血管内皮细胞与平滑肌细胞复合构建组织工程人工血管的实验研究

目的：构建既具有活性血管平滑肌细胞（VSMC）中膜层，又有血管内皮细胞（VEC）内皮化的复层结构组织工程血管支架材料。方法（1）将聚羟基乙俊（PGA）纤维无纺网，VSMC和胶原纤维相混合，设计构建VSMC活性的组织工程血支架材料。（2）采用酶消化法从兔主动脉中分离培养兔VEC并传代，纯化，接种于组织工程人工血管支架的内腔，体外培养，并行电镜观察。结果：构建的支架材料具有一定弹性和韧性，VEC在其内表达形成较完整内皮细胞层，且VSMC能够保持活性，生长状况良好。结论：经胶原包埋处理的PGA支架可作为组织工程化人工血管研究较理想支架材料，为组织工程方法构建具有分层结构的组织工程血管奠定实验基础     

组织工程血管模型体外构建的实验研究

目的：在体外环境下，探索构建分别含内皮细胞，平滑肌细胞及成纤维细胞的三层结构的组织工程化血管，三种细胞相互作用，相互支持，形成一个在形态和功能与正常血管近似的组织工程化血管。方法：通过用胶原分别包埋处理的三个管径大小不同，但能相互嵌套的聚羟基乙酸（PGA）管形支架，并种植人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞，人成纤维细胞进行三维立体生长培养，观察细胞生长分化情况。采用酶消化法和组织块法分离培养人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞，人成纤维细胞并传代，纯化，将聚羟基乙酸（PGA）无纺网用胶原溶液包埋，真空冷冻干燥，形成多孔状PGA＋胶原管型支架；接种3代－7代人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞及人成纤维细胞与其内腔面，采用动脉旋转培养技术体外培养3周，行扫描电镜观察。结果：构建后的血管模型，层与层结构紧密，内皮细胞，平滑肌细胞及成纤维细胞分泌细胞外基质，相互进行物质交换，类似于生理条件。结论：该支架具有一定弹性和韧性，在培养液中，能较长时间保持形状。此方法的进一步应用组织工程方法构筑具有分层结构的人造血管打下基础。     

组织工程人工血管支架的预构

目的：探讨具有血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）活性的组织工程人工血管支架的构建方法。方法：①将聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA）纤维无纺网支架材料、血管平滑肌细胞和胶原纤维相混合，构建组织工程血管。②将VSMCs置入胶原凝胶中，观察VSMCs的生长状况。③观察VSMCs胶原悬液滴入该支架材料中的生长。结果：①VSMCs在胶原凝胶中的位置固定，分布于不同层次，约3－4h逐渐形成多个胞质突起。随时间推移，胞质突起继续伸展，部分细胞呈梭形、纺锤形。②VSMCs胶原悬液滴入胶原包埋处理的PGA支架中后，大部分细胞随胶原凝胶状态的形成，滞留于支架材料网孔中，细胞可沿PGA纤维表面生长。结论：胶原包埋处理的PGA纤维无纺网是良好的携带VSMCs的多孔生物降解材料。     

兔血管平滑肌细胞和聚羟基丁酯(PHB)的细胞相容性实验研究

目的：探索血管平滑肌细胞和新型可降解材料聚羟基丁酯（PHB）的细胞相容性，为组织工程血管的构建寻找理想的支架材料。方法：将组织块法体上培养与兔血管平滑肌细胞种植在PHB膜片和PHB三维微孔支架上，在相差显微镜下观察细胞的粘附和生长情况。用MTT法测定细胞粘附率和细胞增殖指数，复合培养7天后进行扫描电镜观察并用流式细胞仪（FCM）的测定细胞周期，DNA指数。结果：兔血管平滑肌细胞在PHB膜片上粘附率为77％，细胞增殖符合细胞的生长曲线，在PHB三维微孔支架上生长情况良好，并被证实为二倍体细胞。结论：兔血管平滑肌细胞和聚羟基丁酯（PHB）的细胞相容性较好，但细胞与材料间的粘附有待进一步改善。     

含内皮祖细胞的组织工程皮肤体外构建及裸鼠移植研究

目的构建含内皮祖细胞（EPC）和成纤维细胞的组织工程复合皮，初步研究EPC在组织工程皮肤移植中促血管发生的作用。方法采用免疫磁珠法从人脐血中分离培养CD133＋血管内皮祖细胞，以聚羟基乙酸（PGA）为真皮基质，接种EPC和成纤维细胞，其上覆盖表皮细胞膜片，构建组织工程复合皮，覆盖裸鼠背部全层皮肤缺损创面。结果EPC和成纤维细胞能均匀贴附于PGA支架纤维材料上，并逐渐伸展为梭形或多极状。裸鼠移植实验表职，实验组创面愈合早于对照组，可见EPC参与大量新生小血管形成，真皮支架5周完全降解。结论EPC参与血管重建，具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。应用PGA＋纤维蛋白凝胶，制备含EPC和成纤维细胞的活性真皮替代物，具有良好的生物相容性、降解特性。     

人脐血内皮祖细胞体内促进血管重建的实验研究

目的：通过观察人脐血内皮祖细胞（EPC）在裸鼠体内缺氧状态下分化成内皮细胞的现象，初步研究其促进血管重建的作用。方法：根据EPC表面标记CD133，采用免疫磁珠法分离培养EPC。设计EPC裸鼠成瘤实验，观察瘤体内血管增生情况；将荧光标记的EPC注射于裸鼠腹部皮瓣中，观察EPC参与皮瓣血管重建情况；将EPC接种于聚羟基乙酸（PGA）中，移植于裸鼠皮下，观察EPC参与血管重建。结果：原代EPC贴壁后呈梭形，从第7天开始数量明显增加，呈克隆状生长。透射电镜观察到成熟内皮细胞最具特征性的细胞器——weibel-Palade小体。裸鼠成瘤实验：抗人vWF免疫荧光显示大量EPC参与肿瘤血管生成；裸鼠皮瓣实验：荧光标记EPC参与裸鼠皮瓣血管生成；PGA移植实验：抗人vWF免疫酶组织化学染色显示EPC参与血管生成。结论：EPC参与血管重建，具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。     

组织工程小血管摩擦力测量方法的研究与应用

目的设计一套用于组织工程小血管内壁摩擦力测量的装置并对组织工程血管的材料进行初步的测量,以验证装置的可靠性和相关结论。方法根据血液动力学的原理,对血管的力学模型进行分析,确定组织工程血管内皮细胞摩擦力的测量方法,从而设计完成整套装置并对弹性元件进行测量,并进行组织工程降解材料聚羟基乙酸PGA构成的管状支架进行摩擦力的测量。结果设计完成了测量组织工程血管内壁摩擦力的实验装置,弹性元件的牵拉力与位移的关系呈良好的线性关系。聚羟基乙酸PGA管状支架的摩擦力随流速的增加而增加。结论测量组织工程血管内壁摩擦力的实验装置是可行的,聚羟基乙酸PGA管状支架的摩擦力与流速基本呈现线性关系。     

新型聚β-羟基丁酯作为血管组织工程支架材料的实验研究

目的：探讨经改性处理后的可降解生物材料聚β-羟基丁酯(PHB)作为血管组织工程支架材料与血管平滑肌细胞的细胞相容性。方法：采用体外培养的免血管平滑肌细胞接种在经胶原包埋处理后的管型PHB支架材料上，用相差显微镜和扫描电镜观察细胞的粘附和生长情况，并行HE染色观察。结果：免血管平滑肌细胞在改性后的管型PHB支架材料上粘附生长良好，扫描电镜下可见细胞生长融合成片状，HE染色示细胞在PHB材料上生长良好。结论：改性后的聚β-羟基丁酯材料与兔血管平滑肌细胞有较好的生物相容性。     

血管化组织工程肝小块构建的研究

目的 利用组织工程方法和原理初步构建血管化肝小块组织。方法 肝细胞和肝窦内皮细胞取自小鼠肝脏。采用内管网高分子聚酯类聚合物（PLGA）材料作为支架。肝窦内皮细胞接种在内管网PLGA支架管道的内壁使之在体外预内皮化。肝细胞与纤维蛋白原混合制成肝细胞／纤维蛋白原混合液，接种在喷洒有凝血酶的预内皮化的内管网支架上。构建的复合物分别植于小鼠肠系膜部位（A组）和肝组织表面（B组）．2周后将支架取出观察，比较不同部位的植入效果。结果 支架体外预血管化后，其管道内可见内皮细胞均匀贴壁；体内植入后内皮细胞优势生长；A组小鼠肠系膜间支架中有血管长入，但未见有肝细胞留存；B组可见支架内有少量肝细胞团，并有血管长入。结论 简易PLGA内管网多孔支架可以用于肝组织小块的构建．而肝组织表面更适合组织工程肝小块的体内植入。     

成骨细胞与生物衍生材料联合培养的实验研究

目的：探讨冻干脱钙骨基质（FDBM）作为组织工程骨支架的可行性。方法：取兔颅骨外膜的成骨细胞，经传代培养后作为种子细胞与FDBM于体外联合培养，通过对复合物相差显微镜、光镜及扫描电镜等观察，了解细胞在材料中的生长情况。结果：经系统处理后的FDBM呈现不规则的网－孔结构，其孔隙直径为100－400μm ,孔隙率为70％。体外复合培养8小时，成骨细胞即开始贴附于FDBM网架上；复合培养7天，分布于支架材料上的成骨细胞迅速分化增殖，分泌细胞外基质并形成钙结节。结论：FDBM可作为构建组织工程骨的一种较好支架材料。     

采用组织工程方法体外构建血管模型的初步实验研究

目的　探索体外构建组织工程化人工血管的可行性。方法　通过酶消化法分离牛主动脉血管内皮细胞,培养、传代,纯化。采用交联胶原包埋处理聚羟基乙酸纤维无纺网(PGA),将第3～7代血管内皮细胞接种于上述材料上,通过特制的旋转装置,缓慢动态旋转培养10天,使内皮细胞在管腔内表面附着生长,扫描电镜观察,采用6-酮-前列腺素-1α放射免疫测试药盒测定管形材料中内皮细胞释放前列环素量。结果　培养血管内皮细胞VIII因子相关抗原抗体染色呈阳性,内皮细胞在管腔内表面贴附良好,细胞之间融合成片,经10天培养,形成较完整内膜层,覆盖率为(91.2±1.5)%,前列环素生成率为（4.6±0.5）μg/cm     

组织工程技术构建小口径血管的实验研究

目的 探讨运用组织工程技术构建血管组织的方法。方法 将体外培养、扩增的新生婴儿脐静脉血管内皮细胞与平滑肌细胞接种于片状聚羟基乙酸材料上,形成细胞-材料复合物,将该复合物包绕于硅胶管使成管状结构后移植于裸鼠皮下,第2及第6周后行大体及组织学检测。结果 组织工程技术构建的血管组织大体结构与天然血管相似,免疫组化显示组织工程化血管最内层有Ⅷ因子阳性细胞覆盖,管壁内有大量细胞外基质及散在的α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞存在。结论 运用组织工程技术可形成具有与正常血管组织学结构相似的血管。     

组织工程学方法体外构建血管的研究

目的 探讨用组织工程学方法构建血管的可行性。方法 实验组：将体外培养、扩增的人脐带动脉平滑肌细胞与用可降解的生物材料聚乙醇酸(PGA)制成的管状结构结合，体外培养1周后植入裸鼠背部皮下。分别于2、4、5、6、11周取材进行大体及组织学检测；对照组：将没有细胞的单纯管状PGA植入裸鼠背部皮下，于相同时间点进行检测。结果 实验组在观测点均形成一内壁光滑的管状结构，组织学检测表明，该结构随观测时间的延长组织学成分也有明显的变化，从开始以PGA为主向平滑肌细胞及其分泌的胶原为主要成分过渡。而对照组则随着PGA的降解管状结构逐渐丧失。结论 组织工程学方法可形成具有一定张力及组织成分的管状结构。该方法用于构建血管是可行的。     

两种支架材料与颌下腺细胞体外复合培养的比较研究

目的将颌下腺细胞分别与颌下腺脱细胞基质(SGAM)生物衍生材料及胶原海绵体外复合培养,比较两种不同支架材料的生物相容性。方法用传代培养第2代的颌下腺细胞分别与SGAM生物衍生材料及胶原海绵体外复合培养,在一定时间通过扫描电镜观察细胞在不同支架材料上的生长情况。结果颌下腺细胞在SGAM生物衍生支架材料上,多数附着在支架材料的孔隙内或其边缘,数量较多,大小不等,形态各异,表面凸凹不平,突起丰富;表面结构似“银耳”状。而细胞在胶原海绵支架材料上大多附着在材料表面,数量较少,突起较少。结论颌下腺脱细胞基质支架材料与胶原海绵支架材料相比具有良好的生物相容性,是一种较为理想的颌下腺组织工程用支架材料。     

复合可降解基质膜片制备及血管内皮细胞在其吸附生长的实验研究

目的　制备几种复合可降解基质膜片 ,观察血管内皮细胞在其上的生长情况。方法　用胶原酶消化法分离牛主动脉血管内皮细胞 (VEC) ,另采用两步盐析法提取牛骨 型胶原。将交联胶原包埋处理聚羟基乙酸 (PGA)、聚乳酸 (PL A)及聚β羟基丁酸 (PHB)形成可降解基质材料膜片 ,并接种牛 VEC,采用 MTT法比较 VEC在几种可降解基质材料膜片的生长情况。结果　胶原、PGA/胶原、PL A/胶原膜质地均匀柔韧 ,固定成形 ,具有一定弹性和吸水性 ;MTT比色实验表明 VEC在胶原、PGA/胶原、PL A/胶原上均生长良好 ,优于 PHB/胶原组。尤以 PGA/胶原所形成的基质材料固定成形 ,弹性和韧性好 ,VEC在其上贴附生长良好。结论　通过生物材料与人工可降解材料有机结合 ,PGA/胶原物理性能互补 ,是组织工程再造血管较理想的基质材料之一。     

胶原-透明质酸支架的制备及其与软骨细胞复合培养的实验研究

目的制备胶原-透明质酸支架,评价其与兔髁状突软骨细胞的生物相容性,探讨其应用于关节软骨组织工程的可行性。方法冷冻干燥法制备胶原-透明质酸复合多孔海绵支架材料,将其与碳化二亚胺[1-ethyl-3-（3-dimethyl aminopropyl）carbodiimide,EDC]进行化学交联。分别采用体积法和体外酶解实验测定支架材料孔隙率和降解率,扫描电镜观察交联前后支架材料的形态变化。取3周龄新西兰兔髁状突软骨细胞,体外培养5d后,甲苯胺蓝染色,倒置相差显微镜下观察行细胞鉴定。取消化后第2代软骨细胞接种至支架材料复合培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。复合培养1、3、5、7和10d后,PBS液清洗3次,置入24孔板并以0.25%胰酶和0.1%EDTA消化细胞,采集细胞进行细胞计数并绘制细胞生长曲线。另取部分样本继续培养5d,行组织学和扫描电镜观察。结果胶原-透明质酸支架材料经化学交联后,具有合适的三维多孔结构,孔隙率为83.7%,孔径100-120μm;交联后抗酶解能力显著增加。髁状突软骨细胞在其表面和内部贴附良好,形成细胞-材料复合体,细胞增殖实验显示,复合培养1d,材料中细胞数为3.7×104/支架,10d后增至8.2×104/支架。电镜观察见细胞周围有基质分泌。结论EDC交联后的胶原-透明质酸支架具有良好空间结构和生物相容性,可作为支架材料用于髁状突软骨组织工程的研究。     

兔骨髓间质干细胞修复肌腱缺损效果观察

目的　观察兔骨髓间质干细胞(MSCs)修复肌腱缺损的效果。　方法　分离培养家兔MSCs,检测CD44mRNA进行鉴定。6只家兔分为实验组和对照组,每组3只。在兔跟腱处造成3cm长的缺损,实验组家兔以自体MSCs为种子细胞、以胶原聚羟基乙酸(PGA)为生物支架构建肌腱并移植于跟腱缺损处,对照组家兔仅以PGA生物支架修复跟腱缺损。于术后4、8、12周对移植部位进行大体和组织学观察。　结果　MSCs培养11d时CD44mRNA显示阳性。实验组术后8周肉眼可见移植处形成腱样组织, 12周时组织学观察可见形态一致、顺应力学方向排列于胶原中的腱样细胞,类似正常肌腱组织。对照组所形成的新生组织较实验组细小且与周围组织粘连, 12周时组织学观察见细胞排列紊乱,胶原纤维呈松散网丝状。　结论　应用组织工程技术以自体MSCs修复肌腱缺损具有可行性。