比分别为8.12±3.54和(9.3±1.21)%(青年组);13.19±3.86和(15.5±1.47)%(中年组);19.32±3.07和(20.3±1.53)%(老年组);28.16±3.33和(29.5±1.29)%(造模组),差异有统计学意义(P<0.05).结论 小鼠的代谢指标增龄性衰退,黑质区激活型小胶质细胞数增龄性增多,造模组激活型小胶质细胞数占小胶质细胞总量比例最高.     

小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养体系的构建

建立一种体外诱导培养小鼠骨髓源性的树突状细胞(DCs)方法,在镜下可观察到培养出的未成熟树突状细胞(imDCs)比成熟树突状细胞(mDCs)细胞突起少。流式细胞术检测 CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子在 imDCs 的表达显著低于在 mDCs 上的表达。同种异基因混合淋巴细胞反应显示DCs 刺激 T 细胞增殖的能力随着 DCs 所占比例的增大而增强,在相同比例条件下对刺激 T 细胞增殖的能力,imDCs 显著低于成熟 mDCs。该诱导方法可获得大量符合科研要求的小鼠骨髓源性 DCs。     

OXIDIZED HIGH-DENSITY LIPOPROTEIN PROMOTES MATURATION AND MIGRATION OF BONE MARROW DERIVED DENDRITIC CELLS FROM C57BL/6J MICE

Objective To explore the influence of oxidized high-density lipoprotein （oxHDL） on the maturation and migration of bone marrow-derived dendritic cells （BMDCs） from C57BL/6J mice.
Methods The C57BL/6J mice bone marrow cell suspension was prepared and purified. Recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor （rmGM-CSF） and recombinant interleukin-4 （rmlL-4） were used to promote monocytes to differentiate and suppress lymphocytes. Then 50μg/mL oxHDL was added to stimulate BMDCs, using 50μg/mL high-density lipoprotein （HDL） as homologous protein control, PBS as negative control, and 1 μg/mL lipopolysaccharide （LPS） as positive control. The CD86 and MHCII expression rates were detected with fluorescence-activated cell sorting （FACS）. Liquid scintillation counting （LSC） was used in mixed lymphocyte reactions （MLRs） to reflect the ability of BMDCs in stimulating the proliferation of homologous T cells, Levels of cytokines IL-12 and IL-10 were detected by ELISA. The cell migration was evaluated with the transwell system.
Results Compared with PBS group, the expressions of CD86 and MHCII, counts per minute of MLRs, secretion of IL-12 and IL-10, and number of migrated cells in oxHDL group and LPS group significantly increased （all P 〈 0.05）, while the increment was less in oxHDL group than LPS group. The number of migrated cells in oxHDL group was about twice of that in HDL group.
Conclusion OxHDL may promote the maturation and migration of BMDCs in vitro.     

C57BL／6小鼠树突状细胞的培养及其诱导细胞毒性T淋巴细胞对FBL-3细胞杀伤效应的研究

目的探讨C57BL／6小鼠树突状细胞（DC）的培养及其诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对FBL-3细胞的杀伤效应。方法应用GM—CSF和114培养C57BL／6小鼠骨髓DC,用冻融法制备FBL-3细胞抗原致敏DC,用3H—TdR法检测T细胞增殖反应的能力,标准的4h51cr释放测定法检测CTL杀伤活性。结果用IL4和GM—CSF联合培养小鼠骨髓细胞3天后,可见细胞形态发生改变,细胞形态不规则。培养第6～8天,细胞表面出现较多毛刺样突起,拉长,为典型的DC特征。流式细胞仪检测DC表面分子有CD80、CD86、H-2Kd及I-Ad表达。FBL-3细胞冻融组和PBS组的DC在体外均可以诱导T细胞增殖,冻融组的DC体外诱导T细胞增殖能力明显高于PBS组。冻融组DC体外诱导的CTL对FBL-3细胞有明显的细胞毒作用。结论应用IL-4联合GM—CSF培养C57BL／6小鼠骨髓细胞,可大量扩增成熟DC,培养的DC符合其自身的特性;用冻融法制备FBL-3细胞抗原致敏DC,可以诱导T细胞细胞大量增殖,并能诱导出杀伤效应较强的CTL。     

小鼠骨髓干细胞体外诱导成熟的树突状细胞对T细胞增殖的影响

目的：研究小鼠骨髓干细胞体外诱导分化的树突状细胞对T细胞增殖的影响,为进一步研究树突状细胞的功能及临床肿瘤的治疗提供有效的实验方法。 方法：应用IL-4和GM-CSF培养小鼠骨髓细胞5~7 d,光镜下观察细胞形态学变化;培养至第5~6天,加入黑色素瘤（B16）冻融抗原继续培养1~2 d,流式细胞仪检测细胞表面分子CD83、CD86,并与同种异体T细胞混合培养72 h,终止培养前16 h加入³H-TdR（18.5 kBq/孔）,γ-液体闪烁仪测定cpm值。 结果：用IL-4和GM-CSF培养3 d可见细胞形态发生改变,细胞形状不规则,培养5~6 d时,有刺状突起、拉长,为典型树突状细胞形态学特征;抗原装载后流式细胞仪检测CD83、CD86表达,IL-4+GM-CSF+TNF-α组（61.68%、71.25%）及IL-4+GM-CSF+冻融抗原组（63.11%、76.88%）明显高于对照组（2.41%、3.88%）及单纯IL-4+GM-CSF培养组（21.86%、28.69%）（P<0.001）,IL-4+GM-CSF+TNF-α组与IL-4+GM-CSF+冻融抗原组比较,CD83和CD86表达差异无显著性;液闪仪检测结果显示,IL-4+GM-CSF+冻融抗原组刺激T细胞增殖的能力明显强于其他组,且差异具有显著性（P<0.001, P<0.05）。 结论：小鼠骨髓细胞体外培养成功地诱导扩增出足量树突状细胞,经肿瘤抗原刺激后绝大部分成熟,并能够刺激同种异体T细胞大量增殖,参与免疫应答。     

大鼠骨髓来源树突状细胞的分离与免疫学特征

目的：探讨大鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的体外分离培养方法，为DC的免疫学研究及临床应用提供技术参考。方法：取大鼠四肢骨髓细胞悬液，经密度梯度离心得到大鼠骨髓单个核细胞（BMMNC）；应用 大鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF)、大鼠重组白细胞介素-4（rrIL-4）及大鼠重组肿瘤坏死因子-α(rrTNF-α)进行体外培养；肿瘤抗原（TAA）/DC组于诱导分化的第3天加入大鼠卵巢癌细胞株NuTu-19的冻融抗原，获得负载TAA的成熟DC；DC组为对照组，未加入NuTu-19。对两组进行形态学观察、流式细胞学表型鉴定及体外淋巴细胞增殖反应测定。结果：大鼠骨髓来源的BMMNC在相关细胞因子的作用下可以培养出成熟的DC，ＴＡＡ／ＤＣ组高表达表面抗原，其OX62、CD86和MHC-Ⅱ表达高于对照组（P<0.01）；在效靶比（SC∶RC）为1∶3、1∶10、1∶30和1∶100时,淋巴细胞刺激指数(SI)ＴＡＡ／ＤＣ组均高于对照组（P<0.01）。结论：成功地建立了大鼠骨髓DC的培养方法，大鼠骨髓来源的BMMNC可以培养出成熟的DC。     

脱氧胆酸对C57BL/6小鼠回肠类器官生长的影响

目的：建立小鼠小肠类器官培养系统,探讨脱氧胆酸（DCA）对小肠类器官生长的影响。方法取8周龄C57BL/6小鼠末段回肠,EDTA法分离,收集隐窝后Matrigel基质胶包埋,于完整培养基中培养。以无水酒精和正常小肠类器官为对照,予100μmol/L高浓度DCA短期干预2 d,10μmol/L DCA长期干预10 d,并去除DCA后再长期培养10 d,观察类器官的生长和出芽情况。结果高浓度DCA短期干预类器官,肠道类器官球形结构形成率、肠道类器官结构[形成率、类器官演化率和出芽数量均明显减少（P<0.05）,短期去除DCA四项指标仍减少（P<0.05）,长期去除DCA后仅肠道类器官结构形成率和出芽数量减少（P<0.05）。低浓度DCA短期干预肠道类器官结构形成率和出芽数量减小（P<0.05）,长期干预肠道类器官球形结构形成率、肠道类器官结构形成率和出芽数量明显减少（P<0.05）,去除DCA后仅肠道类器官结构形成率和出芽数量低于正常（P<0.05）。结论本研究成功建立小鼠小肠类器官培养技术,DCA损伤小肠类器官并影响其生长,长期去除DCA后可部分恢复其功能。     

HBV转基因小鼠与C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞分离培养的比较研究

目的 比较研究乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠和C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的分离培养体系.方法 采用贴壁培养法建立HBV转基因小鼠和C57BL/6小鼠BMSCs分离培养体系,通过在培养液中添加不同浓度的血清进行培养,分析HBV转基因小鼠和C57BL/6小鼠BMSCs细胞形态和数量的差异.结果 C57BL/6小鼠原代BMSCs生长迅速,按1∶3传代后呈漩涡状生长,形态类似成纤维细胞.HBV转基因小鼠原代BMSCs生长缓慢;以1∶2传代后生长缓慢,有明显的血清依赖性及密度依赖性.结论 在相同的生长环境下,不同血清浓度的培养液中,HBV转基因小鼠BMSCs生长较正常C57BL/6小鼠的BMSCs生长明显缓慢.     

IL-6抑制LPS诱导的小鼠髓源性DCs成熟的实验研究

目的观察白细胞介素-6(IL-6)对于内毒素(LPS)诱导的小鼠髓源性树突状细胞(DC)成熟效应的抑制作用。方法分离小鼠骨髓细胞,采用黏附法结合GM-CSF和IL-4刺激法在体外培养髓源性DCs(BMDCs)。用相差倒置显微镜观察BM-DCs的形态特点。用LPS诱导DC成熟。采用FACS结合混合淋巴细胞反应,观察IL-6处理与否,LPS诱导的BMDCs在表型和刺激同种淋巴细胞增殖功能上的变化。结果形态观察和FACS分析的结果表明:体外成功培养了纯度较高的高表达CD11c的BMDCs,LPS能明显诱导BMDCs表面MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40的表达上调;而经过IL-6处理后,LPS诱导BMDCs表面CD80、CD86、CD40表达上调的能力被显著削弱(P0.05)。混合淋巴细胞反应显示,与单独用LPS处理的BMDCs相比,经IL-6处理后的BMDCs刺激同种淋巴细胞增殖的能力明显减弱,并呈剂量依赖关系(P0.05)。结论IL-6能明显抑制LPS诱导的BMDCs成熟,可能是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一。     

体外诱导C57BL/6小鼠CIK细胞研究

目的:诱导培养C57BL/6小鼠CIK细胞,并检测其对肿瘤细胞杀伤作用。方法:使用三种细胞因子及抗CD3单抗体外诱导C57BL/6小鼠脾细胞,用CCK-8试剂检测对肿瘤细胞杀伤作用。结果:培养出的CIK细胞主要为CD8+NK1.1+细胞,对肿瘤细胞有较强杀伤作用。结论:成功诱导出C57BL/6小鼠CIK细胞。     

C57BL/6J小鼠EAE模型的建立及巨噬细胞移动抑制因子的表达

目的:通过观察巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)在慢性实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠脑和脊髓中的动态表达变化,探讨MIF与EAE发病的关系.方法:72只无特定病原体的6～8周健康雌性C57BL/6J小鼠随机分为EAE组、空白组和佐剂组.用mMOG35-55和完全弗氏佐荆(complete Freund's adjuvant,CFA)免疫小鼠制成慢性EAE动物模型,免疫组织化学技术检测不同组别小鼠脑和脊髓中MIF的表达变化.结果:EAE组小鼠在疾病各个时期,中枢神经系统(CNS)中均可见MIF表达升高,各个时期MIF表达与空白组和佐荆组相比均有统计学意义(P<0.05);在EAE组,MIF在疾病发病高峰期表达最高,与其他时间点相比差异有统计学意义(P<0.05).结论:MIF在EAE小鼠发病过程中有明显表达,可能与EAE的发病和恶化相关.