雷帕霉素联合顺铂对宫颈癌Hela细胞生长和对HIF-1α与VEGF表达影响的观察

目的:探讨mTOR抑制剂雷帕霉素与顺铂联合应用对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及对HIF-1α和VEGF表达的影响。方法:分别以雷帕霉素、顺铂及雷帕霉素联合顺铂处理体外培养人宫颈癌Hela细胞,采用MTT比色法检测人宫颈癌Hela细胞的抑制率,金氏公式评价两药联合用药的效果,采用RT-PCR法、蛋白质印迹法检测各组细胞HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白的表达。结果:雷帕霉素和顺铂对宫颈癌Hela细胞的生长有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性,分别联合应用2种浓度雷帕霉素(10和20nmol/mL)与顺铂(0.25和0.5mg/mL)协同治疗指数q值均>1.15,两者有协同作用。雷帕霉素与顺铂联合用药HIF-1αmRNA的表达为0.242±0.048,单独用药雷帕霉素组为0.428±0.068,顺铂组为0.357±0.051;雷帕霉素与顺铂联合用药组VEGF mRNA的表达为0.498±0.093,单独用药雷帕霉素组为0.651±0.112,顺铂组为0.623±0.125,联合用药组与单独用药组比较表达量明显降低,P<0.05;雷帕霉素与顺铂联合用药组HIF-1α蛋白的表达为0.514±0.092,单独用药雷帕霉素组为0.625±0.132,顺铂组为0.635±0.120;雷帕霉素与顺铂联合用药组VEGF蛋白的表达为0.409±0.082,单独用药雷帕霉素组为0.650±0.114,顺铂组为0.623±0.102,联合用药组与单独用药组比较表达量明显降低,P<0.05。结论:单独及联合应用雷帕霉素与顺铂对宫颈癌Hela细胞的生长均有抑制作用,两药联合应用有明显的协同作用,雷帕霉素联合顺铂具有明显下调HIF-1α、VEGF基因和蛋白表达的作用。     

羟基喜树碱对缺氧诱导的SiHa细胞HIF-1α及VEGF基因表达的影响

目的:研究羟基喜树碱(hydroxycamptothecin,HCPT)对缺氧诱导的宫颈癌SiHa细胞HIF-1α和VEGF基因表达的影响。方法:在缺氧条件下(37℃,5%CO2,1%O2饱和度)体外培养宫颈癌SiHa细胞株,经不同浓度HCPT处理24 h后,用半定量RT-PCR法和Western印迹法分别检测细胞HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表达变化,并设立药物处理常氧组和缺氧对照组进行比较。结果:HCPT对常氧组与缺氧组细胞的细胞毒性作用无明显差异。在常氧条件下,SiHa细胞内无HIF-1α蛋白表达,VEGF有低水平表达,HCPT处理对SiHa细胞HIF-1α和VEGF基因表达无影响;但缺氧可诱导细胞HIF-1α和VEGF基因表达明显上调;HCPT对缺氧细胞HIF-1α蛋白和VEGF mRNA及蛋白表达有明显抑制作用,其效应呈剂量依赖性,而对HIF-1αmRNA表达无明显抑制作用。结论:HCPT可抑制缺氧诱导的SiHa细胞内HIF-1α蛋白及其下游VEGF基因的高表达。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对乏氧宫颈癌HeLa细胞放射敏感度的影响

目的:观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(trichostatin A,TSA)对乏氧状态下人宫颈癌HeLa细胞放射敏感度的影响。方法:应用不同浓度TSA作用经乏氧预处理的人宫颈癌HeLa细胞12、24、48和72 h,MTT法检测HeLa细胞的增殖率,计算半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)和IC10值;克隆形成实验检测TSA(IC10)作用24 h对乏氧HeLa细胞的放射增敏效应;免疫细胞化学法检测TSA(IC10)对HeLa细胞中乏氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达的影响。结果:TSA对乏氧宫颈癌HeLa细胞的增殖率有明显的抑制作用,且随着TSA浓度的增加和作用时间的延长,其抑制作用逐渐增强。与乏氧照射组比较,TSA(IC10)作用乏氧HeLa细胞24 h,可增加细胞的放射敏感度(P<0.05)。乏氧HeLa细胞中HIF-1α和VEGF蛋白的表达明显高于常氧组细胞;与乏氧组比较,TSA(IC10)作用乏氧HeLa细胞24 h后,细胞中HIF-1α和VEGF蛋白表达下调。结论:TSA可能通过抑制乏氧HeLa细胞中HIF-1α和VEGF蛋白的表达而发挥放射增敏效应。     

乏氧条件下雷帕霉素对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

目的 探讨乏氧条件下雷帕霉素(RPM)对乳腺癌细胞的影响及其机制。方法 MTT法检测乏氧条件下RPM对乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖的抑制作用,采用定量RT-PCR和Western blot检测缺氧诱导因子(HIF-1α)、VEGF基因mRNA和蛋白表达。结果 缺氧条件下,RPM对MCF-7细胞生长有抑制作用;HIF-1α蛋白水平随着RPM浓度提高而降低(P＜0.01),而HIF-1α mRNA表达水平无明显变化;VEGF的转录和蛋白表达均随着RPM浓度升高抑制率增加(P＜0.01),呈剂量依赖性。结论 RPM能抑制乳腺癌的肿瘤缺氧反应,从而抑制肿瘤的生长和血管的生成。     

雷帕霉素对人淋巴瘤Raji细胞增殖、VEGF-A及HIF-1α表达的影响

目的:探讨雷帕霉素对人淋巴瘤细胞株Raji细胞体外增殖、VEGF-A及HIF-1α表达的影响及其临床意义.方法:不同浓度(0、10、50、100、250、500nmol/L)雷帕霉素对Raji细胞作用不同时间(24、48、72h)后,使用CCK8法检测细胞增殖的变化;采用蛋白质印记法(Western blot,WB)检测72h组不同浓度mTOR、VEGF-A、HIF-1α蛋白变化;采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测其mRNA的变化.结果:雷帕霉素对Raji细胞增殖具有显著抑制作用(P＜0.01);雷帕霉素处理72h后的Raji细胞,随着药物浓度增加,mTOR、VEGF-A和HIF-1 α蛋白明显减少(P＜0.01);雷帕霉素处理后的Raji细胞,随着药物浓度和作用时间的增加,mTOR、VEGF-A和HIF-1α的mRNA明显减少(P＜0.01);mTOR、VEGF-A及HIF-1α的mR-NA表达两两之间呈正相关性.结论:雷帕霉素通过mTOR通路,能明显抑制人淋巴瘤Raji细胞增殖过程,表现出明显的时间、剂量效应依赖关系;同时也可明显减少mTOR、VEGF-A、HIF-1α的mRNA的转录表达,减少p-mTOR、VEGF-A、HIF-1α等蛋白的翻译表达,从而抑制Raji细胞的生长及其血管新生.     

JAK2/STAT3信号通路对A549细胞株中HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响

目的:研究人肺腺癌细胞A549细胞中JAK2/STAT3信号通路对HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响.方法:AG490处理在氧含量正常及缺氧条件下(CoCl2 200μmol/L)48h后Western blot法测定A549细胞中HIF-1α、VEGF蛋白表达变化(分组为对照组、AG490 50μmol/L、AG490 100μmol/L、CoCl2、CoCl2+AG49050μmol/L和CoCl2+AG490 100μmol/L组).IL-6 (3.85nmol/L)处理A549细胞24h后,检测细胞中STAT3、p-STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表达变化(分组为对照组,IL-6组).结果:JAK2特异性抑制剂AG490作用48h后,相对于对照组AG490能够下调HIF-1α、VEGF的蛋白表达,且呈浓度依赖性;随浓度的升高,抑制作用更明显.缺氧条件下(CoCl2200μmol/L)能够上调HIF-1α、VEGF的蛋白表达.AG490也能够下调CoCl2诱导的HIF-1α、VEGF的蛋白表达,且呈浓度依赖性,随浓度的升高,抑制作用更显著.IL-6能够上调HIF-1α、VEGF的蛋白表达.结论:在人肺腺癌细胞A549细胞中,缺氧可上调HIF-1α和VEGF蛋白表达.JAK2/STAT3信号通路对HIF-1α和VEGF蛋白的表达具有调节作用.     

神经节苷脂GM3对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和血管内皮生长因子表达的影响

目的 研究外源性神经节苷脂GM3对人宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡和VEGF表达的影响.方法 不同浓度GM3干预HeLa细胞24 h后,MTT法检测细胞增殖变化,流式细胞学技术检测细胞凋亡率,RT-PCR技术检测细胞VEGF mRNA表达水平,Western blot技术检测细胞VEGF蛋白水平.结果 (1) GM3浓度分别为2、10、50和250 μmol/L时,HeLa细胞生长抑制率分别为9.8％、32.9％、50.7％和78.6％,半数抑制浓度(IC50)为49.8 μmol/L.(2) GM3浓度分别为10、50和250 μmol/L时,HeLa细胞凋亡率分别为(4.9±0.4)％、(15.1±0.3)％、(24.4±0.7)％.(3)当GM3浓度高于10 μmol/L时,HeLa细胞VEGF mRNA表达水平以及VEGF蛋白表达水平均显著下降(P＜0.05).结论 外源性神经节苷脂GM3能呈浓度依赖性抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖,促进HeLa细胞凋亡,下调HeLa VEGF mRNA水平和蛋白水平,提示GM3可能通过调节肿瘤细胞凋亡和肿瘤血管生成而发挥双重抗肿瘤作用.     

YC-1对人低氧HepG-2细胞系内HIF-1稳定性及其促靶基因转录活性抑制效应的观察

目的:观察3-(5'-羟甲基-2'-呋喃)-1-苄基吲唑(YC-1)对低氧肝癌HepG-2细胞系缺氧诱导因子-1(HIF-1)稳定性和其促靶基因转录活性的调节作用,以及对细胞增殖活性的影响,探讨将HIF-1作为肿瘤治疗新靶点的可能性.方法:低氧条件下培养肝癌HepG-2细胞,应用RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测不同YC-1作用浓度下HIF-1α及其靶基因mRNA和蛋白产物的表达.MTT检测YC-1时低氧HepG-2细胞恶性增殖力的影响.结果:低氧引起HIF-1α、VEGF和GPI mRNA表达显著增加,与常氧组比较差异有统计学意义,P<0.05.低氧条件下,YC-1以剂量依赖性方式抑制VEGF、GPI mRNA与蛋白表达,与对照组比较差异有统计学意义,P<0.05.低氧条件下,YC-1浓度升高不影响HIF-1α mRNA表达量,却以剂量依赖性方式抑制HIF-1α蛋白表达.低氧条件下,YC-1显著抑制HepG-2细胞生长,且呈现剂量依赖效应.结论:低氧状态下,Yc-1抑制人肝癌HepG-2细胞系内HIF-1稳定性和转录活性,且呈剂量依赖性.YC-1抑制HepG-2细胞生长,且呈现剂量依赖效应.     

川芎嗪对PG干细胞样细胞VEGF、HIF-1α蛋白表达的影响

[目的]研究活血药川芎有效成分川芎嗪对高转移性人巨细胞肺癌细胞PG-BE1干细胞样细胞VEGF、HIF-1α蛋白表达的影响。[方法]利用无血清成球培养法分选PG-BE1中的干细胞亚群并验证其干性。用含不同浓度川芎嗪的培养液干预PG-BE1干细胞样细胞,同时设立空白对照组及顺铂(DDP)组,采用ELISA法检测PG-BE1亲代细胞、干细胞样细胞(常氧环境和低氧环境)以及不同浓度药物干预后的PG-BE1干细胞样细胞的VEGF表达,采用Wester blot法检测各组HIF-1α蛋白表达。[结果 ]PG-BE1干细胞样细胞VEGF表达强于其亲代细胞(P<0.001),VEGF在低氧环境中的表达高于常氧环境(P<0.001),不同浓度川芎嗪均可下调VEGF表达(P<0.001),且具有剂量依赖性;PG-BE1干细胞样细胞HIF-1α表达强于其亲代细胞(P<0.001),HIF-1α在低氧环境中的表达高于常氧环境(P=0.001),不同浓度川芎嗪均可下调HIF-1α表达(P<0.001),但不同剂量之间差异无统计学意义(P=0.477)。[结论]PGBE1干细胞样细胞VEGF、HIF-1α表达高于其亲代细胞,低氧环境下VEGF、HIF-1α表达上调,川芎嗪对VEGF、HIF-1α表达有一定的抑制作用。     

雷帕霉素抑制人宫颈癌裸鼠移植瘤生长的作用及其机制北大核心CSCD

目的探讨雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对人宫颈癌HeLa裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及其可能的机制。方法裸鼠皮下接种HeLa细胞,建立人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为对照组、RAPA低剂量组(1.5 mg/kg)、RAPA高剂量组(4.5 mg/kg)。RAPA治疗过程中,检测肿瘤的体积、质量,免疫组织化学法及RT-PCR法检测低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α)mRNA、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA的表达及肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)。结果 RAPA低剂量组、高剂量组肿瘤生长曲线均减缓;RAPA低剂量组及高剂量组裸鼠皮下移植瘤平均体积、重量与对照组比较显著减小(P<0.01);低剂量组与高剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。RAPA低剂量组及高剂量组VEGF蛋白、VEGF及HIF-1α含量、MVD与对照组比较显著减少(P均<0.01),低剂量与高剂量组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 RAPA对裸鼠皮下移植瘤生长(体积、重量)具有明显的抑制作用,其可能机制是通过抑制HIF-1α的表达抑制VEGF的合成,进而抑制肿瘤组织的血管形成。     

芹菜素对人乳腺癌细胞血管内皮生长因子表达的影响及作用机制

目的探讨芹菜素对人乳腺癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及作用机制。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测芹菜素对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞增殖的影响;应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测VEGF的分泌水平;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF mRNA表达水平;采用双荧光素酶系统检测VEGF转录活性;通过转入pCEP4-HIF-1α观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)逆转芹菜素抑制VEGF转录活性的作用;应用Western blot检测芹菜素对HIF-1α、p-AKT、p-ERK1/2和p53表达的时间依赖性和剂量依赖性效应。结果芹菜素对MDA- MB-231细胞无明显增殖抑制效应;芹菜素降低了VEGF分泌水平、mRNA表达水平以及VEGF的转录活性,并且芹菜素对VEGF转录活性的抑制作用能够通过转入HIF-1α而逆转。芹菜素抑制HIF- 1α和p-AKT的表达,诱导p53的表达,而对p-ERK1/2的表达没有影响。结论芹菜素能够抑制乳腺癌细胞VEGF的表达,这种效应可能通过降低HIF-1α的表达来实现。     

trans-3,4,5'-Trihydroxystibene inhibits hypoxia-inducible factor 1alpha and vascular endothelial growth factor expression in human ovarian cancer cells.

trans-3,4,5'-Trihydroxystibene (resveratrol) is a natural product commonly found in the human diet and has been shown recently to have anticancer effects on various human cancer cells. However, the molecular basis for its anticancer action remains to be elucidated. In this study, we investigated the effect of resveratrol on hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1alpha) and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in human ovarian cancer cells A2780/CP70 and OVCAR-3. We found that although resveratrol did not affect HIF-1alpha mRNA levels, it did dramatically inhibit both basal-level and growth factor-induced HIF-1alpha protein expression in the cells. Resveratrol also greatly inhibited VEGF expression. Mechanistically, we demonstrated that resveratrol inhibited HIF-1alpha and VEGF expression through multiple mechanisms. First, resveratrol inhibited AKT and mitogen-activated protein kinase activation, which played a partial role in the down-regulation of HIF-1alpha expression. Second, resveratrol inhibited insulin-like growth factor 1-induced HIF-1alpha expression through the inhibition of protein translational regulators, including M(r) 70,000 ribosomal protein S6 kinase 1, S6 ribosomal protein, eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1, and eukaryotic initiation factor 4E. Finally, we showed that resveratrol substantially induced HIF-1alpha protein degradation through the proteasome pathway. Our data suggested that resveratrol may inhibit human ovarian cancer progression and angiogenesis by inhibiting HIF-1alpha and VEGF expression and thus provide a novel potential mechanism for the anticancer action of resveratrol.     

缺氧条件下YC-1对人胰腺癌细胞VEGF和GPI基因的抑制效应

目的探讨缺氧条件下3-(5’-hydroxymethyl-2’-furyl)-1-benzylindazole(YC-1)对人胰腺癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)和磷酸葡萄糖异构酶(GPI)基因的调控作用及其机制。方法缺氧条件下体外培养胰腺癌PC-3细胞株,免疫细胞化学染色法检测常氧和缺氧条件下缺氧诱导因子- 1α(HIF-1α)的表达。半定量RT-PCR检测YC-1对PC-3细胞VEGF、GPI、HIF-1αmRNA表达的调节作用。Western blot检测YC-1对PC-3细胞HIF-1α蛋白表达的调节作用。MTT法检测YC-1对缺氧PC-3细胞恶性增殖的影响。结果缺氧条件下,HIF-1α主要表达于PC-3细胞胞核内。随着YC-1浓度升高,VEGF和GPI mRNA表达、HIF-1α蛋白表达逐渐受抑,并呈明显的剂量依赖性;实验组HIF- 1αmRNA均呈强表达,其表达水平不随YC-1作用浓度的升高而降低。缺氧条件下,实验组细胞增殖抑制率均增高,100μmol／L YC-1组细胞增殖抑制率达73．28%±2．01％。结论缺氧状态下,YC-1抑制人胰腺癌PC-3细胞VEGF和GPI基因转录与其抑制HIF-1α蛋白的表达有关,YC-1能够抑制PC-3细胞生长和增殖。     

Overexpression of human papillomavirus type 16 oncoproteins enhances hypoxia-inducible factor 1 alpha protein accumulation and vascular endothelial growth factor expression in human cervical carcinoma cells.

PURPOSE: Human papillomavirus (HPV)-16 oncoproteins, E6 and E7, are associated with enhanced tumor angiogenesis in human cervical cancers. The purpose of this study was (a) to investigate whether expression of HPV-16 E6 and E7 oncoproteins induces hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1 alpha) and vascular endothelial growth factor expression in cervical cancer cells; and (b) to assess the effect of resveratrol on 16 E6- and E7-induced HIF-1 alpha and VEGF gene expression. EXPERIMENTAL DESIGN: Human cervical cancer cell lines C-33A and HeLa were transiently cotransfected with pSG5-HPV-16 E6 or 16 E7 constructs along with HIF-1 alpha small interfering RNA (siRNA) or nonspecific siRNA. The expression of HIF-1 alpha/VEGF was measured using real-time PCR, Western blot analysis, or ELISA. The in vitro angiogenic activity induced by 16 E6- and E7-transfected cells was examined. The effect of resveratrol on oncoprotein-induced HIF-1 alpha/VEGF expression and in vitro angiogenesis was investigated. RESULTS: HPV-16 E6- and E7-transfected cervical cancer cells express increased HIF-1 alpha protein and VEGF expression. These stimulatory effects were abrogated by cotransfection with either HIF-1 alpha siRNA or treatment with resveratrol. Blocking extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK 1/2) and phosphoinositide-3-kinase by PD98059 and LY294002, respectively, abolished 16 E6- and E7-induced HIF-1 alpha and VEGF expression. Functionally, we showed that HPV-16 E6- and E7-transfected cervical cancer cells stimulated in vitro capillary or tubule formation, and these angiogenic effects could be abolished either by cotransfection with HIF-1 alpha siRNA or by treatment with resveratrol. CONCLUSION: HPV-16 oncoproteins contribute to enhanced angiogenesis in cervical cancer cells via HIF-1 alpha-dependent VEGF expression. Resveratrol suppresses 16 E6- and E7-induced HIF-1 alpha-mediated angiogenic activity and, thus, is a promising chemotherapeutic agent for human cervical cancer.     

Id1对结肠癌HT-29细胞VEGF表达及增殖的影响

目的探讨分化抑制因子１(inhibitor of differentiation-1,Id1)对结肠癌HT-29细胞VEGF表达的影响及Id1在结肠癌细胞增殖中的作用。方法HT-29转染Id1表达质粒及Id-1干扰序列后,采用RT-PCR方法和Western blot法检测VEGF mRNA和蛋白的表达,MTT法检测各组细胞增殖情况。结果 Id1过表达能显著上调VEGF mRNA和蛋白表达(P<0.01),促进细胞的生长(P<0.01);Id1抑制后能显著下调VEGFmRNA和蛋白表达(P<0.01),减缓细胞的生长(P<0.01)。结论在结肠癌HT-29细胞中Id1为VEGF的上游基因,Id1可通过正性调控VEGF影响结肠癌细胞增殖。     

Tim-3在宫颈癌组织中的表达及其与恶性进展的关系

目的探讨宫颈癌细胞表达T-cell immunoglobulin and mucin domain containing 3 protein（Tim-3）与宫颈癌恶性进展的关系。方法用反转录PCR（RT-PCR）、Western blot和共聚焦显微镜检测宫颈癌细胞系HeLa和SiHa中Tim-3基因和蛋白的表达及其胞内定位;用免疫组织化学法检测43例宫颈癌组织中Tim-3的表达,并分析其与临床分期、组织分型、转移等相关性。结果证实HeLa和SiHa两个宫颈癌细胞系均表达Tim-3,在前者Tim-3分布于胞质,而在后者则分布于核内及其周围。在宫颈癌患者病理标本中可见癌巢和肿瘤血管高表达Tim-3,且Tim-3表达强度与与临床分期、组织分型和转移相关。结论宫颈癌细胞及血管内皮细胞均高表达Tim-3,且Tim-3表达强度与宫颈癌恶性进展及转移高度相关。