AC－cAMP－PKA途径对淋巴细胞DNA合成的调节作用

以ＣＤ３ＭｃＡｂ为激动剂，以淋巴细胞体外ＤＮＡ合成为研究手段，探讨了ＡＣ－ｃＡＭＰ－ＰＫＡ信号途径在ＣＤ３ＭｃＡｂ诱导的淋巴细胞活化中的意义。研究结果表明ＡＣ、ｃＡＭＰ和ＰＫＡ在决定细胞对外界刺激的反应中起着重要作用。在淋巴细胞活化早期细胞内ｃＡＭＰ出现一过性升高，随着细胞活化增殖，ｃＡＭＰ降至正常水平以下。活化ＡＣ、升高细胞内ｃＡＭＰ水平可显著降低ＣＤ３ＭｃＡｂ诱导的淋巴细胞ＤＮＡ合成，而ＰＫＩ却能在一定程度上促进淋巴细胞活化增殖。     

人单核细胞超化蛋白—1（MCP—1）基因的PCR扩增,克隆…

本文报道用植物血凝素（ＰＨＡ）诱导健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ，包括单核细胞和淋巴细胞），提取细胞总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ第一链，再以其为模板进行ＰＣＲ，得到了编码成熟单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切后，回收含ＭＣＰ－１基因的长约２８０ｂｐ的ＤＮＡ片段，插入到经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切的ｐＵＣ１９载体中，进行序列分析。结果表明，ＭＣ     

人核糖体磷酸蛋白P2基因的克隆及鉴定

利用聚合酶链式反应技术（ＰＣＲ），从人肺巨细胞癌ＰＬＡ－８０１母系细胞系统克隆化高转移细胞株Ｄ中特异性扩增Ｐ２ ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ２ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ），并将扩增产物克隆入ｐＧＥＭ－３Ｚ载体，获得了重组质粒ｐＭＰ２，对其中两个克隆ｐＭＰ２－１、ｐＭＰ２－２的Ｐ２ ｃＤＮＡ进行了序列分析。结果表明：ｐＭＰ２－１的Ｐ２ｃＤＮＡ序列与文献报道基本     

骨髓增生异常综合征患者血小板内环核苷酸的变化

我们用放射免疫分析测定了２５例骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）、１８例急性非淋巴细胞性白血病（ＡＮＬＬ）、２９例正常人血小板内环一磷酸腺苷（ｃＡＭＰ）和环一磷酸鸟苷（ｃＧＭＰ）的含量，ＭＤＳ和ＡＮＬＬ病人血小板内ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ含量均明显高于正常对照（Ｐ均＜０．０１），而ＡＮＬＬ病人血小板内ｃＡＭＰ又高于ＭＤＳ病人（Ｐ＜０．０１），血小板内ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ（ｃＡ／ｃＧ）比值则缺乏规律性变化。ＭＤＳ病人的血小板聚集明显低于正常对照（Ｐ＜０．０１）．两组病人外周血小板数明显低于正常（Ｐ＜０．０１），且在正常组中，血小板内ｃＡＭＰ含量与血小板数成负相关（ｒ＝－０．７０６９，Ｐ＜０．０１）。结果提示，ＭＤＳ病人血小板聚集功能减退可能与血小板内ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ含量升高有关，且血小板内ｃＡＭＰ含量随病情的恶性程度增加而升高。     

人TPO N端结构域在毕赤酵母中的分泌表达及产物鉴定

目的在酵母系统中分泌表达人ＴＰＯＮ－端结构域，对其生物学活性进行初步研究，为与其它ＴＰＯ分子进行ＴＰＯ糖基化生物学意义的研究打基础。方法将编码人ＴＰＯ成熟肽Ｎ端１９５个氨基酸的ｃＤＮＡ与酵母整合型载体ｐＰＩＣＺαＡ重组，构建的重组质粒用ＤｒａⅠ消化成线性ＤＮＡ，转染酵母细胞ＧＳ１１５，使ＴＰＯ基因整合到酵母染色体上；用ＴＰＯ抗体筛选获得遗传性分泌稳定表达的重组酵母细胞株；用ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定ＴＰＯ产物及分子量；用对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ－Ｍｅｇ）的方法测定活性。结果获得了ＴＰＯＮ－端结构域在酵母系统中的分泌表达，表达产物可被ＴＰＯ抗血清识别，分子量约为２２０００；其产物对小鼠骨髓细胞形成ＣＦＵ－Ｍｅｇ具有明显的刺激作用。结论在巴氏毕赤酵母系统中成功地分泌表达了有生物学活性的人ＴＰＯＮ－端结构域     

人血小板生成素cDNA转染COS-7细胞及表达产物对小鼠骨髓巨核细胞的作用

将克隆全长１．１ｋｂ血小板生成素（ＴＰＯ）ｃＤＮＡ构建重组ＰＣＩｎｅｏＴＰＯ表达载体，利用ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ介导转染ＣＯＳ－７细胞中，对阳性克隆ＣＯＳ－７细胞的ＤＮＡ、ｍＲＮＡ和培养上清分别进行ＰＣＲ扩增Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、斑点杂交和ＴＰＯ夹心ＥＬＩＳＡ检测，观察表达产物对小鼠骨髓巨核细胞的作用。结果表明：全长１．１ｋｂＴＰＯｃＤＮＡ转染ＣＯＳ－７细胞获得表达，最高表达量可达４８．２８Ｕ／ｍｌ，其产物使骨髓巨核细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＭＫ）集落数增加４倍，巨核细胞增大至４２．１０±６．７０μｍ（Ｐ＜０．０１）；动态观察骨髓ＣＦＵ－ＭＫ集落数于实验第８天达最高峰，约持续２ｄ，第１０天后开始下降。提示ＴＰＯｃＤＮＡ转染ＣＯＳ－７细胞表达产物对骨髓巨核细胞生成有刺激活性     

编码与大鼠ERα—甘露糖苷酶同源的人6A8cDNA在真 …

观察６Ａ８ｃＤＮＡ（１３５８ｂｐ）在真核细胞的表达。方法Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ，构建６Ａ８ｃＤＮＡ表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ－６Ａ８ｃＤＮＡ，转染ＣＯＳ－７细胞，及基因免疫小鼠。     

人血小板生成素cDNA的克隆及序列分析

血小板生成素（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＴＰＯ）是促进血小板生成的重要细胞因子，它主要促进巨核细胞的成熟以至形成血小板。自从１９９４年报道了ＴＰＯｃＤＮＡ的序列后，ＴＰＯ的基因工程研究成为继ＥＰＯ之后的又一个热点。我们根据人ＴＰＯ信号肽和成熟肽编码区ｃＤＮＡ的５′和３′端分别合成两条引物，采用反转录－ＰＣＲ技术，成功地从人胎肝细胞ｍＲＮＡ中获得了ＴＰＯ信号肽和成熟肽编码区ｃＤＮＡ。反转录产物经ＰＣＲ扩增出分子量约为１．１ｋｂ的片段，与预计片段大小相符合。ＴＰＯｃＤＮＡ在ＡＴＧ下游３６６ｂｐ处…     

编码与大鼠ERα-甘露糖苷酶同源的人6A8 cDNA在真核细胞的表达

目的观察６Ａ８ｃＤＮＡ（１３５８ｂｐ）在真核细胞的表达。方法Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ，构建６Ａ８ｃＤＮＡ表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ－６Ａ８ｃＤＮＡ，转染ＣＯＳ－７细胞，及基因免疫小鼠。结果６Ａ８ｃＤＮＡ有４．３ｋｂ和３．５ｋｂ两种ｍＲＮＡ转录形式。４．３ｋｂｍＲＮＡ以外周血白细胞最丰富，其次为淋巴结、脾脏和骨髓，胸腺组织表达较少，胎肝则缺如。３．５ｋｂ者也以外周血白细胞最丰富，其次为肝脏、淋巴结和骨髓，胸腺和脾脏表达量最少。ｐＲｃ／ＣＭＶ－６Ａ８ｃＤＮＡ在ＣＯＳ－７细胞表达了分子量４５０００左右的蛋白质，与单抗６Ａ８有反应。ｐＲｃ／ＣＭＶ－６Ａ８ｃＤＮＡ基因免疫小鼠，６／１０只小鼠血清与人活化Ｂ细胞株３Ｄ５细胞膜有反应，５／５只对照小鼠血清呈阴性反应。结论６Ａ８ｃＤＮＡ（１３５８ｂｐ）在真核细胞获得表达，但此ｃＤＮＡ非为全长。     

人单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）基因的PCR扩增、克隆及序列分析

本文报道用植物血凝素（ＰＨＡ）诱导健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ，包括单核细胞和淋巴细胞），提取细胞总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ第一链，再以其为模板进行ＰＣＲ，得到了编码成熟单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切后，回收含ＭＣＰ－１基因的长约２８０ｂｐ的ＤＮＡ片段，插入到经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切的ｐＵＣ１９载体中，进行序列分析。结果表明，ＭＣＰ－１中第１２个氨基酸的编码序列与国外报道的不同。由ＴＧＴ变成了ＴＧＣ，但编码相同的氨基酸即半胱氨酸，其余的编码序列则完全相同，说明ＭＣＰ－１的基因型可能存在着多态性。     

重组人细胞介素12基因在CHO─dhfr~－细胞的稳定表达

将分别含有重组人ＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）两个亚单位ｃＤＮＡ的真核细胞高效表达载体，通过Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导，共转染至ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞中。经选择性培养基培养、细胞染色体ＤＮＡｄｏｔｂｌｏｔ实验、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验鉴定，筛选出能表达ｒｈＩＬ－１２的细胞株，经氨甲喋呤加压诱导，表达量约为１５０ｕ／ｍｌ，且经液氮冻存３ｍｏ以上仍有表达。本实验还研究了表达产物对人ＰＢＭＣ的促增殖作用和增加ＮＫ细胞毒活性作用，为进一步研究ｒｈＩＬ－１２的生物学功能奠定了基础。     

PTA1酵母双杂交载体的构建

血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ｐｌａｔｅｌｅｔａｎｄＴｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎｌ,ＰＴＡ１）是一种表达于活化Ｔ细胞、ＮＫ细胞及血小板表面的白细胞分化抗原和粘附分子,于１９９７年将其基因克隆成功〔１〕,又被称为ＤＮＡＸ辅助分子１（ＤＮＡＸａｃｃｅｓｓｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅ１,ＤＮＡＭ１）〔２〕。ＰＴＡ１参与血小板的活化和混合淋巴细胞反应中杀伤性Ｔ细胞的诱导。序列分析表明,ＰＴＡ１是一种穿膜糖蛋白,全长３１８ａａ。其中胞膜外区２３２ａａ,包括信号肽和２个Ｉｇ样结构域,穿膜区２５ａａ…     

抗Fas抗体诱导人肾小球系膜细胞凋亡

研究抗Ｆａｓ抗体对人肾小球系膜细胞的致凋亡作用，探讨Ｆａｓ－ＦａｓＬ在肾脏损务中的作用。方法：常规方法分离，培养人肾小球系膜细胞，并传代鉴定，用不同浓度的抗Ｆａｓ抗体刺激４－６代Ｍｃｓ１６ｈ后，荧光染色观察Ｍｃｓ凋亡变化，二苯胺法和ＤＮＡ凝胶电泳方法定量和定性分析ＭｃｓＤＮＡ片段化变化。     

大鼠神经肽Y前体融合蛋白在大肠杆菌中的超表达

应用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从大鼠腋组织钓得神经肽Ｙ（ＮＰＹ）ｃＤＮＡ编码区序列。经ＤＮＡ序列测定证实其准确性后，将该ｃＤＮＡ定向亚克隆入一大肠杆菌的表达载体ｐＭＡＬ－Ｃ＿２的果糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因中。ＤＮＡ测序表明ＮＰＹｃＤＮＡ与表达载体中ＭＢＰ开放阅读框架一致。将重组质粒转入大肠杆茵ＤＨ５α菌系中，该重组大肠杆菌在液体ＬＢ培养基中经１ｍｍｏｌ／Ｌ终浓度的ＩＰＴＧ诱导４ｈ，所表达的ＮＰＹ－ＭＢＰ融合蛋白产量高达大肠杆菌总蛋白量的６０％～７０％。超表达的ＮＰＹ经纯化后将为进一步进行结构与功能研究提供材料来源。     

血小板生成素糖基化与其体内生物学活性关系的研究

为探讨血小板生成素（ＴＰＯ）糖基化与其体内生物学活性的关系，给血小板缺乏症小鼠模型腹腔分别注射相同活性单位酵母系统表达的人ＴＰＯ成熟肽或大肠杆菌表达的人ＴＰＯＮ－端结构域蛋白，连续给药５ｄ，每天一次，末次给药后３ｄ，比较两种ＴＰＯ组动物外周血血小板数量、骨髓巨核细胞培养单位（ＣＦＵ－Ｍｅｇ）、骨髓有核细胞ＤＮＡ含量。结果高、中、低剂量的ＴＰＯ成熟肽组动物的血小板数、巨核细胞集落数和骨髓ＤＮＡ含量均明显高于ＴＰＯＮ－端结构域蛋白的相应组（Ｐ＜０．０１）。显示酵母系统表达的ＴＰＯ成熟肽比大肠杆菌表达的ＴＰＯＮ－端结构域有明显的生物学活性，这可能与它们的糖基化程度及半衰期有关。     

电转人IL6受体基因对急性白血病细胞生物学特性的影响

为了探索重组ＩＬ６－ＰＥ４０融合蛋白靶向杀伤白血病的效应，我们已成功地将编码人ＩＬ６Ｒ的全长ｃＤＮＡ转入ＢＮＭＬ大鼠急性早幼粒细胞白血病ＬＴ１２细胞中。本文研究了ＩＬ６Ｒ ｃＤＮＡ转入ＬＴ１２细胞后对该细胞原有生物学特性的影响。结果表明：①ＬＴ１２－ＩＬ６Ｒ＾＋细胞与原代细胞五种酶学组化无任何区别；②ＬＴ１２－ＩＬ６Ｒ＾＋细胞不仅高表达ＩＬ６Ｒ而且仍保持原的表面抗原性质，如与ＲＭ－１２４单抗结合；     

一例MELAS的线粒体DNA突变

为了检测中国ＭＥＬＡＳ患者的致病因素，采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交、ＰＣＲ、亚克隆及ＤＮＡ测序等技术，对１例中国线粒体脑肌病、乳酸中毒、中风样发作综合征（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｐａｔｈｙｗｉｔｈｌａｃｔｉｃａｃｉｄｏｓｉｓａｎｄｓｔｒｏｋｅ－ｌｉｋｅｅｐｉｓｏｄｅｓ，ＭＥＬＡＳ）患者的线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）进行了突变分析。检测到ＭＥＬＡＳ患者特有的Ａ→Ｇ３２４３碱基替换，这一替换导致了一个新的ＡｐａⅠ酶切位点的形成。此突变型ｍｔＤＮＡ在检测的骨骼肌及血液标本中均被发现。突变型ｍｔＤＮＡ在检测的骨骼肌及血液ｍｔＤＮＡ标本中所占的比例分别为８０％和６０％。推测这一影响到ｍｔＤＮＡ中ｔＲＮＡｌｅｕ（ＵＵＲ）基因二氢尿嘧啶环的核苷酸突变是此例ＭＥＬＡＳ的重要致病因素。此外，在所测ｍｔＤＮＡ５６１ｂｐ（２９５０～３５１０）范围内还发现了１个Ｇ→ＴＮＤ１３４２３中性突变。     

在大肠杆菌中高效表达DMD cDNA 5－7蛋白

选择ＤＭＤ／ＢＭＤ缺失突变热点区基因片段ｃＤＮＡ５～７ｋｂ，经序列测定，逐步克隆，插入到原核表达载体ｐＳＭ４３，转化大肠杆菌ＴＡＰ１０６，获得了重组基因的高效表达菌株，成功地表达出分子量４９０００的ＤＭＤｃＤＮＡ５－７蛋白，表达量占菌体总蛋白的１２％。为进一步研究Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ结构与功能奠定了基础，并为临床开展蛋白诊断的应用研究制备了基因工程抗原。     

巨噬细胞移动抑制因子研究现状

８０年代中期建立了产生人巨噬细胞（Ｍφ）移动抑制因子（ＭＩＦ）的Ｔ细胞杂交瘤并制备单克隆抗体，证明不同种属不同组织细胞来源的ＭＩＦ具有共同抗原决定簇，从人Ｔ细胞杂交瘤所建ｃＤＮＡ文库中克隆化ＭＩＦｃＤＮＡ，确定了碱基序列。从牛脑细胞和小鼠垂体细胞纯化及克隆化的ＭＩＦ与由人ＭＩＦｃＤＮＡ序列推导的ＭＩＦＮ－端有高度同源性。本文拟就有关内容作一综述。     

Duchenne型肌营养不良症的产前基因诊断研究

应用Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型肌营养不良症（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｄｙｓｔｒｏｐｙ，ＤＭＤ）基因的ｃＤＮＡｓ作为探针，以限制性片段长度多态（ＲＦＬＰ）分析为策略，采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分子杂交方法，成功地对１例可疑ＤＭＤ的男性胎儿及１例ＤＭＤ患儿进行基因诊断。结果显示该胎儿ＤＭＤ基因正常，而患儿存在ＤＭＤ基因缺失（缺失２．１５ｋｂ）。在基因分析前，应用聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术鉴定胎儿性别为男性。胎儿出生后检查结果与与产前基因诊断相吻合。为了获得高灵敏度探针，本文采用地高辛配基标记ＤＮＡ探针的方法，通过酶联免疫法，使分子杂交的ＤＮＡ检测带出现颜色反应。实验结果表明，此方法适用于基因组单拷贝ＤＮＡ顺序的检测，具有快速、安全等优越性，可以替代同位素进行推广、应用。