HCV核心蛋白与截短型HBV表面抗原中蛋白的协同反式激活功能

目的 探讨HCV核心蛋白与截短型HBV表面抗原中蛋白的协同反式激活作用。方法 构建表达HCV核心蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)-core和表达截短型HBV表面抗原中蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)-Mt；转染HepG2细胞，从转录和翻译水平鉴定病毒基因的瞬时表达；与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞，检测β－半乳糖苷酶（β-gal)表达活性，酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子（增强子）功能的影响。结果 构建成HCV核心蛋白及截短型HBV表面抗原中蛋白的重组表达载体pcDNA3.1(-)-core、pcDNA3.1(-)-Mt；在HepG2细胞均能瞬时表达相应的病毒蛋白；单独的共转染实验中pcDNA3.1(-)-core、pcDNA3.1(-)-Mt组的β-gal的表达分别是对照的4．6和3．2倍，两种质粒共同转染时酶的表达是对照组的8．4倍；表达质粒对β－gal表达的激活作用呈剂量依赖性。结论 HepG2细胞中表达的HCV核心蛋白和截短型HBV表面抗原中蛋白均具有反式激活SV40早期启动子（增强子）的功能，并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染，尤其是共同感染的致病（癌）机制。     

乙型肝炎病毒X蛋白上调白细胞介素-18基因的表达

目的:了解乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)与白细胞介素-18(IL-18)基因表达的关系,研究HBxAg在HBV致病的分子生物学机制中的作用.方法:聚合酶链反应(PCR)扩增人IL-18基因启动子DNA,命名为IL-18P.以T-A克隆法,将IL-18P基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pGEM-T-IL-18P,与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnⅠ和BglⅡ双酶切后构建IL-18启动子报告基因表达载体pCAT3-IL-18P,以重组表达质粒pCAT3-IL-18P和HBxAg表达载体pcDNA-HBxAg瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,48小时后收获细胞.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解乙型肝炎病毒X蛋白对IL-18基因表达的影响.结果:构建的报告基因表达载体pCAT3-IL-18P经过序列分析和酶切鉴定正确.真核表达载体pcDNA3.1(阴性)-X和pCAT3-IL-18P共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3空载体的6.2倍,是pCAT3-IL-18P的1.17倍.结论:乙型肝炎病毒X蛋白可上调IL-18启动子的转录活性,促进IL-18基因表达.     

乙型肝炎病毒前-S2蛋白下调诱导型一氧化氮合酶基因启动子的转录活性

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)前-S2(pre-S2)蛋白对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子转录的调节作用。方法利用生物信息学技术确定iNOS基因的启动子区域(iNOSp)和3个缺失突变体的基因序列,聚合酶链反应(PCR)分别扩增iNOSp和3个缺失突变体的基因序列,分别克隆至报告基因表达载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-iNOSp载体;以构建的这4种报告基因表达载体,分别转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBV pre-S2共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果成功获得iNOS基因启动子和3个缺失突变体的正确克隆,p1-iNOSp、p3-iNOSp启动子和pcDNA3.1 (-)-HBV pre-S2瞬时共转染HepG2细胞时,iNOS启动子的转录活性明显下降,HBV pre-S2蛋白对p1- iNOSp、p3-iNOSp表达活性的抑制率分别是54.7%和79.5%,p2-iNOSp、p4-iNOSp与pcDNA3.1(-)-HBV pre-S2共转染HepG2细胞后,HBV pre-S2蛋白对p2-iNOSp、p4-iNOSp表达活性没有明显的调节作用。重复试验得到了相似的结果。结论HBV pre-S2蛋白在细胞内的表达对iNOS启动子的转录活性具有明显的下调作用。     

乙型肝炎病毒X蛋白上调硫氧还蛋白还原酶1基因表达的研究

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)技术扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与HBxAg真核表达载体pcDNA3.1(-)-X共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果结果表明,pCAT3-TXNRD1p和pcDNA3.1(-)-X瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的19.3倍,pCAT3-TXNRD1p的3.9倍.结论克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBxAg具有对TXNRDl的反式激活作用.     

HBV pre-X转染HepG2细胞后差异表达基因的筛选

目的:检测HBV Pre-X在真核表达栽体PcDNA3.1-myc-his-HBV pre-X转染的HepG2细胞中的表达,并筛选其中的代谢相关差异表达基因.方法:将构建的真核表达载体pcDNA3.1-mychis-HBV pre-X转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹检测:将pcDNA3.1-myc-his-HBV pre-X和pcDNA3.1-myc-his载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA后逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因.结果:构建的真核表达载体经ApsI、BstXI双酶切鉴定,转染HepG2细胞后HBV pre-X表达经蛋白免疫印迹证实:经基因表达谱芯片分析发现,其中基因表达水平显著上调和下调的分别是200个和62个.结论:筛选HBV pre-X转染HepG2细胞后的代谢相关差异表达基因,从而为乙型肝炎病毒合并糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的分子生物学机制的研究提供了重要依据.     

精氨琥珀酸裂解酶上调乙型肝炎病毒表面抗原启动子Ⅰ的研究

目的了解精氨琥珀酸裂解酶(ASL)与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原启动子-Ⅰ(SpⅠ)的关系，研究精氨琥珀酸裂解酶与SPⅠ在HBV致病的分子生物学机制中的作用。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增精氨琥珀酸裂解酶编码基因。以T-A克隆法，将ASL基因片段连人载体pGEM—T。将获得的质粒pGEM-T-ASL，与报告质粒pcDNA3．1(-)分别用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后构建ASL表达载体pcDNA3．1(-)-ASL，将重组表达载体pcDNA3．1(-)-ASL和pCAT3-SpⅠ瞬时转染HepG2细胞，同时转染pCAT3-basic入HepG2细胞，作为阴性对照，48h后收获细胞。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性，以了解ASL对SpⅠ转录活性的调节作用。结果构建的真核表达载体pcDNA3．1(-)-ASL经过酶切鉴定和测序证实正确。在真核表达载体pcDNA3．1(-)-ASL和pCAT3-SpⅠ共转染的HepG2细胞中，CAT表达活性是CAT3空载体的3．3倍，是pCAT3-SpⅠ的1．45倍。结论精氨琥珀酸裂解酶可以上调SpⅠ启动子的活性，促进表面抗原基因的表达。     

HCV核心基因转染HepG2细胞后基因表达差异筛选

目的将真核表达载体pcDNA3.1(-)HCV core转染到HepG2细胞,在HepG2细胞中表达HCV核心蛋白,并筛选其中的差异表达基因。方法将构建的真核表达载体pCDNA3.1(-)HCVcore转染HepG2细胞后进行蛋白免疫印迹检测;将pcDNA3.1(-)HCVcore和pcDNA3.1(-)载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA并逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因。结果构建的真核表达载体经双酶切鉴定;转染HepG2细胞后HCV核心蛋白表达经蛋白免疫印迹证实;经基因表达谱芯片分析发现,其中基因表达水平显著上调和下调的分别是181个和48个。结论筛选HCV核心基因转染HepG2细胞后的糖类和脂类物质代谢相关的差异表达基因,从而为丙型肝炎病毒合并糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的分子生物学机制的研究提供了重要依据。     

HBsAg基因启动子Ⅰ DNA结合蛋白1下调IL-18基因启动子

目的:研究HBsAg基因启动子I DNA结合蛋白1(SBP1)与白介素-18(IL-18)基因表达的关系,研究SBP1在HBV致病的分子生物学机制中的作用. 方法:构建质粒pcDNA3.1(-)-SBP1,pCAT3-IL-18,转染HepG2细胞进行表达,应用酶联免疫黏附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性. 结果:构建的表达载体pcDNA3.1(-)-SBP1经过序列分析和酶切鉴定正确.真核表达载体pcDNA3.1(-)-SBP1和pCAT3-IL-18P共转染的HepG2细胞的pCAT表达活性是pCAT3空载体的0.37倍,是转染pCAT3-IL-18P的0.17 倍,抑制率达到86.32%. 结论:SBP1可以下调IL-18启动子的活性,抑制IL-18基因的表达.     

乙型肝炎病毒表面抗原主蛋白上调硫氧还蛋白还原酶1基因的表达

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原主蛋白(SHBs)对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法 以我室构建的SHBs基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-SHBs共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果 pCAT3-TXNRD1p与pcDNA3.1(-)-SHBs瞬时共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-TXNRD1p的7.4倍,是pCAT3-TXNRD1p与pcDNA3.1(-)-empty共转染的2.5倍.结论 我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBV的SHBs蛋白可以上调TXNRD1的启动子活性.     

基因表达谱芯片技术筛选HBV DNA多聚酶RNase H反式调节基因

目的:应用基因表达谱芯片(基因芯片)技术,检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶RNase H结构域蛋白(HBV DNA P-RNase H, RNase H)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明RNase H对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:以常规的分子生物学技术构建真核表达载体pcDNA 3.1(-)-RNase H,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA 3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果:RNase H表达质粒转染的细胞有222条差异表达基因,其中113条基因表达水平上调,109条基因表达水平下调.结论:应用基因芯片成功筛选了RNase H转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明RNase H的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.     

双环醇下调细胞周期素B2基因启动子转录活性研究

目的探讨双环醇对细胞周期素(cyclin)B2启动子转录活性的调节作用.方法根据文献报道的结果确定细胞周期素B2的启动子DNA序列区域,以聚合酶链反应(PCR)扩增细胞周期素启动子(B2p),克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-cyclinB2p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性:并与双环醇共刺激的HepG2细胞,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果成功获得细胞周期素B2启动子的止确克隆.pCAT3-cyclinB2p和双环醇(106Mol/L)瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的2.4倍,pCAT3-cyclinB2p的0.35倍.结论细胞周期素B2启动子有顺式激活下游基因的活性,双环醇具有对细胞周期素B2基因有下调作用.     

SV40T抗原真核表达载体的构建及其在食管癌细胞EC9706中的表达鉴定

构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV和非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,行酶切及测序鉴定.用脂质体转染法将构建的载体导入食管癌细胞EC9706细胞株,RT-PCR法检测SV40T抗原基因的表达,免疫组化法检测蛋白表达情况. 结果限制性内切酶分析与测序结果示H /K ATP酶β亚基启动子与SV40T基因成功构建于pcDNA3.1(-)真核表达载体中;转染细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出618 bp和272 bp的特异性片段,非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV瞬时转染时SV40T抗原表达阳性,而特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV转染组蛋白表达阴性.认为构建特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV并在食管癌细胞EC9706中检测其表达为转基因肿瘤动物模型的建立奠定了理论基础.     

乙型肝炎表面抗原基因启动子ⅠDNA结合蛋白1对诱导型一氧化氮合酶基因启动子转录活性的双向调节

目的探讨HBV表面抗原基因启动子ⅠDNA结合蛋白1（SBP1）对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因启动子转录的凋节作用。方法利用生物信息学技术确定iNOS基因的启动子区域（iNOSp）和3个缺失突变体的基因序列，PCR分别扩增iNOSp和3个缺失体的基因序列，分别克隆至报告基因表达载体pCAT3-Basic中，构建pCAT3-iNOSp报告载体；以构建的这4种报告质粒分别转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2，用ELISA检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性；并与构建的真核表达载体pcDNA3．1（-）-HBVSBP1共转染HepG2细胞系，用ELISA检测CAT的表达活性。结果成功获得iNOS基因启动子和3个缺失突变体的正确克隆，其中pl—iNOSp和pcDNA3．1（-）-HBVSBP1瞬时共转染HepG2细胞时，iNOS启动子的转录活性上升1．54倍；p3-iNOSp启动子和pcDNA3．1（-）-HBVSBP1瞬时共转染HepG2细胞时，iNOS启动子的转录活性下降31．3％，重复实验得到相似结果。结论克隆的新基因SBP1在细胞内的表达，对iNOS基因反式激活iNOS启动子的转录活性具有明显的双向凋节作用，双向调节的部位是iNOS启动子的核因子（NF）-IL6、A-激活域结合位点（AABS）和NF-κB这3个结合位点。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶N末端蛋白基因芯片研究

目的:检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶N末端蛋白(TP) 的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TP在乙型肝炎陧性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制. 方法:根据AF384372 HBVDNA病毒株序列设计、合成HBV DNA P-TP基因序列特异性的引物,以含有AF384372HBVDNA P全基因组cDNA的质粒G318A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HBV DNA-TP 编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定, 构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TP.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析. 结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有TP蛋白的表达,提取高质量的mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA 芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有111 个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV DNA P-TP转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TP蛋白致病的分子生物学机制提供依据.     

乙型肝炎病毒核心蛋白突变体干扰HBV包装的实验研究

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白突变体基因的真核表达载体，转染HepG2细胞，观察其表达及干扰HBV颗粒包装的显性负调节作用。方法：采用PCR从质粒pHBVadrl-A1中扩增HBVadr1-A1中扩增HBV C基因和S基因，分别克隆到pGEM-T载体上，构建成pGEM-T-C和pGEM-T-S，进而构建成pGEM-T-CS载体，用HindⅢ切出克隆基因片段与pcDNA3.1连接，经PCR鉴定后构建成真核表达载体pcDNA3.1^ -CS,DNA测序显示基因融合正确，表达载体转染HepG2细胞，经G418筛选得到高拷贝转化子，逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测重组蛋白体外表达，用HBV阳性血清感染HepG2细胞，72h后提提细胞内HBV DNA，斑点杂交法分析各组DNA，结果：核心蛋白突变体在HepG2细胞内得到表达，且表达了该重组蛋白的HepG2细胞内HBV DNA量不同程度地低于对照组，表明重组蛋白具有抗HBV包装的DN突变体作用，结论：HBV核心蛋白与表面蛋白融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-CS能够体外表达核心蛋白突变体，该突变体具有干扰HBV颗粒包装的显性负调节作用。     

核心蛋白聚糖在HepG2细胞中的表达及作用

目的 构建分泌型核心蛋白聚糖(DCN)真核表达载体,并观察其在肝癌细胞HepG2中的表达和抗肿瘤作用.方法 应用PCR技术扩增DCN全长基因eDNA片段,与pcDNA3.1载体连接,并转化到大肠杆菌中扩增获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体,脂质体介导转染HepG2,经G418筛选建立稳定转染细胞株,采用RT-PCR、免疫组化检测其表达.MTT检测细胞增殖活力,流式细胞仪分析细胞周期.结果 RT-PCR可见转染组细胞mRNA表达明显增多,免疫组化可见转染组细胞DCN蛋白表达明显增高.细胞生长曲线显示转染组细胞生长缓慢,G,期细胞显著增多.结论 本方法可成功建立稳定转染DCN的HepG:细胞株,并证实DCN能够抑制HepG:细胞株的生长.     

靶向cyclinE小干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的:以cyclinE基因编码区为靶位,构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,观察转染后对HepG2细胞的影响.方法:针对cyclinE基因序列构建表达siRNA的真核表达载体pSilencer3.1-H1hygro,利用脂质体Metafectene转染CyclinE基因高表达的肝癌细胞株HepG2.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR和Western blot法观察转染后细胞cyclinE基因表达.结果:成功构建了表达siRNA的真核质粒载体,转染后cyclinE基因mRNA及蛋白表达水平分别下降了79%和65%.结论:靶向cyclinE基因的siRNA可有效沉默HepG2细胞高表达的cyclinE基因,从而抑制肝癌细胞的增殖并促进凋亡.     

乙型肝炎病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）启动子（含增强子）调控下的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因在肝癌细胞中的表达.方法用聚合酶链反应（PCR）技术分别扩增出HBV的4个启动子,载入T载体,测序后插入到含EGFP报告基因的质粒pEGFP-1,构建出HBV不同启动子调控的EGFP基因表达载体,经酶切、测序鉴定各重组体.采用脂质体介导法将4种构建好的载体转染肝癌细胞株HepG2,用倒置荧光显微镜观察各重组体转染细胞中EGFP的表达.结果各目的片段测序正确并成功插入表达载体中,转染了各质粒的阳性细胞克隆均可检测出EGFP的表达,不同启动子调控下的蛋白表达量有所不同. 结论HBV启动子调控下的EGFP报告基因能够在肝癌细胞中特异表达,不同启动子表达效率之间存在一定的差异性,从而为肝脏疾病的基因治疗提供了一个新的选择.     

重组核心蛋白聚糖转染对肝癌HepG2细胞周期、caspase-3影响的研究

目的 将已构建完成的分泌型核心蛋白聚糖(DCN)真核表达载体转染到肝癌HepG2细胞中并检测其表达,同时探讨DCN抗肿瘤作用的机制.方法 实验分为对照组细胞和转染组细胞;脂质体介导核心蛋白聚糖真核表达载体及质粒pcDNA3.1分别转染到肝癌HepG2细胞中,经G418筛选建立稳定转染的细胞株,采用RT-PCR、免疫组化和Western印迹法检测DCN表达;同时检测细胞周期、caspase-3酶活性.结果 与对照组细胞比较,转染组细胞DNC mRNA及蛋白质表达均明显增高(P＜0.05);细胞生长缓慢,G0/G1期细胞显著增多,S期细胞明显降低(P＜0.05);caspase-3酶活性显著增多(P＜0.05).结论 成功建立了稳定转染DCN的HepG2细胞株,并证实DCN能抑制细胞生长、阻滞细胞周期、提高caspase-3酶活性.     

HBV X基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡的影响及其机制

目的:研究HBV X基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法:用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3/HBx瞬时转入HepG2细胞,以未转染的HepG2细胞及转染空载体pcDNA3的细胞为对照.RT-PCR法检测HBx基因的表达;MTT法检测各组细胞的增殖活性;TUNEL法检测各组的凋亡情况.β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-xL、c-myc的表达量变化.结果:pcDNA3-X转染HepG2细胞后,RT-PCR扩增出HBV X片段,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段.HepG2细胞转染HBx基因后,相对于对照组细胞增殖能力明显下降,凋亡增多,差异有显著性意义(P＜0.01);转染HBx的细胞Bax、Bcl-xL、c-myc mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:成功将HBx基因转染入HepG2细胞,并在细胞中表达,转染HBx基因可同时上调Bax、Bcl-xL、c-myc mRNA表达,促进HepG2细胞凋亡,抑制增殖.