Survivin联用bcl-2反义寡核苷酸对白血病细胞凋亡的诱导作用

目的:探讨survivin、bcl-2反义寡核苷酸(ASODN)联用对白血病细胞凋亡的诱导作用。方法:设计并合成靶向survivin ASODN和bcl-2的ASODN,应用脂质体Lipofectamine TM2000作为载体,转染寡核苷酸入白血病K562细胞。实验分为空白对照组、脂质体空转染组、无关序列寡核苷酸组、survivin ASODN组、bcl-2ASODN组和survivin、bcl-2ASODN半量联用组。转染48h后采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR半定量检测K562细胞survivin mRNA表达。结果:survivin ASODN和bcl-2ASODN对K562细胞均有一定的增殖抑制作用,抑制率分别为48.78%、40.24%。而survivin、bcl-2ASODN半量联用组的细胞增殖抑制率为60.98%,明显高于单用组(P<0.01)。与非ASODN组相比,survivin ASODN和bcl-2ASODN均可诱导K562细胞凋亡,凋亡率分别为(13.36±4.03)%、(10.40±1.71)%,两者联用凋亡率提高到(26.14±4.39)%(P<0.01)。Survivin、bcl-2ASODN半量联用组survivin mRNA水平明显低于survivin ASODN组和bcl-2ASODN组。结论:survivin、bcl-2ASODN联用可协同抑制K562细胞的增殖,增强凋亡诱导作用,可为白血病基因治疗提供一项新策略。     

华蟾素对人膀胱肿瘤T24细胞作用机制的实验研究

目的：研究华蟾素对人膀胱肿瘤T24细胞的作用及其机制。方法 MTT法研究华蟾素对细胞的增殖作用;将细胞分为空白对照、Caspase抑制剂、华蟾素、华蟾素＋Caspase抑制剂4组,流式细胞术分析各组细胞凋亡及细胞周期,RT-qPCR法检测各组细胞AIF、Endo G mRNA表达情况。结果华蟾素能抑制T24细胞增殖;与空白组和Caspase抑制剂组相比,华蟾素组与华蟾素＋Caspase抑制剂组细胞凋亡明显（P〈0.05）,细胞周期主要阻断在S期,并且两组细胞内AIF、Endo G mRNA表达明显上调（P〈0.05）。结论华蟾素能抑制T24细胞增殖,通过Caspase依赖途径及Caspase非依赖途径诱导T24细胞凋亡。     

microRNA-21调节宫颈鳞癌SiHa细胞中PDCD4的表达研究

目的探讨microRNA(miR)-21-反义寡核苷酸(ASODN)对宫颈鳞癌SiHa细胞中PDCD4基因表达、细胞增殖与凋亡的影响。方法宫颈鳞癌SiHa细胞分3组,采用LipofectamineTM2000转染试剂,miR-21调控组转染miR-21抑制剂的ASODN,miR-21抑制剂阴性对照的ASODN,空白对照组不转染。Cell Titer和荧光TUNEL分别检测转染前后SiHa细胞增殖和凋亡的变化,流式细胞仪分析细胞周期,实时RT-PCR检测miR-21和PDCD4mRNA水平表达,Western blot检测靶蛋白PDCD4表达。结果 AS-miR-21组与阴性、空白对照组相比,SiHa细胞生长明显抑制,而阴性和空白对照组比较无明显差异;细胞凋亡率分别为(9.7±0.52)%、(3.6±0.17)%和(3.4±0.36)%;细胞周期结果显示AS-miR-21组G0/G1期细胞明显增多,S期细胞减少,与对照组间差异显著(P<0.05);实时RT-PCR结果显示,miR-21表达下降而PDCD4表达升高。Western blot检测结果显示,PDCD4表达AS-miR-21组明显高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。结论 AS-miR-21可有效抑制miR-21在宫颈鳞癌SiHa细胞中的表达并上调PDCD4基因表达,发挥抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。     

二烯丙基二硫化物对HL-60白血病细胞株VEGF表达及分泌的影响

为了研究二烯丙基二硫化物（diallyl disulfide，DADS）对白血病HL-60细胞株VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白分泌的作用，并从影响VEGF生成的角度探讨DADS的抗白血病机制，应用ELISA法检测药物作用前后白血病HL-60细胞培养上清液中VEGF蛋白的含量；RT-PCR法检测药物作用前后白血病HL-60细胞VEGF mRNA的相对含量。结果表明：HL-60细胞中均有VEGF mRNA的表达和VEGF蛋白的分泌；与空白对照相比，DADS3个浓度组（0，625，1，25，2，5μg／ml）作用HL-60细胞48小时和72小时均能下调HL-60细胞VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌（P〈0.01）。3个浓度组间差异显著（P〈0．01），其下调HL-60细胞VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌效果与浓度相关（r〉0.9，P〈0．01）。结论：DADS可能通过抑制VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌发挥抗白血病效应。     

VEGF硫代反义寡核苷酸抑制U937细胞VEGF的表达

为研究硫代磷酸化修饰的血管内皮生长因子反义脱氧寡核苷酸 (VEGF ASODN)对急性单核细胞白血病细胞系U937VEGF表达的影响 ,将终浓度分别为 10 ,2 0 ,30 μmol/L的VEGF ASODN和错义序列与U937细胞分别孵育 2 4 ,4 8,72小时 ,采用RT PCR检测VEGFmRNA的表达 ,Westernblot检测VEGF蛋白的表达。结果显示 ,VEGF ASODN对U937细胞的VEGF的表达有明显的抑制作用 ,与错义序列组和空白对照组相比有显著差异 (P<0 .0 5 ) ;错义序列组与空白对照组VEGF的表达无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 :VEGFASODN可下调白血病细胞株U937的VEGFmRNA和蛋白的表达水平。     

Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究

目的探讨生存素反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞SGC7901凋亡的诱导作用。方法设计合成特异性靶向survivin ASODN。胃癌细胞株SGC901分为4组：空白对照组（Sham）、单纯脂质体对照组（Lip）、正义链转染对照组（LipSODN）、ASODN转染组（Lip-AKSODN）。作用12、24、48h后收获各组细胞。Westernblot法检测各组细胞survivin表达情况,倒置显微镜观察细胞生长形态变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,免疫组化SP法检测细胞中Ki67表达。结果脂质体介导survivin ASODN转染后的胃癌细胞出现survivin蛋白表达明显下降;形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、凋亡小体形成;细胞凋亡率明显高于各对照组（P〈0．05）;细胞中Ki67表达水平明显降低。结论survivin反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下调survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,具有明显的抗癌作用。     

STAT3反义寡核苷酸对HepG2肝癌细胞增殖抑制和凋亡诱导作用

目的 探讨STAT3反义寡核苷酸对HepG2细胞增殖的抑制作用和细胞凋亡的诱导作用。方法： HepG2细胞体外培养，人工合成并硫代修饰STAT3 ASODN，通过脂质体转染进入HepG2细胞，倒置显微镜下观察细胞形态学变化、 MTT法检测细胞增殖抑制程度，原位末端标记（Tunel）法检测细胞凋亡指数（AI）， RT-PCR检测细胞中STAT3 mRNA 的表达水平，流式细胞仪检测细胞周期的变化和细胞凋亡率。结果： STAT3 ASODN各浓度组对HepG2细胞的增殖有明显的抑制作用，能明显诱导细胞凋亡。结论： STAT3 ASODN能够诱导HepG2细胞凋亡。     

survivin和VEGF反义寡核苷酸转染对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞经存活蛋白(survivin)和血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASODN)单独和联合转染后细胞增殖抑制率和凋亡率的改变。方法以脂质体(Lip)为载体,介导不同浓度survivin和VEGFASODN单独和联合转染A549细胞,观察细胞生长状态,MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果200、400、600 nmol/L survivin ASODN和5、10、20μmol/L VEGF ASODN均能抑制A549细胞增殖,诱导细胞凋亡率,抑制效应呈剂量依赖性;两者联合转染细胞生长抑制率和凋亡率与单独转染差异显著(P<0.01)。结论 survivin ASODN和VEGFASODN联合较单独应用能明显抑制A549细胞生长,促进细胞凋亡。研究结果为NSCLC双靶点治疗提供了实验依据。     

槐耳清膏对结肠癌SW480细胞增殖能力影响及其机制探讨

目的：探索槐耳清膏对体结肠癌SW480细胞增殖能力影响及其机制。方法：采用噻唑蓝（MTT）比色法检测槐耳清膏对SW480细胞增殖能力的作用,并探求最佳作用浓度;将体外培养细胞随机分为常氧组（NC组）、低氧组（HC组）和低氧槐耳组（HH组）,逆转录聚合酶链反应（RT PCR）检测各组血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达水平,Western blot检测蛋白表达水平。结果：槐耳清膏对SW480细胞抑制率随药物浓度增加而上升,1 mg/mL时抑制率最大（66.7%）,与氟尿嘧啶组（浓度为10μg/mL）相比无统计学意义。HH组和HC组VEGF mRNA表达均显著高于NC组,分别为4.71±0.07,4.54±0.02和1.19±0.03（P〈0.05）,但HH组与HC组比较差异无统计学意义。HC组VEGF蛋白表达显著高于NC组,分别为0.66±0.03和0.38±0.02（P〈0.05）,HH组较HC组VEGF蛋白表达均显著下降,分别为0.37±0.03和0.66±0.03（P〈0.05）。结论：槐耳清膏可抑制SW480细胞增殖,1 mg/mL时抑制率最大。其机制为槐耳清膏下调细胞内VEGF蛋白表达,从而抑制肿瘤生长。     

应用RNA干扰技术沉默vegfr-2基因的实验研究

为了探讨恶性肿瘤基因治疗的新靶点,本研究以vegfr-2的mRNA为靶点,设计、构建vegfr-2 shRNA的真核表达载体,用脂质体法将重组质粒转染人非小细胞肺癌A549细胞,用RT-PCR法及Western blot分别检测重组质粒对该基因mRNA和蛋白表达的抑制效果,应用CCK-8法检测细胞增殖、抑制情况,Hoechst染色法检测细胞凋亡形态学变化。结果表明:与空白对照、空质粒对照及scramble对照相比,干扰组shRNA能有效地降解vegfr-2mRNA,尤其转染pGenesil-1-vegfr-2-shRNA-1质粒组内源性vegfr-2 mRNA及蛋白减少更显著;在不同时间点转染干扰质粒组的A值均降低,转染后72小时抑制率最高,干扰组与空质粒组和空白对照组相比,对细胞生长抑制作用的差异有统计学意义(p0.01);Hoechst荧光染色显示,转染48小时后在荧光显微镜下干扰组细胞呈典型的细胞凋亡形态。结论:vegfr-2 shRNA真核表达载体可序列特异性下调A549细胞的基因转录和表达,有效抑制细胞增殖和诱导凋亡,提示VEGF/VEGFR-2信号通路可作为恶性肿瘤基因治疗和功能研究的理想靶点。     

hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用

为了研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用,并探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞hTERT基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖状态,应用TRAP-ELISA、TRAP-PAGE方法检测HL-60细胞端粒酶活性。结果发现反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,hTERT基因表达明显受抑,细胞生长受抑,增殖能力减弱,其抑制作用具有序列特异性及浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示反义寡核苷酸10、20和30μmol/L作用组OD450-690值分别为1.504±0.47、1.223±0.39,0.944±0.16,与未作用组(2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);正义寡核苷酸20μmol/L作用组(OD450-690值为2.376±0·65)与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。TRAP-PAGE检测表明hTERTASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol/L作用组条带最少。结论hTERT基因反义寡核苷酸能够通过封闭hTERT基因的表达而抑制HL-60细胞增殖,下调端粒酶活性。     

c-myc反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性影响及诱导凋亡作用

为了研究c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞端粒酶活性的影响及其诱导凋亡作用,探讨HL-60细胞端粒酶活性与c-myc基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞c-myc基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,采用流式细胞术进行细胞凋亡检测及细胞周期分析,琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA断裂情况,应用TRAP-ELISA法测定HL-60细胞端粒酶的活性。结果表明:反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,c-myc基因表达明显受抑;S期细胞百分数由55.6%降至30%,并出现早期凋亡峰(凋亡细胞比例占25.2%);琼脂糖凝胶电泳显示DNA凋亡梯形带;端粒酶活性检测发现反义寡核苷酸3,4,5μmol/L作用组OD450-690分别为1.952±0.14,1.805±0.40,1.616±0.41,与未作用组(OD450-690为2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);反义寡核苷酸1和2μmol/L作用组及正义寡核苷酸5μmol/L作用组OD450-690分别为2.324±0.36,2.162±0.38,2.466±0.29,与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:c-myc基因反义寡核苷酸能够通过封闭c-myc基因的表达而诱导HL-60细胞凋亡,阻止细胞由G1期进入S期,并具有下调端粒酶活性作用。     

黄芩苷对高致瘤HL-60细胞裸鼠移植瘤模型的体内抑瘤作用和机制探讨

本研究旨在探讨黄芩苷对高致瘤人白血病HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的体内抑瘤作用及其作用机制。制备高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为6组:阴性对照组(注射5%NaHCO3),黄芩苷25、50和100 mg/kg剂量组,联合用药组(黄芩苷50 mg/kg+VP16 2 mg/kg)和VP16 4 mg/kg阳性对照组,每组10只裸鼠。采用腹腔注射方式给药,14 d后每组处死5只裸鼠,对剥取的瘤块称重计算抑瘤率;通过电子显微镜观察瘤组织超微结构,病理组织学观察裸鼠各主要脏器结构改变,瘤块组织蛋白检测信号转导通路指标。观察裸鼠生存时间。结果表明,黄芩苷可抑制裸鼠HL-60细胞皮下移植瘤的生长,呈剂量依赖性。瘤组织病理组织学和透射电子显微镜检查结果显示,黄芩苷组和联合用药组的肿瘤坏死和细胞凋亡现象较阴性对照组多见。黄芩苷可能通过抑制Akt活性,下调p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达来抑制裸鼠异种移植瘤的增长。联合用药组裸鼠中位生存时间明显长于阴性对照组(P<0.05)。结论:黄芩苷可抑制高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的生长,诱导瘤组织中HL-60细胞的凋亡,其机制之一可能与抑制Akt活性并下调PI3K/Akt/mTOR信号通路有关;黄芩苷与VP16联用可明显提高荷瘤裸鼠的中位生存期,具有协同抗高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的作用。     

生存素反义寡核苷酸诱导HL-60细胞凋亡的作用探讨

目的:探讨特异性生存素(survivin)反义寡核苷酸(ASODN)对急性早幼粒细胞系HL-60细胞增殖、凋亡的影响。方法:人工合成survivin硫代ASODN,通过脂质体转染HL-60细胞后,采用MTT法检测细胞增殖抑制作用,倒置显微镜观察细胞形态学变化,原位末端标记(Tunel)法检测细胞凋亡指数(AI),RT-PCR半定量测定细胞中survivinmRNA的表达。结果:(1)survivinASODN各浓度组对HL-60细胞的增殖均有抑制作用,且呈时间-剂量依赖性。(2)survivinASODN处理组HL-60细胞的凋亡率与空白对照组、正义对照组和空转染组相比,差异有显著性(P<0.01)。(3)survivinASODN处理组HL-60细胞的survivinmRNA表达水平明显下调。结论:survivinASODN能明显抑制HL-60细胞中survivinmRNA的表达,诱导细胞凋亡。     

hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞致瘤性的影响及其诱导凋亡作用

目的研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡核苷酸(ASODN)对 HL-60细胞致瘤性的影响及其诱导凋亡作用。方法用流式细胞术检测 hTERT ASODN 转染 HL-60细胞72 h 后细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞 DNA 梯带;将转染及未转染寡核苷酸的 HL-60细胞分别接种BALB/c 裸鼠,观察成瘤情况,切片观察移植瘤组织形态;另取10只 BALB/c 裸鼠,改进成瘤方法使其均匀成瘤后分成两组,在瘤体局部分别注射 ASODN、磷酸盐缓冲液(PBS),经7d 治疗后测量瘤体并切片观察其细胞形态变化,采用 TUNEL 方法检测细胞凋亡。结果 hTERT ASODN 作用于 HL-60细胞72 h 后,流式细胞术检测出早期凋亡峰,琼脂糖凝胶电泳显示 DNA 梯形条带,SODN 组及空白对照组未检测出凋亡峰及 DNA 梯形条带 ASODN 转染的 HL-60细胞组 BALB/c 裸鼠接种后第16～17天成瘤,5只中2只成瘤,未转染组在第12～13天成瘤,5只中4只成瘤,成瘤后 ASODN 治疗组瘤组织间质及血管较少,PBS 治疗对照组瘤组织间质发达,血管丰富。成瘤后 ASODN 治疗前肿瘤体积为(100.9±24.6)mm~3,治疗后肿瘤与 PBS 对照组比较,生长明显减缓[瘤体积分别为(422.7±326.4)mm~3和(786.4±357.6)mm~3](P<0.05) 组织切片显示,ASODN 治疗组瘤组织中可见大量细胞呈现凋亡形态,PBS 治疗组则少见凋亡细胞 TUNEL 检测显示,ASODN 治疗组瘤组织中阳性细胞数较 PBS 治疗组明显增多(P<0.05)。结论 hTERT 基因 ASODN 能够诱导 HL-60细胞凋亡并降低其在 BALB/c 裸鼠体内的致瘤性,抑制移植瘤增长速度。     

川芎嗪影响血管内皮生长因子诱导HL-60白血病细胞增殖的效应

背景:川芎嗪抑制血管内皮生长因子的表达,但对其诱导HL-60白血病细胞增殖是否有抑制效应尚需进一步实验.目的:观察川芎嗪对血管内皮生长因子诱导的白血病细胞HL-60细胞增殖的影响.设计:重复测量观察.单位:武汉科技大学医学院.材料:实验于2007-03/06在武汉科技大学医学院分子生物学实验中心完成.人白血病细胞系HL-60细胞购于上海细胞生物研究所.盐酸川芎嗪注射液为无锡市第七制药有限公司产品, 批号为011014,硫酸鱼精蛋白注射液购自上海第一生化药业公司,批号为010302, 免疫组化试剂盒购自博士德公司.方法:①取对数生长期人白血病细胞系HL-60细胞,加入100 μg/L 血管内皮生长因子,分别加入终浓度为1.5,15,150 mg/L川芎嗪实验培养基,以未加川芎嗪注射液的细胞为空白对照组,只含20 mg/L鱼精蛋白的细胞为阳性对照组,同时设立血管内皮生长因子对照组,细胞培养48 h后,采用MTT法检测HL-60细胞的生长抑制率.②川芎嗪影响HL-60细胞血管内皮生长因子蛋白表达实验:用终浓度为1.5,15及150 mg/L川芎嗪处理HL-60细胞,24 h后采用免疫组织化学法计算血管内皮生长因子蛋白阳性细胞表达率.主要观察指标:① HL-60细胞生长抑制率.②血管内皮生长因子蛋白表达情况.结果:① HL-60细胞生长抑制率:川芎嗪15, 150 mg/L作用血管内皮生长因子诱导的HL-60细胞吸光度值均低于血管内皮生长因子对照组,差异有显著性意义(P < 0.05).②血管内皮生长因子蛋白表达情况:川芎嗪作用HL-60细胞24 h后,血管内皮生长因子蛋白随川芎嗪给药浓度升高表达逐渐下调,呈一定依赖性,各川芎嗪浓度干预HL-60细胞血管内皮生长因子蛋白表达阳性细胞表达率与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.01).结论:川芎嗪可抑制血管内皮生长因子诱导HL-60细胞的增殖, 并下调血管内皮生长因子蛋白的表达.     

抑制pit-1基因表达对垂体生长激素腺瘤生物学行为影响的实验研究

目的:研究垂体特异转录因子-1(pit-1)反义寡核苷酸(ASODN)对垂体生长激素(GH)腺瘤细胞增殖和细胞凋亡的影响,为以pit-1为靶点治疗GH腺瘤提供理论和实验依据。方法:设计合成硫代磷酸化反义寡核苷酸(PS-ASODN),经脂质体(lipofectin)包裹转染瘤细胞,每隔24h取样。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测ASODN对细胞生长增殖的影响;用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡和周期分布的改变,用免疫组化SABC法、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定经ASODN作用后,pit-1蛋白和pit-1mRNA表达的变化。结果:ASODN组与正义组(SODN)及对照组相比较,48h、72h后细胞生长增殖受抑制(P<0.05),96h、120h时,差异有非常显著性(P<0.01);ASODN组对细胞凋亡有显著的促进作用,细胞多阻滞于G2/M期。其作用具有序列选择的特异性,在一定的时间范围内,呈时间依赖性。ASODN显著地抑制pit-1蛋白和pit-1mRNA的表达(均P<0.05)。结论:pit-1反义寡核苷酸能够有效地抑制GH腺瘤细胞的生长而促进其凋亡,具有较好的临床应用前景。     

米哚妥林对急性白血病细胞株HL-60细胞抑制效应的研究

目的:探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂米哚妥林(PKC412)对HL-60细胞株增殖和凋亡的影响及作用机制.方法:采用CCK-8法检测不同浓度PKC412对HL-60细胞增殖的影响;瑞士吉姆萨染色法鉴定PKC412对HL-60细胞凋亡的影响;qRT-PCR检测BCL-2、P53基因的mRNA表达,Western blot...