干扰素和肿瘤坏死因子对人脐静脉内皮细胞表达HLA-Ⅱ类抗原的影响

采用cell-ELISA法对IFN-α、γ及rTNFα单独或协同影响人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表达HLA-Ⅱ类抗原作了定量观察。结果表明,IFNγ直接刺激 HUVEC可依浓度和时间依赖的方式提高其 HLA-Ⅱ类抗原表达量,而rTNFα、IFNα单独处理HUVEC无效。当rTNFα和IFNγ同时诱导时,对HUVEC表达HLA-DR、DP、DQ均表现抑制作用。但是,当先用IFNγ诱导HUVEC 24h后,再加入rTNFα则发现DR、DP、DQ的表达升高,起促进作用。     

bFGF促进内皮细胞β_1整合素表达及其意义探讨

目的 :观察碱性成纤维细胞生长因子对血管内皮细胞 β1整合素表达的影响。方法 :采用WesternBlot法结合图像处理分析 ,检测bFGF作用前后培养血管内皮细胞 β1整合素的表达。结果 :bFGF处理组和对照组平均灰度值分别为 16 6 11± 9 86和 175 32± 5 12 ,两组免疫酶显色有显著差异。结论 :bFGF能够诱导内皮细胞膜表面β1整合素合成增加。推测bFGF通过上调内皮细胞 β1整合素表达 ,可能在促进血管生成方面有重要作用。     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞产生促炎因子的调节作用

研究α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞产生促炎因子的调节作用,探讨α-MSH的抗炎与免疫调节机制。用不同浓度α-MSH处理ECV304细胞,或在LPS/TNF-α处理的同时加不同浓度的α-MSH培养ECV304细胞。用ELISA检测上清中TNF-α和IL-8,以Greiss法测定NO,RT-PCR检测组织因子(TF)mRNA,Westernblot检测TF蛋白表达。结果显示,α-MSH抑制ECV304细胞产生NO、TNF-α,但促进IL-8的释放。LPS或TNF-α能上调ECV304细胞表达TF mRNA,而α-MSH抑制这种上调作用,并抑制ECV304细胞表达TF蛋白。上述结果提示α-MSH可通过调节血管内皮细胞表达促炎因子而发挥抗炎和免疫调节作用。     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞产生促炎因子的调节作用

研究α-黑色素细胞刺激素（α—MSH）对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞产生促炎因子的调节作用，探讨α—MSH的抗炎与免疫调节机制。用不同浓度α—MSH处理ECV304细胞，或在LPs／TNF-α处理的同时加不同浓度的α—MSH培养ECV304细胞。用ELISA检测上清中TNF-α和IL-8，以Greiss法测定NO，RT-PCR检测组织因子（TF）mRNA，Western blot检测TF蛋白表达。结果显示，α-MSH抑制ECV304细胞产生NO、TNF-α，但促进IL-8的释放。LPS或TNF-α能上调ECV304细胞表达TFmRNA，而α—MSH抑制这种上调作用，并抑制ECV304细胞表达TF蛋白。上述结果提示α—MsH可通过调节血管内皮细胞表达促炎因子而发挥抗炎和免疫调节作用。     

葡萄糖胺对TNF-α诱导的血管内皮细胞VCAM-1表达的影响

目的探讨葡萄糖胺对肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)诱导的人脐带血管内皮细胞(HUVEC)血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule,VCAM-1)表达的影响。方法实时逆转录聚合酶链式反应(Real time RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)分别测定葡萄糖胺对VCAM-1的表达情况;Western blot法测定HUVEC核因子-κB(nuclear factor,NF-κB)磷酸化程度。结果葡萄糖胺抑制TNF-α诱导的VCAM-1在HUVEC的表达;NF-κB抑制剂BMS-345541抑制TNF-α诱导的VCAM-1的表达;葡萄糖胺抑制TNF-α诱导的NF-κB的磷酸化。结论葡萄糖胺抑制TNF-α诱导的VCAM-1的表达与抑制NF-κB的活化相关。     

ICAP1a及突变体T38A、1138A在内皮细胞ECV304整合素β1内化中的作用

目的:探讨ICAP1α及突变体T38A、I138A在内皮细胞ECV304内化整合素β1中的作用和机制.方法:构建pAAV-ICAP1α及其突变体pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表达载体,转染ECV304.ECV304分为ICAP1α组、T38A组、I138A组、绿色荧光蛋白(GFP)组和未转染组,用NHS-SS-Biotin标记整合素β1,并利用生物素-亲和素系统以及Western blot检测整合素β1内化情况.结果:各组细胞转染的质粒均稳定表达;Western blot检测ICAP1α组,T38A组、I138A组、GFP组、未转染组内化的整合素β1相对光密度值分别为1.07±0.04、0.68±0.06、0.70±0.02、0.87±0.06、0.88±0.04;与GFP组和未转染组比较,ICAP1α组整合素β1内化明显增多(P<0.05);与GFP组、未转染组和ICAP1α组比较,T38A组和I138A组整合素β1内化明显减少(P<0.05),GFP组与未转染组无差别(P＞0.05).结论:转染ICAP1α后内皮细胞ECV304表面整合素β1内化增加,而转染T38A和I138A后内皮细胞ECV304表面整合素β1内化减少;ICAP1α可能通过第38位的苏氨酸残基(38Tyr)和第138位的异亮氨酸残基(138Ile)调控整合素β1的内化.     

整合素α_4β_1及其配体与大鼠肝肿瘤周边肥大细胞募集的关系

目的 :研究整合素α4 β1(VLA 4)及其配体VCAM 1(vascularcelladhesionmolecular 1)和FN(fibronectin)与肝肿瘤周边肥大细胞 (mastcell,MC)募集的关系。方法 :根据肝肿瘤周边肥大细胞数量 ,将 18只雄性Wistar大鼠移植肝肿瘤模型进行分组 ,8只正常雄性Wistar大鼠作对照。用间接免疫荧光和流式细胞术检测各组大鼠腹腔肥大细胞整合素VLA 4分子的表达水平 ,同时用免疫组化研究肿瘤周边肝组织血管内皮细胞和肝窦内皮细胞表面VCAM 1和肿瘤周边FN的表达。结果 :不同肝肿瘤大鼠肿瘤周边浸润肥大细胞数量有明显差异。各组大鼠腹腔MC表达整合素VLA 4分子均呈阳性 ,肿瘤周边肥大细胞浸润较多组 ,其整合素α4 β1表达水平也较高。肿瘤周边血管内皮和窦内皮细胞表达VCAM 1阳性。肿瘤周边沉积大量呈阳性表达的FN与肥大细胞紧密相联。结论 :整合素α4 β1及其配体VCAM 1和FN在肝肿瘤周边肥大细胞募集中起重要作用 ;整合素α4 β1的表达水平与肿瘤周边MC数呈平行关系     

ICAP1α及突变体T38A、I138A在内皮细胞ECV304整合素β1内化中的作用

目的:探讨ICAP1α及突变体T38A、I138A在内皮细胞ECV304内化整合素β1中的作用和机制。方法:构建pAAV-ICAP1α及其突变体pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表达载体,转染ECV304。ECV304分为ICAP1α组、T38A组、I138A组、绿色荧光蛋白(GFP)组和未转染组,用NHS-SS-Biotin标记整合素β1,并利用生物素-亲和素系统以及Westernblot检测整合素β1内化情况。结果:各组细胞转染的质粒均稳定表达;Westernblot检测ICAP1α组、T38A组、I138A组、GFP组、未转染组内化的整合素β1相对光密度值分别为1.07±0.04、0.68±0.06、0.70±0.02、0.87±0.06、0.88±0.04;与GFP组和未转染组比较,ICAP1α组整合素β1内化明显增多(P<0.05);与GFP组、未转染组和ICAP1α组比较,T38A组和I138A组整合素β1内化明显减少(P<0.05),GFP组与未转染组无差别(P>0.05)。结论:转染ICAP1α后内皮细胞ECV304表面整合素β1内化增加,而转染T38A和I138A后内皮细胞ECV304表面整合素β1内化减少;ICAP1α可能通过第38位的苏氨酸残基(38Tyr)和第138位的异亮氨酸残基(138Ile)调控整合素β1的内化。     

粘附分子在过敏性紫癜患者血管内皮细胞中的作用探讨

目的：探讨粘附分子在过敏性紫癜血管炎性损伤中的作用及可能的调节机制。方法：建立人脐静脉内皮细胞（human umbilical veins endothelial cell，HUVEC）体外培养模型，ELISA双抗体夹心法检测过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞（PBMC）培养上清液炎性细胞因子IL-6、TNF-α的含量。采用流式细胞仪间接荧光免疫法检测PBMC及其所诱导的HUVEC粘附分子的表达；MTT生物活性检测法测定PBMC与HUVEC间的粘附率。结果：过敏性紫癜患儿PBMC及其培养上清可诱导内皮细胞表面粘附分子表达明显增强，PBMC与内皮细胞间的粘附率明显提高，上述粘附作用可被抗粘附分子抗体明显阻断。同时IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性细胞因在过敏性紫癜患儿外周血中异常升高，用抗细胞因子的单克隆抗体可明显阻滞过敏性紫癜患儿外周血免疫活性细胞及其所诱导的局部血管内皮细胞上粘附分子的表达和内皮细胞与PBMC间相互粘附作用。结果：（1）粘附分子通过介导全身循环中的免疫效应细胞粘附于血管内皮细胞，在过敏性紫癜血管损伤的病理生理机制中起重要作用。（2）IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子可能作为过敏性紫癜血管损伤的重要环节，在诱生免疫活性细胞及血管内皮细胞多种粘附分子的表达、介导免疫活性细胞向血管局部聚集及进一步向血管深层浸润最终导致内皮细胞损伤中起重要作用。     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞与U937细胞黏附作用的影响

研究α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞黏附作用的影响,以探讨α-MSH的抗炎与免疫调节机制。以U937细胞与ECV304细胞相互黏附作为实验模型,观察LPS或TNF-α刺激ECV304细胞,以及α-MSH干预后,对U937细胞黏附于ECV304细胞的影响。用不同浓度α-MSH处理ECV304细胞,或在LPS/TNF-α处理的同时加不同浓度的α-MSH培养ECV304细胞,以FACS检测ICAM-1,RT-PCR检测骨桥蛋白(OPN)mRNA,Westernblot检测OPN蛋白表达。结果显示,LPS或TNF-α处理ECV304细胞可增加ECV304细胞与U937细胞的黏附,而α-MSH降低这种黏附作用。α-MSH抑制ECV304细胞表达ICAM-1和OPN蛋白;LPS或TNF-α刺激后,ECV304细胞表达OPN mRNA上调,而α-MSH能抑制LPS或TNF-α的上调作用。这些结果提示,α-MSH可通过降低ICAM-1和OPN的表达抑制炎症时血管内皮细胞与白细胞的黏附。     

α4整合素及其配体的分子结构和功能

整合素(Integrin)分子由α和β两个亚基组成,α4整合素有α4β1和α4β7两种,它们的配体分别是VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)和MAdCAM-1(mucosal adressin cell ad-hesion molecule-1)。α4整合素及其配体通过介导淋巴细胞与内皮细胞的相互作用,参与了多种生理和病理过程。抗α4的单克隆抗体(mAb),已成功地用于治疗和预防实验诱导的一些疾病。     

阿魏酸钠对TNF-α致内皮细胞NF-κB和ICAM-1表达的影响

目的 :探讨阿魏酸钠对TNF α致内皮细胞NF κB和ICAM 1表达的影响及可能机制。方法 :通过免疫组化技术观察阿魏酸钠对TNF α对培养内皮细胞 (ECV30 4)的NF κB和ICAM 1表达的影响。结果 :TNF α能使细胞核内NF κB及细胞表面ICAM 1表达明显增高 ,阿魏酸钠和TNF α共同作用后 ,可使内皮细胞核内NF κB及细胞表面ICAM 1表达显著降低。结论 :阿魏酸钠可显著减轻TNF α所致内皮细胞的损害 ,其机理可能与抑制内皮细胞NF κB活化 ,减少ICAM 1表达有关。     

静脉表型分子COUP-TFⅡ表达降低对血管内皮细胞衰老的影响

目的:观察静脉表型分子鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)表达对血管内皮细胞衰老的影响和分子机制。方法:通过RT-qPCR检测比较人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中COUP-TFⅡ的表达情况。使用10~(-5)mol/L血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导HUVEC衰老,通过COUP-TFⅡ特异性小干扰RNA(siCOUP-TFⅡ)转染HUVEC使其COUP-TFⅡ的表达降低,利用β-半乳糖苷酶染色、Western blot、CCK-8、细胞计数等方法分别观察siCOUP-TFⅡ对AngⅡ诱导的血管内皮细胞衰老及增殖的影响,通过Western blot检测Akt信号分子的表达变化。结果:与HCAEC相比,HUVEC中COUP-TFⅡ呈显著高表达;用siCOUP-TFⅡ抑制HUVEC的COUP-TFⅡ表达时,能显著促进AngⅡ诱导的内皮细胞衰老并抑制内皮细胞增殖和p-Akt蛋白水平;加入Akt激动剂SC79(4 mg/L)能够部分逆转siCOUP-TFⅡ对AngⅡ诱导的HUVEC衰老和增殖的影响。结论:COUP-TFⅡ表达降低可促进血管内皮细胞衰老并抑制内皮细胞增殖,其机制可能与调节Akt信号有关。     

人整合素β3亚基真核表达载体的构建及αIIbβ3在细胞表面的表达

目的 :构建人整合素 β3亚基真核表达载体 ,并探讨如何使人整合素αIIbβ3在CHO细胞表面有效表达 ,为进一步研究整合素β3亚基作为汉坦病毒 (hantavirus,HV)受体的特异性奠定基础。方法 :构建编码人整合素 β3真核表达载体 pcDNA3.1 β3。将其与编码人整合素αIIb亚基真核表达载体 ,分别及共转染至中国仓鼠卵巢 (Chinahamsterovary ,CHO)细胞中进行表达。采用间接免疫荧光法 (IFA)检测外源基因的表达。结果 :共转染组目的蛋白呈高效的细胞膜表达。pcDNA3.1 β3单独转染组 β3亚基在细胞膜的表达较共转染组弱 ;而pBJ1 αIIb单独转染组则未见有效的细胞膜表达。结论 :人整合素αIIbβ3在CHO细胞表面的有效表达需要两个亚基共同参与。     

阿魏酸钠对肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞NOS基因表达的影响

目的 :探讨阿魏酸钠 (SF)在人脐静脉内皮细胞中对内皮型一氧化氮合酶 (ecNOS)和诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)基因表达的影响。方法 :常规培养人脐静脉内皮细胞 (ECV3 0 4) ,分成 5组 :①正常对照组 ,常规培养 ;②肿瘤坏死因子 α(TNF α)Ⅰ组 ,培养液中加入TNF α10 0 0u/ml作用 30min ;③TNF αⅡ组 ,培养液中加入TNF α 10 0 0u/ml作用 6h ;④SF +TNF αⅠ组 ,培养液中先加入SF 1mg/ml孵育 1h ,再加入TNF α 10 0 0u/ml作用 30min ;⑤SF +TNF αⅡ组 ,培养液中先加入SF 1mg/ml孵育 1h ,再加入TNF α 10 0 0u/ml作用 6h。采用原位杂交法检测iNOS和ecNOS的mRNA表达 ,扫描电镜观察细胞形态变化。结果 :①TNF α使内皮细胞iNOSmRNA表达增高而ecNOSmRNA表达降低 ;电镜下内皮细胞破坏较明显 ,细胞皱缩 ,微绒毛断裂 ,分布不规则。以上改变又以 6h为著。②将SF与TNF α共同作用于内皮细胞使内皮细胞iNOSmRNA表达下降 ,ecNOSmRNA表达增高 ;电镜下内皮细胞破坏轻微。结论 :TNF α诱导内皮细胞iNOSmRNA表达增高 ,ecNOSmRNA表达抑制。而SF使内皮细胞iNOSmRNA表达下降 ,ecNOSmRNA表达增高 ,这可能是SF抗动脉粥样硬化 ,抗炎症损伤的机理之一     

抗人整合素β3亚基单克隆抗体的制备及其抗肿瘤活性的研究

目的制备抗人整合素β3亚基的单克隆抗体(mAb),研究其对肿瘤治疗的作用。方法用RT-PCR方法扩增人β3胞膜外基因,将其克隆至原核表达载体pQE30中,获得含β3胞膜外基因的高效表达载体pQE30-β3,将其转化大肠杆菌M15,通过诱导表达及纯化,获得β3蛋白。将此蛋白免疫BALB/c小鼠,应用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗β3亚基mAb,Western blot鉴定mAb的特异性。通过小鼠体内抑制黑色素瘤生长实验筛选出具有抑制肿瘤生长作用的mAb。进一步用MTT法及流式细胞术观察该mAb体外抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及诱导其凋亡的作用。结果扩增获得了β3胞膜外基因,构建了β3蛋白的原核表达载体,表达纯化了β3蛋白,成功制备了8株mAb,Western blot证明了其特异性。经过体内抑瘤实验筛选出一株具有显著抑制肿瘤生长的mAb4F12。该mAb可抑制HUVEC细胞增殖并诱导其凋亡。结论成功表达了β3蛋白,并制备了有活性的mAb,抗体具有抑制肿瘤生长的作用,这可能是通过抑制血管内皮细胞的增殖和诱发凋亡实现的。     

整合素α4β1及其配体与大鼠肝肿瘤周边肥大细胞募集的关系

目的：D整合素α4β1(VLA-4)主其配体VCAM－1（vascular cell adhesion molecular-1)和FN（fibronectin)与肝肿瘤周边肥大细胞（mast cell,MC)募集的关系。方法：根据肝肿瘤周边肥大细胞数量,将18只雄性Wistar大鼠移植肝肿瘤模型进行分析,8只正常雄性Wistar大鼠作对照,用间接免疫荧光和流式细胞术检测各级一大鼠腹腔肥大细胞整合素VLA－4分子的表达水平,同时用免疫组化研究肿瘤周边肝组织血管内皮细胞和肝窦内皮细胞表面VCAM－1和肿瘤周边FN的表达。结果：不同肝肿瘤大鼠肿瘤周边浸润肥大细胞数量有明显差异。各组大鼠腹腔MC表达整合素VLA－4分子均呈阳性,肿瘤周边肥大细胞浸润较多组,其整合素α4β1表达水平也较高。肿瘤周边血管内皮和窦内皮细胞表达VCAM－1阳性。肿瘤周边沉积大量呈阳性表达的FN与须大细胞紧密相联。结论：整合素α4β1及其配体VCAM－1和FN在肝肿瘤周边肥大细胞集要作用;整合素α4β1的表达水平与肿瘤周边MC数呈平行关系。     

bFGF促进内皮细胞在聚氨酯材料上黏附的机理探讨

b FGF能够促进内皮细胞在人工聚氨酯材料上的黏附 ,但其分子机制尚不清楚。本文采用 Western Blot结合图像处理分析方法 ,观察了 b FGF对血管内皮细胞 β1整合素表达的影响 ,结果显示 b FGF处理组和对照组平均灰度值分别为 16 6 .11± 9.86和 175 .32± 5 .12 ,两组免疫酶显色有明显差异 ,表明 b FGF能够诱导内皮细胞膜表面 β1整合素合成增加。我们推测 b FGF通过上调内皮细胞 β1整合素表达 ,增强了内皮细胞在聚氨酯材料上的黏附。本文提示 b FGF是实现人工心、血管内皮细胞化的一种有效辅助因素     

霉酚酸酯对血管内皮细胞与淋巴细胞粘附及其表达CD40L的影响

目的：观察霉酚酸酯（MMF）对细胞因子刺激下人脐静脉内皮细胞（mWEC）CD40L的影响。方法：正常分娩人脐带经胶原酶消化后，分离出内皮细胞，培养至3～5代，用于细胞粘附和CIMOL表达试验。以TNF-α和／或霉酚酸（船A）处理HUVEC 20小时后，用虎红法研究对淋巴细胞与内皮细胞粘附作用。以TNF-α、rIFN-γ、LPS分别和MPA同时作用HUVEC 24小时。加不同浓度的MPA与LPS诱导HUVEC 24小时，用Cell-ELISA检测CIMOL的表达。结果：（1）MMF能抑制静息及TNF-α激活的内皮细胞与淋巴细胞间的粘附作用。（2）三种细胞因子均可明显诱导内皮细胞表达CD40L分子。（3）MMF不能抑制静息状态下内皮细胞CD40L的表达，但抑制TNF-α、rIFN-γ和LPS诱导CIMOL的表达作用，且MMF抑制LPS诱导的内皮细胞CD40L表达呈剂量依赖效应。结论：MMF通过抑制内皮细胞表达CIMOL而影响淋巴细胞与内皮细胞的相互作用，这可能是MMF抗排斥反应机制之一。     

肺炎支原体膜脂蛋白诱导ECV304细胞表达mICAM-1的研究

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)除引起原发性非典型性肺炎、支气管炎等呼吸道疾病外，亦可引起其他多系统、多器官的肺外并发症，如脑膜脑炎、心肌炎、免疫性溶血性贫血及肾炎等。研究证实，许多支原体的膜脂蛋白在体外具有诱导人单核／巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β的能力，而TNF-α、IL-1β可以使血管内皮细胞mICAM-1的表达水平增加促进炎症细胞的黏附引起局部炎症反应。本实验以人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞为靶细胞，观察肺炎支原体膜脂蛋白(Mp-LAMP)诱导ECV304细胞表达膜结合型细胞间黏附分子-1(mICAM-1)的水平，探讨Mp感染所致的炎性反应机制。