miR-572对胃癌细胞增殖和凋亡影响及其作用机制研究

目的研究miR-572对胃癌细胞增殖、凋亡的影响和机制。方法 Real-time PCR方法测定miR-572在胃癌细胞和正常胃黏膜细胞中的表达差异。胃癌细胞NCI-N87中转染miR-572 inhibitor,MTT测定细胞增殖,PI单染法测定细胞周期分布,Annexin V-FITC/PI法测定细胞凋亡变化,Western blot检测细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。在线靶基因预测软件发现含WW域的氧化还原酶(WWOX)可能为miR-572的靶基因,荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。将WWOX si RNA和miR-572 inhibitor共转染到胃癌细胞中,利用上述方法测定细胞增殖、周期和凋亡变化。结果 miR-572在胃癌细胞中的表达水平明显高于正常胃黏膜细胞。miR-572 inhibitor转染后的胃癌细胞增殖能力下降,细胞G1期比例升高,细胞凋亡率升高,细胞中CDK4、Bcl-2蛋白表达减少,p21、Bax蛋白表达增多。miR-572靶向负调控WWOX蛋白表达。WWOX si RNA可以逆转miR-572 inhibitor对胃癌细胞增殖抑制、周期阻滞和凋亡促进作用。结论下调miR-572靶向负调控WWOX抑制胃癌细胞增殖,阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。     

Skp2基因沉默对 SPC-A-1肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨 S 期激酶相关蛋白2（Skp2）基因沉默对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法将 Skp2 RNA 干扰表达载体转染至 SPC-A-1肺癌细胞中,G418筛选获得阳性克隆细胞。通过实时荧光定量（RT-PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺癌细胞中 Skp2的表达。采用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐（M TT ）法检测各组肺癌细胞生长、凋亡情况。结果转染 Skp2 shRNA 表达载体的肺癌细胞中 Skp2蛋白表达量明显减少,抑制效率分别可达75．3±5．1,70．4±3．2;转染 Skp2 shRNA 表达载体的肺癌细胞生长减慢,阻滞于 G1期的增多,S 期细胞减少。 Skp2 shRNA 转染质粒组凋亡率较阴性对照组明显增加,细胞凋亡率分别为（17．5±2．8）％、（15．6±3．1）％。结论通过特异性沉默 Skp2基因的表达,可有效降低肺癌细胞中 Skp2蛋白表达水平,抑制肺癌细胞生长及增加细胞凋亡。     

靶向EGFR基因RNA干扰对胃癌细胞BGC823细胞增殖和凋亡的影响

目的利用R NA干扰技术下调表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,观察其对胃癌BGC823细胞增殖和凋亡的影响。方法将细胞分为3组,空白对照组、空载体组和实验组(转染EGFRshRNA组)。构建针对EGFR基因的s和R NA真核表达载体,转染入胃癌BGC823细胞中,运用R T-PCR和Western blot检测EGFR在mRNA和蛋白水平的变化;WST-1法检测细胞增殖的影响:Hoechst33258染色观察细胞核形态学变化。实验重复3次。结果成功构建表达质粒pGenSil-EGFR并转染BGC823细胞,shRNA下调EGFR的表达后,与空白对照组相比EGFR在mR NA和蛋白水平的表达均下降,抑制率分别为58.6%和75.2%。shR NA转染24、48、72 h,WST-1法检测胃癌细胞BGC823的增殖情况,与空白对照组相比,24 h后三组差异不明显(F=0.326,P>0.05),48 h及72 h后,细胞增殖明显下降(F=68.25及274.45,P<0.001),有统计学意义。EGFR shR NA作用BGC823细胞72 h后,经Hoechst33258染色发现,实验组细胞核染色质边集,出现凋亡小体。结论靶向EGFR基因RNA干扰能够阻抑胃癌细胞BGC823细胞的EGFR表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,EGFR基因有望成为胃癌基因治疗靶点。     

CD70在肝癌中的表达及其对淋巴细胞增殖抑制作用的研究

目的探讨CD70基因在肝癌中的表达及其在肝癌免疫逃逸中的作用。方法采用RT-PCR检测CD70在肝癌细胞系和肝癌组织的表达；构建CD70真核表达载体，瞬时转染HepG2细胞，与Jurkat细胞共培养，通过细胞增殖试剂(CCK8)检测对其淋巴细胞增殖的抑制作用。结果① 肝癌细胞系BEL-7402、SMMC-7721 中CD70表达呈阳性，HepG2细胞中CD70表达呈阴性；10例肝癌组织中3例CD70表达呈阳性，2例癌旁组织CD70表达均呈阴性；② 成功构建CD70的真核表达载体,瞬时转染HepG2细胞，与活化的Jurkat细胞共培养。转染CD70后的HepG2与Jurkat共培养后,Jurkat增殖抑制率（65.03%）与空细胞对照组和空载体对照组（38.01%、30.15%）相比显著升高（P＜0.01）。结论CD70基因在肝癌中呈阳性表达，并可抑制淋巴细胞的增殖活性，在肝癌细胞免疫逃逸中起了重要作用。     

CBP基因对肺鳞癌NCI-H520细胞生长侵袭的抑制作用

目的:研究CSK结合蛋白(CSK-binding protein, CBP)基因转染对人肺鳞癌NCI-H520细胞体外生长侵袭的影响?方法:构建CBP真核表达质粒pcDNA3.0-CBP,以脂质体转染法转染体外培养的人肺鳞癌细胞株NCI-H520,G418筛选出抗性克隆?Western-blotting和RT-PCR分别检测转染前后CBP蛋白和mRNA水平的变化,MTT法分析细胞生长抑制作用,Transwell体外侵袭实验和Wound-healing实验观察细胞的侵袭和迁移能力?结果:稳定转染CBP基因的细胞株有外源目的基因的整合和相应蛋白的高表达?MTT检测表明,pcDNA3.0-CBP转染组活细胞数低于未转染组和pcDNA3.0(-)空载体质粒细胞转染组(P < 0.01)?细胞侵袭?迁移实验表明转染pcDNA3.0-CBP的瘤细胞侵袭与迁移能力均明显下降(P < 0.01)?结论:外源性CBP基因稳定转染可抑制人肺鳞癌NCI-H520细胞增殖?侵袭的恶性表型?     

siRNA干扰沉默bFGF基因对肺腺癌A549增殖和凋亡的影响

目的利用小分子RNA干扰沉默碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因的表达,探讨其对肺腺癌A549细胞Oct-4表达、细胞增殖和凋亡的影响。方法将A549细胞分为转染干扰质粒组(干扰质粒组)、转染阴性对照质粒组(阴性对照组)和未转染质粒组(空白对照组)。采用Real-Time PCR检测质粒干扰后A549细胞bFGF基因mRNA表达的变化;Western Blot检测Oct-4蛋白表达的变化;CCK-8比色分析法绘制生长曲线观察细胞增殖能力变化及Annexin-V-PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果 Real-Time PCR结果显示质粒干扰后A549细胞中bFGFmRNA表达下降(P<0.01);Western Blot显示干扰组A549细胞Oct-4蛋白表达下降(P<0.01);生长曲线结果显示干扰质粒组细胞增殖活力下降明显(第2～4天P<0.0 5,第6～7天P<0.01);流式细胞仪检测凋亡结果显示细胞凋亡增加(P<0.0 5)。结论靶向bFGF基因的小分子RNA可以抑制bFGF表达;bFGF基因被抑制后下调Oct-4表达,细胞凋亡增加,增殖能力下降。     

脆性位点基因WWOX调控人胆囊癌细胞的体外增殖效应

［摘要］目的　探讨脆性基因WWOX调控胆囊癌细胞的增殖效应及其机制．方法　将前期成功构建的pcDNA3.0-WWOX重组质粒按脂质体介导转染GBC-SD细胞,同时转染空载体、脂质体为阴性对照及GBC-SD为空白对照．转染48 h后采用倒置显微镜观察各组胆囊癌细胞形态学变化,MTT、BrdU检测胆囊癌细胞增殖水平,流式细胞仪检测细胞增值周期的变化．结果　倒置显微镜观察pcDNA3.0-WWOX组GBC-SD细胞数量明显减少,悬浮细胞及细胞碎片增加,而Vector control、NC、Mock组细胞呈正常增殖状态．MTT检测显示pcDNA3.0-WWOX组GBC-SD细胞增殖于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）,并随时间推移,pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖活性抑制明显．BrdU检测显示pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖率为（0.44±0.03）,对照组分别为（0.78±0.02）,（0.81±0.01）,（0.85±0.01）,表明pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖活性较对照组降低,差异有统计学意义（P＜0.05）．细胞周期检测发现pcDNA3.0-WWOX组G0 /G1期细胞增多,G2 /M 期和S 期细胞减少,细胞凋亡率较对照组（Vector control,NC,Mock）明显增高、增殖指数下降（P＜0.05）,而对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）．结论　过表达WWOX基因体外可有效抑制胆囊癌细胞增殖活性, WWOX可能参与胆囊癌细胞恶性生物学行为的发展过程,有望成为胆囊癌基因治疗新的潜在靶点．     

抑癌基因WWOX在甲状腺癌中的表达及意义

目的探讨WWOX基因在甲状腺癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化方法检测50例甲状腺癌，31例甲状腺腺瘤及20例正常组织中WWOX蛋白的表达，并分析其与病理指标及临床特征之间的相关性。结果WWOX在甲状腺癌、甲状腺腺瘤及正常甲状腺组织中的平均积分光密度分别为：50．86±6．05、70．95±4．23、87．77±8．46。WWOX在甲状腺癌中的表达与后两者之间差异有统计学意义（P〈0．05）。未发现WWOX蛋白表达在不同临床病理指标间存在显著性差异。结论WWOX蛋白在甲状腺癌组织中呈低表达，该蛋白表达的缺失可能在甲状腺癌的发生、发展过程中发挥重要作用。     

干扰LncRNA LRRC75A-AS1抑制肺癌细胞发生发展研究

目的:探讨LncRNA LRRC75A-AS1/miR-22-3p对肺癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响及其可能作用机制.方法:采用qRT-PCR法检测肺癌组织与癌旁组织中LRRC75A-AS1、miR-22-3p的表达水平;体外培养人肺癌细胞A549,si-NC、si-LRRC75A-AS1、si-LRRC75A-AS1与...     

siRNA干扰Pokemon基因影响A549细胞增殖的实验研究

目的 研究siRNA干扰Pokemon基因对肺腺癌A549细胞增殖抑制效应的变化.方法 专业设计合成3条针对Pokemon的siRNA,分别转染A549细胞后,RT-PCR检测转录水平Pokemon mRNA表达的变化,筛选出其中最高效的1条siRNA;用MTT法检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞增殖的抑制作用;流式细胞技术检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞凋亡的影响.结果 3条siRNA均成功转染A549细胞,倒置荧光显微镜下观察细胞呈圆绿色.RT-PCR结果显示有2条siRNA使细胞中Pokemon的mRNA表达降低(P＜0.05).MTT法结果显示siRNA干扰Pokemon后对A549细胞增殖有抑制作用(P＜0.05),其中48 h抑制效率达(24.14±1.39)％.流式细胞技术检测结果显示该siRNA干扰Pokemon可增加A549细胞的凋亡,凋亡率为14.05％.结论 应用RNA干扰Pokemon基因能够抑制A549细胞的增殖,促进A549细胞的凋亡.Pokemon基因有可能成为肺癌治疗中的一个新靶点.     

幽门螺杆菌毒素蛋白Tipα对人胃黏膜上皮细胞株GES-1的影响

目的 研究幽门螺杆菌(Hp)分泌的肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导相关蛋白(Tipα)对人胃黏膜上皮细胞株GES-1的影响.方法 从Hp 26695菌株获取位于Hp 0596的Tipα基因,并将其开放读码框序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1.将重组质粒pcDNA3.1-Tipα和空质粒脂质体转染人胃黏膜上皮细胞GES-1,用G418筛选阳性克隆.同时用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹的方法检测Tipα基因的表达.以空质粒转染的GES-1细胞和正常的GES-1细胞作为对照组.采用MTY,流式细胞术,ELISA和Western印迹的方法分别检测细胞的增殖、细胞周期、致炎因子肿瘤坏死因子(TNF)-α,白细胞介素(IL)-1β,IL-8的变化,Bcl-2和P53基因的表达.结果 成功构建了Tipα基因重组真核表达质粒.Tipα基因和空载体分别转染GES-1细胞,通过G418筛选出了稳定转染株.MTY检测结果显示与对照组相比,转染重组质粒pcDNA3.1-Tipα的GES-1 (GpcDNA3.1-Tipα)生长曲线上升,提示GpcDNA3.1-Tipα细胞比转染空质粒组(GpcDNA3.1)和正常对照组(GES-1)增值更快.流式细胞术细胞周期分析显示GpcDNA3.1-Tipα细胞进入S期的比例多于GES-1细胞组和GpcDNA3.1细胞组[(45.33±1.03)%vs(38.24±1.25)%、(33.94±1.67)%],G1期比例低[(41.39±0.08)%vs(49.74±0.12)%、(49.27±0.15)%],细胞凋亡率明显低(0.76±0.04 vs 16.84±2.16、8.36±1.07).ELISA结果显示:GpcDNA3.1-Tipα,GpcDNA3.1和GES-13组细胞胞内TNF-α的浓度,各组之间差异无统计学意义(P＞0.05),而胞外TNF-α浓度,GpcDNA3.1-Tipα组高于两个对照组(均P＜0.05);GpcDNA3.1-Tipα胞内和胞外IL-1β、IL-8的浓度均高于两个对照组(P＜0.05).Western印迹结果与两个对照组比较,GpcDNA3.1-Tipα细胞Bcl-2表达增加,而P53基因表达则受到抑制.结论 GpcDNA3.1-Tipα细胞能稳定高表达Tipα蛋白,诱导致炎细胞因子TNF-β,IL-1β,IL-8的高表达,促进细胞的增殖,减少细胞凋亡,可能通过上调Bcl-2基因,下调P53基因.Tipα作为一种新的Hp毒素蛋白在Hp致胃癌发生中可能发挥重要作用.     

沉默神经元特异性烯醇酶基因对肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究神经元特异性烯醇酶(NSE)对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法用免疫细胞化学检测人小细胞肺癌(SCLC)细胞株NCI-H446和非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549中NSE蛋白的表达,再用RNA干扰技术抑制细胞中NSE基因的表达,最后用流式细胞术、Western blotting及分光光度法检测NSE基因下调后细胞周期分布、Ki67蛋白表达、凋亡细胞百分率及Caspase-3活性。结果 A549和NCI-H446细胞均表达NSE蛋白,特异性siRNA转染显著抑制了细胞中NSE基因的表达,抑制率达90%以上,NSE下调后细胞中S期细胞百分率、Ki67蛋白表达量显著降低,而凋亡细胞百分率和Caspase-3活性显著增加。结论 NSE基因的表达促进了伴有NE分化的肺癌细胞的增殖和抑制细胞凋亡,这可能是NE分化的肺癌细胞具有更为恶性表型的原因之一。     

miRNA21抑制物对食管癌细胞凋亡的影响

目的:利用miRNA21抑制物抑制食管癌细胞系ECA-109中miRNA21的表达,观察对ECA-109细胞凋亡的影响,为探讨miRNA21抑制物在食管癌治疗中的应用提供理论参考。方法:以正常培养的ECA-109细胞为空白对照组,转染miRNA21抑制物阴性对照物作为阴性对照组,转染miRNA21抑制物作为实验组,通过MTT法、流式细胞术、实时荧光定量PCR研究miRNA21抑制物对ECA-109细胞增殖、凋亡及凋亡相关基因表达的影响。结果:与空白对照组和阴性对照组相比,转染miRNA21抑制物能够显著性地抑制ECA-109细胞的增殖(P<0.05),并且明显提高ECA-109细胞的凋亡率(P<0.05),促进细胞凋亡。同时,转染miRNA21抑制剂的实验组ECA-109细胞中促凋亡基因caspase3、p53、在m RNA水平的表达均显著升高(P<0.05),而抗凋亡基因Bcl-2的表达则被显著抑制(P<0.05)。结论:miRNA21抑制剂能够抑制食管癌细胞ECA-109的增殖,增强促凋亡相关基因的表达,促进癌细胞的凋亡;miRNA21具有明显的原癌基因样功能,可作为食管癌细胞治疗的靶标。     

miR-18b-5p调控WWOX对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的研究miR-18b-5p对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响和潜在的分子机制。方法qRT-PCR检测癌旁组织和胶质瘤组织中miR-18b-5p的表达,MTT法和流式细胞术检测胶质瘤U251细胞增殖和凋亡率,Western blotting检测包含WW域的氧化还原酶基因（WWOX）、Cyclin D1、p21、Bax和Bcl-2蛋白表达,双荧光素酶报告系统验证miR-18b-5p和WWOX的调控关系。结果与癌旁组织相比,胶质瘤组织中miR-18b-5p的表达量升高（P < 0.01）。抑制miR-18b-5p表达可以抑制胶质瘤U251细胞增殖并促进细胞凋亡;miR-18b-5p靶向负调控WWOX的表达;过表达WWOX可抑制U251细胞增殖并诱导细胞凋亡;抑制WWOX表达逆转了抑制miR-18b-5p表达对U251细胞增殖、凋亡的影响（P < 0.01）。结论miR-18b-5p可能通过靶向调控WWOX表达抑制胶质瘤U251细胞增殖并诱导细胞凋亡,miR-18b-5p是胶质瘤潜在的分子靶点。     

miRNA-155表达对人肺癌细胞A549增殖的影响

【目的】探讨miRNA-155在正常肺组织和非小细胞肺癌组织中的表达及miRNA-155对人肺癌细胞A549增殖的影响。【方法】采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术检测15例非小细胞肺癌组织及其癌旁组织中miRNA-155的表达;A549细胞分别转染miR-NC和miRNA-155 mimic ,采用Real-time PCR技术检测转染后A549细胞中的miRNA-155表达水平,同时采用MTT 技术和流式细胞技术检测转染后A549细胞增殖情况,Western印迹法检测转染后A549细胞中Akt、p-Akt（Ser473）、p27、bcl-2、bax的表达。【结果】miRNA-155在非小细胞肺癌组织中的表达情况明显高于癌旁组织（ P ＜0．05）;与转染 miR-NC 组相比, A549细胞转染miRNA-155 mimic后miRNA-155表达水平明显增高（ P ＜0．001）,MTT实验和流式细胞技术显示miRNA-155促进A549细胞的增殖;Western印迹法结果显示：转染miRNA-155的A549细胞p-Akt （Ser473）,bcl-2的表达水平增高,p27、bax的表达水平降低。【结论】miRNA-155可能通过促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调p-Akt（Ser473）、bcl-2表达,同时抑制p27、bax的表达来促进非小细胞肺癌的发生发展。     

外源性P16基因导入对人膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响

目的：将外源性P16基因导入该基因纯合性缺失的人膀胱癌细胞系，观察对肿瘤细胞增殖活性及凋亡的影响。方法：构建P16逆转录病毒表达载体，转染膀胱癌细胞系，应用Northern杂交及免疫细胞化学检测外源性P16基因的表达；流式细胞仪检测细胞周期，原位细胞凋亡检测及透射电镜观察细胞凋亡。结果：转染外源P16基因的肿瘤生长速率明显降低，Ki67标记指数下降，大多数细胞被抑制在G0和G1期，同时发现凋亡细胞的存在。结论：外源性P16基因导入不仅抑制膀胱癌细胞的增殖，且可诱导其凋亡。     

乳腺癌中STAT3对HSP27和c-MYC表达的调控作用

目的:研究人乳腺癌组织中信号转导和转录激活因子3(STAT3)对热休克蛋白27(HSP27)和c-MYC的调控作用. 方法:应用免疫组化检测51例人乳腺癌组织STAT3,HSP27,c-MYC蛋白的表达,分析他们的相互关系及与临床预后相关指标的关系. 在体外应用诱骗寡核苷酸(Decoy ODNs)抑制乳腺癌细胞MDA-MB-435S STAT3活性,Western blot检测MDA-MB-435S细胞HSP27,c-MYC蛋白表达,MTT检测肿瘤细胞增殖力,FCM检测MDA-MB-435S细胞周期和凋亡. 结果:在人乳腺浸润性导管癌组织中,STAT3的表达与HSP27和c-MYC表达均成正相关(rs=0.454,P=0.001;rs=0.541,P=0.000). 使用Decoy ODNs抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S STAT3活性能使其HSP27和c-MYC表达明显下调(P均<0.01),并使细胞阻滞于G0/G1期,凋亡增加,细胞增殖能力下降(P<0.01). 结论:STAT3表达可能通过上调HSP27和c-MYC的表达,抑制乳腺癌细胞的凋亡和促进其增殖,从而有利于乳腺癌进展并使其恶性程度增高.     

腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17.2神经干细胞凋亡的影响

目的探讨重组腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)165基因治疗对缺氧状态下对神经干细胞凋亡的作用。方法体外培养C17.2神经干细胞,建立神经干细胞缺氧模型。将携带人类VEGF基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,Western-blotting分析VEGF蛋白的表达,并用流式细胞术测定细胞凋亡率的变化。Hoechst33342染色荧光显微镜观察凋亡小体。结果转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞成功表达VEGF蛋白;缺氧后神经干细胞凋亡率为(19.98±0.55)%,而转染pAdCMVVEGF165后的细胞凋亡率为(10.38±0.48)%(P<0.01),转染pAdCMVVEGF165 VEGF反义寡核脱氧核酸经干细胞凋亡率为(19.07±0.64)%,与对照组无显著差异(P>0.05)。结论腺病毒介导的VEGF165基因能高效表达VEGF;外源性VEGF对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性,有利于神经干细胞的生存。     

反义CDK4基因抑制人结肠癌细胞HT29生长

目的 将反义CDK4导入人结肠癌细胞株HT29细胞,观察其对肿瘤细胞生长的影响。方法 采用lipofectamine转染方法转染HT29细胞,Northern印迹,Western印迹,形态学和流式细胞术等方法用于转染效果的鉴定。结果 转化细胞有反义CDK4的表达,而内源性CDK4mRNA表达和蛋白合成下调,并且转化细胞的恶性行为及表型部分逆转,细胞生长受到抑制、软琼脂集落形成能力明显降低,同时揭示G1期阻滞。HT29-asCDK4细胞有较高的凋亡率。结论 反义CDK4基因可抑制HT29细胞的生长和增殖、诱导其凋亡。为结直肠癌的基因治疗提供了一种新的可能的途径。