重组葡激酶的表达纯化及纤溶活性鉴定

目的:构建葡激酶(Staphylokinase,SAK)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达SAK蛋白质,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法:基于生物信息学方法分析优化基因序列,使用基因合成技术合成SAK基因,转化感受态大肠杆菌B834菌株,使在其中表达,利用离子交换柱,分子筛(Superdex 75)等进行分离纯化,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物活性。结果:SAK在大肠杆菌中以可溶上清的方式高效表达,利用离子交换柱和分子筛等纯化效果良好,纯度达95%,体外实验显示其纤溶活性与尿激酶标准品相当。结论:应用全基因合成经过优化的基因可在大肠杆菌系统中高效上清表达具有较高纤溶活性的SAK。     

RP-HPLC法测定马钱子胶囊中士的宁与马钱子碱的含量

目的:建立自制中药制剂马钱子胶囊中士的宁与马钱子碱的RP-HPLC测定方法。方法:色谱柱:Diamonsi1 ODS-C18柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相:乙睛-0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值2.8)(23:77),流速1.0 mL/min,检测波长260nm,柱温25℃。结果:士的宁与马钱子碱的线性范围分别是0.1226μg~2.452μg(r=0.99998)、0.1074μg~2.148μg(r=0.99994)。平均加样回收率分别为101.11%、99.83%,RSD分别是1.97%、2.13%。结论:本法操作简便、快速、准确、重现性好,可用于马钱子胶囊的质量控制。     

HPLC法测定马钱子及伤科七味片中士的宁和马钱子碱的含量

采用反相高效液相色谱法，ODS柱，以己腈－甲醇－水－冰醋酸（40：35：25：0．5）为流动相．同时测定马钱子药材及伤科六味片中士的宁和马钱子喊的含量，数据可靠，结果准确。     

通脉丸溶出液中士的宁和马钱子碱的含量测定

目的:建立通脉丸溶出液中士的宁和马钱子碱的含量测定方法。方法:采用超高效液相色谱法测定通脉丸溶出液中士的宁和马钱子碱的含量,色谱条件:Acquity UPLC BEH C_(18)(2.1 mm×100 mm,1.7μm)色谱柱,以乙腈-0.02 mol·L~(-1)磷酸二氢钾与0.014 8 mol·L~(-1)庚烷磺酸钠等量混合溶液(用体积分数10%磷酸调节PH为2.8)(17∶83)为流动相;检测波长为260 nm;流速为0.3 m L·min~(-1);柱温30℃。结果:本方法对通脉丸溶出液中士的宁与马钱子碱均能适用,其中马钱子碱在3.712~74.24μg、士的宁在3.472~69.44μg内呈良好线性关系,r~2=0.999 9,平均加样回收率分别为102.65%(RSD 1.08%),104.19%(RSD 1.46%)。结论:该法分离效果好,专属性强,操作简便快捷,适用于通脉丸溶出液中马钱子碱与士的宁的测定。     

用高效液相色谱法同时测定九分散中麻黄碱和士的宁的含量

用高效液相色谱在同一测定条件下，经一次测定同时对九分散中麻黄碱和士的宁进行定量；并对样品提取方法进行了考察。为九分散的质量控制提供了一个简便、可靠的方法。     

HPLC测定风湿马钱片中士的宁和马钱子碱含量

报道了ＨＰＬＣ法同时测定风湿马钱片中士的宁和马钱子碱的含量。色谱条件：色谱柱：ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅＴＭ－ｃｙａｎｏ（５μｍ,１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）;流动相：由Ａ、Ｂ两泵输送,Ａ泵－甲醇,Ｂ泵－乙酸３０ｍｌ,三乙胺１５ｍｌ加水至２００ｍｌ,两泵输出体积比为：Ａ：Ｂ＝９５：５,ｐＨ６．７;ＵＶ检测器;检测波长：２５４ｎｍ。在２～１０μｇ／ｍｌ浓度范围内,士的宁标准曲线的相关系数ｒ＝０．９９９８,回收率为９９．６％,在１～８μｇ／ｍｌ浓度范围内,马钱子碱标准曲线的相关系数ｒ＝０．９９７６,回收率为９８．６％。     

高效液相色谱法同时测定制马钱子中士的宁和马钱子碱的含量

建立了用高效液相色谱法同时测定制马钱子中士的宁和马钱子碱的含量。氯仿－浓氨溶液（９０∶１０）作溶剂,超声波振荡提取。硅胶柱,氯仿－甲醇－浓氨溶液（９０∶１０∶０．３）为流动相,紫外２５４ｎｍ波长检测。平均加样回收率（ｎ＝５）士的宁为９８．２％,ＲＳＤ＝１．４％;马钱子碱为９９．３％,ＲＳＤ＝３．３％。日内、日间精密度（ＲＳＤ）士的宁分别为０．６％和１．３％;马钱子碱分别为１．１％和２．４％。     

高效液相色谱法测定骨刺胶囊中士的宁

目的 建立骨刺胶囊中士的宁的测定方法。方法 采用HPLC法测定,Zorbax Eclipse XDBC¹⁸色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相为乙腈0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值2.8);体积流量0.8 mL/min;柱温35 ℃;检测波长260 nm;进样量20 μL。结果 士的宁在0.118 8～1.782 0 μg线性关系良好。平均回收率96.34%,RSD为0.50%。结论 该方法简便,灵敏,专属性强,重复性好,可作为骨刺胶囊的质量控制方法。     

反相高效液相法测定通痹灵片中马钱子碱、士的宁的含量

[目的]建立测定通痹灵片中马钱子碱、士的宁含量的方法。[方法]采用反相高效液相色谱法,色谱柱为NUCLEODUR C_(18) Gravity分析柱(125mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇—水(60:40)1000 mL中加入磷酸二氢钾0.5g、十二烷基磺酸钠1.0g、三乙胺0.5ml(冰醋酸调pH至4.5),检测波长254nm,流速1.0mL/min,室温操作。[结果]马钱子碱、士的宁平均回收率分别为97.69％(RSD=2.03％),97.93％(RSD=2.61％)。[结论]本方法快速准确,可作为通痹灵片的质控指标。     

近红外光谱技术监测腰痛宁胶囊生产过程中混合均匀度的研究

目的 采用近红外光谱技术检测腰痛宁胶囊粉末的混合均匀度,确定混合终点。方法 使用近红外光谱仪采集腰痛宁胶囊药粉混合过程图谱,通过计算机分析软件,进行药粉混合均匀度的趋势分析,同时采集不同混合时间的样品,以士的宁、马钱子碱的含量变化为指标,监控生产过程中不同混合时间、取样点中样品的成分变化情况,以验证确认混合终点。结果 经过大量的试验数据的统计、分析、验证,腰痛宁胶囊药粉在混合0.5 h已接近均匀,1 h时已经混合均匀并稳定,与近红外的光谱趋势相一致。结论 此方法简便、可靠,可以用于腰痛宁胶囊生产中混合均匀度的趋势分析,确定混合终点。     

近红外光谱法预测红参醇提过程中总皂苷的变化研究

目的应用近红外(NIR)光谱技术快速分析红参乙醇回流提取过程。方法采用比色法测定提取液样品的总皂苷质量浓度作为对照值,同时采集提取液样品的NIR光谱。运用正交信号校正算法消除光谱中的干扰信息,采用偏最小二乘回归法建立NIR光谱校正模型。结果NIR光谱校正模型能够准确地预测红参提取过程总皂苷质量浓度。结论NIR光谱技术可用于红参醇提过程快速分析。     

重组柞蚕抗菌肽AD的纯化及鉴定

目的从重组柞蚕抗菌肽AD毕赤酵母发酵液中分离纯化出抗菌肽纯品,并对其进行纯度、分子量和抗菌作用的鉴定。方法用离子交换和疏水层析法对发酵液中的重组柞蚕抗菌肽AD进行分离纯化,用高效液相色谱法分析产物的纯度,再用基质辅助激光解析—飞行时间质谱仪对产物进行分子量鉴定,并结合传统微量肉汤稀释法和流式细胞术分析重组柞蚕抗菌肽AD纯品对E.coli敏感株及耐药株的抗菌作用。结果重组柞蚕抗菌肽AD经离子交换和疏水层析纯化后的纯度达到98.40%,分子量为4068.15Da,与所设计的重组柞蚕抗菌肽AD大小相近。所纯化出的重组柞蚕抗菌肽AD对E.coli的敏感株ATCC25922和产β-内酰胺酶耐药株株ATCC35218的抗菌作用均为MIC 8μg/m L,而头孢他啶和氨苄西林对耐药株ATCC35218的MIC的值分别为8μg/m L和>32μg/m L。结论成功纯化分离出具有自主知识产权的重组柞蚕抗菌肽AD,其对E.coli敏感株和耐药株具有相同的抗菌效果。     

GC-MS法测定疏风活络丸中伪麻黄碱、麻黄碱、士的宁和马钱子碱的含量

目的:建立疏风活络丸中伪麻黄碱、麻黄碱、士的宁和马钱子碱含量的GC-MS测定方法。方法:采用Variancp-sil 8 CB Low bleed/MS毛细管柱(30m×250μm,0.25μm)分离,升温程序:起始温度50℃,保持1min,以25℃/min升至135℃,保持6min,以30℃/min升至300℃,保持22min。进样口温度为280℃;载气为He,恒流方式,柱流量为1mL/min,不分流进样1μL。MS采用EI离子源,离子源温度230℃;电子能量70 eV,传输管温度300℃,全扫描方式采集定性,质量范围40～450m/z;伪麻黄碱、麻黄碱采用总离子定量,士的宁和马钱子碱采用选择离子定量。结果:4种生物碱达到良好分离。方法平均回收率分别为伪麻黄碱97.82%(RSD2.70%)、麻黄碱98.76%(RSD3.23%)、士的宁98.00%(RSD2.18%)和马钱子碱98.19%(RSD1.89%)(n=6)。结论:所建立的方法可靠,能准确测定疏风活络丸中4种生物碱类的含量。     

微波辅助胶束萃取-高效液相色谱法同时测定平消片中马钱子碱、士的宁和柚皮苷的含量

目的 建立一种简便快速的微波辅助胶束萃取法,用于分离测定平消片中马钱子碱、士的宁和柚皮苷的含量.方法 试验以7%表面活性剂萃泽(Brij 35)为萃取溶剂,在微波功率300 W,液固比为100:1(mL/g)的条件下,萃取2 min.分析方法采用梯度洗脱,以乙腈-0.4%磷酸水溶液(三乙胺调pH值为3.0)为流动相,检...     

一种基于近红外的红参药材质量快速评价方法

目的应用近红外(NIR)光谱技术和化学计量学方法建立红参药材质量评价的新方法。方法对红参同时进行原料定性鉴别和水分含量检测。将样品NIR光谱同标准光谱库相比较，计算相似度匹配值。以传统的干燥失重法(LOD)为参照方法，应用相关光谱法进行波长选择和多重散射校正(MSC)方法进行光谱预处理，采用偏最小二乘(PLS)回归方法建立NIR光谱预测水分含量的校正模型。结果NIR光谱库可正确区别红参和伪品；最优PLS校正模型相关系数为0．9997。结论此方法快速、准确，可用于中药生产企业的原料药材质量控制。     

黄芪提取过程总皂苷质量浓度的在线监测

目的 利用近红外光谱分析技术对黄芪提取过程进行在线监测,实时反映药效成分的溶出信息。方法 利用远程光纤流通池在线采集黄芪提取过程中提取液的近红外光谱,同时采集提取液样品,利用HPLC-MS方法测得提取液中黄芪皂苷II、异黄芪皂苷II、黄芪皂苷I和黄芪甲苷4种成分的质量浓度作为对照值,利用偏最小二乘法建立4种成分及黄芪总皂苷的定量分析模型,将所建的黄芪总皂苷定量分析模型用于黄芪提取过程的在线分析,实时反映提取液中黄芪总皂苷的质量浓度信息。结果 黄芪提取液中4种皂苷的近红外定量分析模型相关系数分别达到0.987 6、0.964 0、0.857 1、0.981 6,黄芪总皂苷定量分析模型的相关系数为0.993 2,校正均方差（RMSEC）为5.94,内部交叉验证的相关系数为0.976 6,交叉验证均方差（RMSECV）为11.1。将黄芪总皂苷定量分析模型用于3个批次提取过程的在线监测,能够及时准确地反映提取液中黄芪总皂苷的质量浓度信息。结论 利用本实验所建立的方法,可以实现以黄芪总皂苷为检测指标,对黄芪提取过程的在线监测,为黄芪提取过程的终点判断和工艺优化提供参考。     

一种新的沙蚕纤溶酶的纯化、活性鉴定及部分分子特性

目的：从沙蚕Nereis virens的体腔液中纯化、鉴定出一种新的纤溶酶,并对其进行分子表征。方法：运用离子交换层析、凝胶过滤层析等常规色谱方法纯化蛋白酶,采用纤维蛋白板检测法鉴定纤溶活性及活性分布曲线,利用2D-电泳方法检测此纤溶酶的表观分子量和等电点,并检测多种蛋白酶抑制剂对其酶活性的影响,以确定此蛋白酶的类型。结果: 获取一种新的具有极强纤维蛋白水解活性的单链蛋白酶,其相对分子质量为29000,等电点为4.5,其蛋白水解活性在pH7.8和45℃时表现为最高,并能被二异丙基氟磷酸（DFP）和甲苯磺酚氟（PMSF）完全性抑制,确证其为一种典型的丝氨酸内肽酶。结论：Nereis virens的体腔液中存在一种纤溶活性极强的单链丝氨酸内肽酶,该纤溶酶对预防和治疗血栓性疾病具有一定的药用价值。     

重组胸腺素α1的分离纯化和活性测定

目的：利用融合表达载体pThioHisA的重组质粒pThioHisA-Tα1④,转化大肠杆菌TOP10得到的工程菌,来分离纯化表达的胸腺素α1（thymosin alpha1,Tα1),方法将高效表达融合蛋白的工程菌用菌胞破碎器裂解,经80℃热处理,离心上清采用Q－SepharoseFF阴离子交换色色谱纯化Tα1单体,应用SDS－PAGE,2L－Tricine-SDS-PAGE和HPLC进行鉴定。结果SDS－PAGE分析表明菌体表达的融合蛋白牛菌体总蛋白的400g.kg^-1,经2L－Tricine-SDS-PAGE分析证实,融合蛋白可裂解出Tα1单体,裂解物经简单的离子色谱可以纯化出Tα1单体,HPLC鉴定纯化的Tα1纯度可达950g.kg^-1以上,利用^3H-TdR进行的生物活性测定表明,在致有丝分裂原ConA存在的条件下,融合蛋白和Tα1单体均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力,与化学合成的Tα1相比具有相似的生活性。结论该方法是分离纯化Tα1简便易行,经济有效的方法,同时也为Tα1的分离纯化和大规模的开发生产奠定了基础。