聚合酶链反应检测伤寒沙门菌

用ＰＣＲ技术通过两对引物扩增伤寒沙门菌鞭毛抗原基因ＶＩ区一段特异性ＤＮＡ片段，并用非伤寒沙门菌作对照，结果仅伤寒沙门菌为阳性。实验表明，经二次扩增，当反应体系中达１０１１／ｍｌ个伤寒沙门菌时，即可检出。检查伤寒患者血液标本７份，粪便标本６份，ＰＣＲ阳性分别为６份和５份，而血培养阳性仅为３份和４份，肥达反应均为阴性的发热患者血液标本１２份，健康成人粪便标本６０份，ＰＣＲ均为阴性。     

聚合酶链反应扩增伤寒患者粒细胞中伤寒沙门菌DNA

目的 建立适用于临床应用的血中伤寒沙门菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）ＤＮＡ扩增的方法。方法分离患者粒细胞，采用裂解法制备模板ＤＮＡ，单管套式聚合酶链反应扩增Ｓ．ｔｙｐｈｉ鞭毛基因。结果 ６例血培养阴性而临床拟诊伤寒及２３例由血培养确诊的伤寒患者粒细胞均获得了３４３ｂｐ的扩增产物，其他３４例发热待查患者粒细胞无扩增产物出现，连续１：１０稀释Ｓ．ｔｙｐｈｉＤＮＡ，最低可检测得到４０ｆｇＤＮＡ（约１０个菌）扩增产     

聚合酶链反应扩增伤寒患者粒细胞中伤寒沙门菌DNA

目的建立适用于临床应用的血中伤寒沙门菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）ＤＮＡ扩增的方法。方法分离患者粒细胞，采用裂解法制备模板ＤＮＡ，单管套式聚合酶链反应扩增Ｓ．ｔｙｐｈｉ鞭毛基因。结果６例血培养阴性而临床拟诊伤寒及２３例由血培养确诊的伤寒患者粒细胞均获得了３４３ｂｐ的扩增产物，其他３４例发热待查患者粒细胞无扩增产物出现。连续１１０稀释Ｓ．ｔｙｐｈｉＤＮＡ，最低可检测到４０ｆｇＤＮＡ（约１０个菌）。扩增产物的ＤＮＡ序列测定结果也证实了３４３ｂｐ的扩增产物是Ｓ．ｔｙｐｈｉ鞭毛基因。结论该方法是一项简便、省时、灵敏和特异的实验室诊断伤寒的新技术，尤其对培养阴性的伤寒患者可提供早期、快速的实验室诊断，套式扩增反应在同一反应管中完成，能有效避免标本间的污染。     

聚合酶链反应检测伤寒少门菌

用ＰＣＲ技术通过两对引物扩增伤寒沙门菌鞭毛抗原基因ＶＩ区一段特异性ＤＮＡ片段，并用非伤寒沙门菌作对照，结果仅伤寒沙门菌为阳性。实验表明，经二次扩增，当反应体系中达１０＾１／ｍｌ个伤寒沙门菌时，即可检出。     

应用聚合酶链反应法检测食品中的沙门菌

目的建立食品中沙门菌聚合酶链反应（PCR）的快速检测方法。方法根据沙门菌invA基因序列设计引物;氯化镁孔雀绿选择性增菌0到8h后,煮沸法提取DNA,用PCR扩增电泳。结果PCR法能特异性检测出食品中的沙门菌,扩增片段为389bp,增菌前的检出限为10^2CFU／g,增菌后为2CFU／25g。结论应用PCR检测沙门菌具有快速、特异、灵敏和简便的特点。     

荧光探针杂交聚合酶链反应检测沙门菌

近来,国内外文献中报道了一种新的荧光标记探针杂交与聚合酶链反应(ＰＣＲ)扩增相结合的检测方法[14],该方法快速、敏感、特异,并能自动化操作,但由于试剂盒和配套自动荧光ＰＣＲ检测仪价格昂贵,使之不能被很好的应用。鉴此,我们在参考文献的基础上,改进方法,在国内现有仪器设备上,建立了荧光探针杂交ＰＣＲ同步检测方法,报告如下。一、材料和方法1菌种:13株致病性沙门菌及7株非沙门菌为临床分离株。2主要试剂和试验器材:ＴａｑＭａｎＳａｌｍｏｎｅｌｌａＰＣＲＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ…     

巢式聚合酶链反应检测麻风菌利福平耐药基因的研究

目的提高检测麻风菌的利福平耐药基因（rpoB）的敏感性。方法设立含聚合酶链反应增效剂（Q-solution）试验组和无PCR反应增效剂对照组，以比较增效剂对PCR的影响；采用巢式PCR，对第一轮PCR未扩增出rpoB基因390bp片段的标本，再进行第二轮PCR，扩增出rpoB突变集中区域的193bp片段；之后用双脱氧链终止法，对阳性PCR产物直接测序。结果Q-solution可显著提高PCR的敏感性，但是常规PCR检测rpoB基因的敏感性仅为45．2％。在确立巢式PCR最佳条件后，使用Q-solution可使其敏感性提高至90．5％。结论PCR反应增效剂和巢式PCR相结合可明显提高检测rpoB的敏感性和特异性。     

利用荧光定量聚合酶链反应快速检测沙门菌

沙门菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一,其病原沙门菌属肠杆菌科,包括那些可引起食物中毒、胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。人畜感染后可呈无症状带菌状态,也可表现为有临床症状的致死疾病。     

巢式逆转录聚合酶链反应检测冠状病毒的研究

目的 建立一种新的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)反应模式,以提高传染性非典型肺炎(SARS)冠状病毒检测的阳性率和研究病毒在机体的定位状态和致病机理。方法 采用两种RT-PCR反应模式检测SARS患者血浆、淋巴细胞、粪便以及肺组织中病毒核酸。结果 和常规PCR方法相比,新的PCR反应模式能显著提高标本中病毒的检出率,差别有统计学意义;急性期SARS患者淋巴细胞中病毒阳性率较高(84.6％);血浆中病毒阳性率较低(11.5％)。结论 新RT-PCR反应模式可能有利于早期诊断、筛检SARS病原体;淋巴细胞中病毒的检出率较高,提示此类标本可用于SARS实验室诊断,对分析和阐明SARS的发病机制亦可能有一定的指导作用。     

荧光探针杂交—聚合酶链反应检测沙门菌的研究及应用

目的：建立一种快速检测沙门菌的荧光探针杂交－聚合酶链反应（PCR）方法，方法：利用Taq DNA聚合酶的5‘-3‘核酸外切酶活性降解特异性杂交于模板上的荧光标记探针，导致荧光强度的改变，通过检测荧光强度分析PCR扩增产物。结果：选用13株常见致病性沙门菌和7株非沙门菌进行特异性分析，所有沙门菌的荧光ΔRQ值介于3－8之间，而所有非沙门菌的荧光ΔRQ值均小于1，在敏感性分析中,采用菌落CFU计数法，最低限度可检测到每PCR扩增体系中含2．25CFU的沙门菌，与传统细菌培养鉴定方法对照，对40份各种标本进行沙门菌的检测，结果该方法的特异性为100％，敏感性为93．1％，两种方法的符合率为95％，结论：用荧光探针杂交PCR检测沙门菌，是一种快速，敏感的方法。     

荧光探针杂交-聚合酶链反应检测沙门菌的研究及应用

目的建立一种快速检测沙门菌的荧光探针杂交-聚合酶链反应(PCR)方法.方法利用Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性降解特异性杂交于模板上的荧光标记探针,导致荧光强度的改变,通过检测荧光强度分析PCR扩增产物.结果选用13株常见致病性沙门菌和7株非沙门菌进行特异性分析,所有沙门菌的荧光△RQ值介于3～8之间,而所有非沙门菌的荧光△RQ值均小于1;在敏感性分析中,采用菌落CFU计数法,最低限度可检测到每PCR扩增体系中含2.25 CFU的沙门菌;与传统细菌培养鉴定方法对照,对40份各种标本进行沙门菌的检测,结果该方法的特异性为100%,敏感性为93.1%,两种方法的符合率为95%.结论用荧光探针杂交-PCR检测沙门菌,是一种快速、敏感的方法.     

利用实时荧光定量-聚合酶链反应方法检测粪便标本中的伤寒沙门菌

目的 建立针对粪便标本中伤寒沙门菌的检测方法,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高感染人群粪便标本中伤寒沙门菌的检出率。 方法 根据伤寒沙门菌特异基因STY1633设计特异性引物,优化反应条件,建立实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)反应体系。利用92株常见的非伤寒病原菌及44株伤寒沙门菌的染色体DNA评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者粪便标本及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证。 结果 利用本方法检测的伤寒沙门菌纯菌及伤寒患者标本均扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA检测中,qPCR法的最低检测限为500 fg/反应,相当于97个拷贝/反应。以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前检测下限达104 cfu/g,增菌后可达50 cfu/g。 结论 基于STY1633基因的实时荧光定量PCR方法在检测粪便中的伤寒沙门菌中具有很好的特异性、灵敏度,为伤寒沙门菌的快速诊断及某些不明原因发热及腹泻症状的病原初步鉴定提供了新的简便型手段,对于伤寒的早期诊断及预防控制提供了技术支持。     

聚合酶链反应扩增STY3671基因鉴别伤寒与甲型副伤寒沙门菌

目的 评价伤寒沙门菌基因STY3671用于特异性检测该血清型沙门菌的可能性。 方法 根据伤寒沙门菌与甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白质组比较得到的伤寒沙门菌特异性蛋白点编码基因STY3671的序列设计引物,提取伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌以及其他非伤寒沙门菌血清型菌株的基因组DNA进行PCR检测, 对引物特异性和灵敏性进行分析。 结果 检测的184株伤寒沙门菌均得到807 bp长度片段,部分菌株扩增产物测序结果与伤寒沙门菌标准株CT-18一致。146株甲型副伤寒沙门菌以及其余163株其他血清型沙门菌均未扩增出该片段。 结论 STY3671基因能够作为特异性检测伤寒沙门菌的靶标,能够区别于甲型副伤寒沙门菌及其他常见非伤寒沙门菌血清型,在发热患者的伤寒沙门菌感染诊断、尤其使用血液标本检测中具有良好的潜在价值。     

巢式聚合酶链反应快速检测贝氏柯克斯体的研究

目的 建立特异敏感的快速检测贝氏柯克斯体的分子生物学方法。方法 采用巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法,进行实验室模拟检测。结果 以贝氏柯克斯体ｃｏｍｌ基因（编码２７０００蛋白）为靶标设计了２对引物;该引物特异性实验表明仅贝氏柯克斯体特异性 段可以扩增出来,其余相关立克次体均扩不出;敏感性测试结果可检测出１．５ｆｇdisplay structure     

巢式聚合酶链反应检测A组轮状病毒基因型的研究

目的用巢式聚合酶链反应(PCR)对A组轮状病毒常见G、P基因型进行检测。方法根据A组轮状病毒不同型别共有的VP4、VP7基因设计的引物分别用于G、P分型的第1次PCR扩增,然后用可以区分不同G型和P型的A组轮状病毒的引物进行第2次PCR扩增。对不同型别A组轮状病毒标准毒株和68例A组轮状病毒腹泻的粪便标本进行了G、P型别的检测。结果不同型别A组轮状病毒标准毒株分别扩增出不同长度片段的条带。68例被检测的A组轮状病毒腹泻粪便标本中G分型以G3为主,P分型以P8为主,其余型别少见。结论巢式PCR检测A组轮状病毒基因型的分型具有较高的灵敏度,操作简便快速,适用于临床检测。     

巢式聚合酶链反应检测A组轮状病毒基因型的研究

目的用巢式聚合酶链反应（PCR）对A组轮状病毒常见G、P基因型进行检测。方法根据A组轮状病毒不同型别共有的VP4、VP7基因设计的引物分别用于G、P分型的第1次PCR扩增,然后用可以区分不同G型和P型的A组轮状病毒的引物进行第2次PCR扩增。对不同型别A组轮状病毒标准毒株和68例A组轮状病毒腹泻的粪便标本进行了G、P型别的检测。结果不同型别A组轮状病毒标准毒株分别扩增出不同长度片段的条带。68例被检测的A组轮状病毒腹泻粪便标本中G分型以G3为主,P分型以P8为主,其余型别少见。结论巢式PCR检测A组轮状病毒基因型的分型具有较高的灵敏度,操作简便快速,适用于临床检测。     

巢式聚合酶链反应检测SEN病毒方法的建立

目的 建立用于SEN病毒（SENV）检测的巢式聚合酶链反应（nPCR）方法。方法 选择SENV各亚型间高度保守的5′端非编码区（5′－NCR）序列设计2对特异性引物，建立可同时检测SENV所有亚型的nPCR方法。对173例慢性乙型肝炎（CHB）患血清和96份正常人血清进行SENV检测，并随机选择3份PCR阳性产物进行克隆测序。结果 倍比稀释实验表明该方法的终检稀释度为10^3。PCR产物克隆测序结果显示：各分离株与Genbank收录的SENV序列相应区段同源性为95％－96％。CHB患SENV感染率为86．1％，正常人为85．1％，二差异无显性（χ^2=0.381,P=0.537)。结论 该方法敏感、特异且简便经济，适于开展SENV的流行病学研究。