尼古丁对大鼠骨髓间充质干细胞软骨分化的干预作用研究

目的 从细胞水平证实尼古丁对大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化为软骨细胞的干预作用.方法 大鼠BMSCs传代至第3代,以海藻酸钠微球生物支架进行BMSCs三维培养.加入转化生长因子β1(TGF-β1)进行诱导分化,在细胞分化过程中,分别给予0.1、1、10、100μmol/L尼古丁干预,设对照组.第28天收获细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞代谢活力、阿利新蓝特殊染色检测细胞中氨基葡聚糖的含量、实时荧光定量PCR检测软骨分化标志基因(COL2A1、Aggrecan、COL1A1、COL10A1)的表达情况.结果 诱导培养28 d后,MTT法结果示不同浓度尼古丁干预后的各组细胞代谢活力与对照组细胞相比,没有明显改变;当尼古丁作用浓度分别为0、0.1、1、10和100μmol/L时,其BMSCs海藻酸钠微球的阳性染色区域占切片的百分比分别为90.1％、76.5％、64.8％、44.1％、4.5％;与对照组比较,尼古丁能显著抑制软骨诱导分化下的BMSCs细胞中Aggrecan、COL2A1的表达,同时促进COL1A1、COL10A1的表达(P均<0.05),并且存在浓度依赖性.结论 尼古丁能够明显抑制大鼠BMSCs的软骨分化,导致其软骨分化质量差.     

I型胶原对骨髓基质干细胞粘附及分化的影响

目的：了解高分子多孔立体材料PLGA经I型胶原表面修饰后，对骨髓基质干细胞（MSC）粘附及分化的影响。方法：抽取成年兔骨髓，以密度梯度离心法获得基质干细胞，以含10％小牛血清的RPMI1640为培养基。取第三代MSC，分别接种于24孔培养板，其中12孔预先放入包被I型胶原的PLGA材料作为实验组，另12孔为未经I型胶原修饰PLGA材料作为对照组。分别于不同时间点检测细胞数，了解细胞的粘附情况；检测碱性磷酸酶含量，了解细胞的分化情况。结果：结果显示I型胶原能明显促进MSC在高分子材料上的粘附。6h和8h时间点与对照组相比，有非常显著差异（P＜0．01）。碱性磷酸酶含量检测显示，I型胶原尚能诱导MSC的成骨细胞分化。结论：基因胜肽胶能促进MSC在高分子材料上的粘附并诱导向成骨细胞分化。     

转化生长因子-β1和血清对人骨髓基质干细胞增殖及向软骨细胞诱导分化的影响

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)和不同浓度胎牛血清对体外培养人骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖及向软骨细胞诱导分化的作用,为软骨组织工程提供有用的种子细胞。方法分别采集3例志愿者骨髓各6mL,用Percoll细胞分离液分离,收集单个核细胞,在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养扩增。将第3代细胞分为3组:A组为对照组,B组为含5%胎牛血清的诱导培养基组,C组为含10%胎牛血清的诱导培养基组。倒置显微镜下观察细胞生长状况,免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌,原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达,3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入实验检测细胞的增殖情况。结果经密度梯度离心后,活细胞比例在96%以上。贴壁后的细胞形态均一,由梭形向多角形转变。B组细胞在诱导培养7d后Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性,原位杂交可检测到Ⅱ型胶原mRNA的表达,而A、C两组分别为阴性和弱阳性。三组细胞3H-TdR摄入量的大小顺序为C>B>A。结论密度梯度离心法是一种高效、可大量获取人BMSCs的方法,细胞在体外生长稳定;低浓度的胎牛血清和10ng/mL的TGF-β1联合作用既可促进人BMSCs的增殖,又可诱导其向软骨细胞方向分化,而高浓度胎牛血清仅对细胞的增殖有促进作用。     

Ⅰ型胶原对骨髓基质干细胞粘附及分化的影响

目的　了解高分子多孔立体材料PLGA经Ⅰ型胶原表面修饰后 ,对骨髓基质干细胞 (MSC)粘附及分化的影响。方法　抽取成年兔骨髓 ,以密度梯度离心法获得基质干细胞 ,以含 1 0 %小牛血清的RPMI 1 640为培养基。取第三代MSC ,分别接种于 2 4孔培养板 ,其中 1 2孔预先放入包被Ⅰ型胶原的PLGA材料作为实验组 ,另 1 2孔为未经Ⅰ型胶原修饰PLGA材料作为对照组。分别于不同时间点检测细胞数 ,了解细胞的粘附情况 ;检测碱性磷酸酶含量 ,了解细胞的分化情况。结果　结果显示Ⅰ型胶原能明显促进MSC在高分子材料上的粘附。 6h和 8h时间点与对照组相比 ,有非常显著差异 (P <0 .0 1 )。碱性磷酸酶含量检测显示 ,Ⅰ型胶原尚能诱导MSC的成骨细胞分化。结论　基因胜肽胶能促进MSC在高分子材料上的粘附并诱导向成骨细胞分化     

间歇性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响

目的:研究间歇性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞(MSC)增殖的影响,探讨假体置换术后活动所需的最适宜压力。方法:以新西兰兔的骨髓基质干细胞为实验材料,通过噻唑盐(MTT)比色试验,观察间歇性压力对骨髓基质干细胞增殖的影响。结果:MSC在60、100 kPa间歇性压力培养环境下MTT反应的OD值小于对照组,压力值越大,OD值越小(P<0.05)。而20 kPa间歇性压力情况可显著促进MSC增殖,并随时间增加而增强。在实验第7天时,实验组OD值高于对照组(P<0.05),差异有显著性意义。结论:关节置换术后早期下地活动产生的较大应力,会明显抑制骨髓腔内MSC的增殖,不利于骨的重建愈合,临床应当避免。然而,较小的间歇性压力对MSC增殖有明显的促进作用,提示关节置换患者可在较小压力范围(<20 kPa)内进行早期关节被动活动训练,有利于关节术后骨的重建愈合。     

成人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的 建立临床成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为软骨细胞的途径。方法抽取成人骨髓，Percol密度梯度离心法进行体外培养，贴壁细胞传代，取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂地塞米松、维生素C和不同剂量转化生长因子-β(TGF-β)，培养16d后,在倒置显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝染色蛋白多糖，逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学(SABC法)检测Ⅱ型胶原表达，诱导后MSCs与新型材料聚乳酸和羟基乙醇共聚物(PL-GA)复合。结果 Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的。MSCs；5、10ng TGF-β诱导分化的MSCs生长迅速。呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性，MSCs对材料PL-GA黏附力强。结论 可以从成人骨髓中培养出MSCs，并可定向诱导分化为软骨细胞，5～10ng TGF-β为最佳诱导剂量，成人MSCs可用作临床自体软骨组织工程种子细胞。     

缝隙连接阻断剂1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞体软骨分化的影响

[目的]研究缝隙连接阻断剂1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞体外软骨分化的影响。[方法]体外培养小鼠骨髓基质干细胞(MSCs),贴壁细胞传代,取第3代细胞,以生长分化因子-5(GDF-5)(100ng/ml)和1-庚醇(2.5μmol/L)干预培养后,MTT法测定1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞增殖的影响,RT-PCR和免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达,Westernblotting检测Cx43蛋白的表达,阿尔辛蓝(Alcian)染色蛋白多糖。[结果]MTT结果显示2.5μmol/L浓度1-庚醇对小鼠MSCs的增殖不产生影响,对细胞没有毒性抑制作用;RT-PCR和免疫细胞化学显示1-庚醇能够抑制Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达;Alcian染色结果显示1-庚醇抑制分化细胞分泌蛋白多糖基质;Western blotting结果表明1-庚醇对Cx43蛋白的表达没有作用。[结论]GDF-5能够定向诱导小鼠骨髓基质干细胞向软骨方向分化,Cx43蛋白介导的缝隙连接细胞间通讯在GDF-5诱导软骨分化中发挥着很重要的作用。     

持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响

[目的]探讨持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响,揭示持续压力致假体松动下沉进展及其术后活动影响的生物学机制。[方法]以新西兰兔的骨髓基质干细胞为实验材料,通过四唑盐(MTT)比色试验,观察压力对骨髓基质干细胞增殖的影响。[结果]骨髓基质干细胞在20、60、100 kPa持续性压力培养环境下MTT反应的OD值显著小于对照组,压力值越大,OD值越小。20、60、100 kPa持续性压力可显著抑制骨髓基质干细胞细胞增殖,抑制作用随压力值增大而增强。[结论]关节置换术后早期患者不宜过早下地,否则将产生持续性应力,可以引起骨髓腔内骨髓干细胞的抑制,不利于骨质愈合。且易产生假体下沉和松动。     

体外诱导骨髓间质干细胞向软骨方向分化的研究

目的　探讨体外诱导骨髓间充质干细胞 (BMSCs)向软骨方向分化的条件和方法。方法　抽取兔股骨骨髓 ,用密度梯度离心和贴壁分离法分离BMSCs ,分别在高密度 (1× 10 6/ml)和低密度 (1× 10 4/ml)培养条件下用转化生长因子 β1(TGF β1)诱导BMSCs向软骨方向分化。倒置显微镜、透射及扫描电子显微镜观察细胞 ,用免疫组织化学、原位杂交、特殊染色方法检测Ⅱ型胶原及软骨基质成分的表达。结果　高密度诱导的BMSCsⅡ型胶原免疫组织化学阳性率为 89.2 %,Ⅱ型胶原原位杂交阳性率为 82 .6%,黏多糖特殊染色阳性 ,低密度诱导的BMSCsⅡ型胶原免疫组织化学阴性 ,Ⅱ型胶原原位杂交阳性率为 3 .8%,黏多糖特殊染色阴性。结论　TGF β1可以诱导BMSCs向软骨方向分化 ,细胞密度是BMSCs分化的重要影响因素。     

转染BIG-3基因的人骨髓基质干细胞向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的研究转染BIG-3基因对人骨髓基质干细胞(hBMSCs)向软骨纠胞诱导分化的影响。方法将构建好的pMSCVpuro-BIG-3转染至建系的hBMSCs,5μg/mL嘌罗霉素筛选12 d后,扩增并收集细胞,电泳证实特定条带无误。实验分三组：hBMSCs-BIG-3组、hBMSCs-EV组和hBMSCs组,每组重复6次,将三组细胞制成微粒模拟三维培养模式,分别加入浓度为400 ng/mL的重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP一2)作用14 d后,检测甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原mRNA,利用MPS60病理图象分析系统采集图像,并进行灰度分析,半定量比较基质表达量。结果灰度值：hBMSCs-BIG-3组为684 481 822,hBMSCs-EV组为439 101 780,hBMSCs组为441 082 183,hBMSCs-BIG-3组灰度值明显高于后两组(P＜0．05),hBMSCs-EV组和hBMSCs组之间差异无显著性意义(P=0．862)。结论BIG-3基因有助于hBMSCs向软骨细胞诱导分化。     

缺氧状态对骨形态发生蛋白-2诱导分化体外复合富血小板血浆凝胶的骨髓间充质干细胞的影响

目的研究缺氧状态对骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化体外复合富血小板血浆(PRP)凝胶的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的影响。方法取第三代培养的BMSCs细胞与PRP凝胶相混合,通过构建细胞缺氧模型,根据培养条件的不同确定实验分组:常氧BMSCs+PRP组(A组)、常氧BMP-2+BMSCs+PRP组(B组)、低氧BMSCs+PRP组(C组)、低氧BMP-2+BMSCs+PRP组(D组)。反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)及Western-blotting检测各组成软骨及成骨基因的表达。结果 RT-PCR检测表明C组和D组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达均较A组和B组明显升高;Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶(ALP)在B组的表达最高;A组与B组runt相关转录因子2(Runx2)的表达较C组和D组明显升高。Western-blotting检测结果表明B组和D组的Ⅱ型胶原表达较A组和C组明显升高;C组与D组的HIF-1α表达较A组与B组显著升高;D组的SOX-9表达较其余3组显著升高。所有结果差异均有统计学意义(P0.05)。结论低氧条件能显著促进BMP-2对BMSCs的成软骨诱导分化,同时抑制BMSCs的成骨分化。HIF-1α可能是这一过程的重要调节因子,其可能通过调节SOX-9的表达来发挥促BMSCs成软骨细胞分化的作用。     

辛伐他汀对大鼠骨量及骨髓基质干细胞增殖、分化的影响

目的观察辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖、分化的影响。方法16只9周龄雌性SD大鼠按体重随机分成2组,每组8只：第1组（G1）,对照组,每天蒸馏水灌胃（N）;第2组（G2）,实验组,辛伐他汀灌胃20mg·kg^-1·d^-1（S20）,持续3周,于最后1次灌胃的第2天处死所有大鼠,取右侧股骨行骨密度和骨组织形态计量学测定;取左侧股骨和胫骨骨髓细胞分别向成骨、成脂方向诱导培养,并作如下检测：（1）成骨组：采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测定向成骨分化中的骨髓基质干细胞的增殖能力;细胞培养第16d和28d分别检测碱性磷酸酶（ALP）比活性、ALP染色和von Kossa染色;细胞培养第16d,提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）、碱性磷酸酶（ALP）、破骨细胞分化因子（RANKL） mRNA的表达;（2）成脂组：采用CCK-8法检测定向成脂分化中的骨髓基质干细胞的增殖能力;细胞培养第18d,检测LPL比活性,并提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测脂蛋白脂酶（LPL） mRNA的表达。结果辛伐他汀体内给药干扰21d后大鼠骨量和骨密度无显著变化。体外培养骨髓基质干细胞所有检测基因 mRNA水平、细胞增殖能力、矿化能力（von Kossa染色）、ALP比活性、ALP染色、LPL比活性两组间差异均无显著性。结论辛伐他汀体内给药3周对大鼠骨量及骨髓基质干细胞的增殖和分化无显著作用。     

成骨生长肽对大鼠骨髓基质细胞增殖和成骨分化的作用

目的：观察成骨生长肽诱导体外培养的大鼠骨髓基质细胞增殖及向成骨分化的作用。方法：取6周龄SD大鼠，贴壁法分离培养骨髓基质细胞，在不同浓度成骨生长肽的诱导下，观察细胞形态变化，绘制骨髓基质细胞生长曲线，碱性磷酸酶和钙结节组织化学染色。结果：成骨生长肽对骨髓基质细胞增殖和成骨分化的作用呈剂量依赖性：成骨生长肽浓度在10^-10及10^-11mol／L时促进骨髓基质细胞增殖，而在10^-8及10^-9mol／L时对骨髓基质细胞的增殖略有抑制作用；成骨生长肽浓度在10^-10及10^-11mol／L时骨髓基质细胞碱性磷酸酶染色基本呈阴性，与对照组相比差异无统计学意义，而在10^-8及10^-9mol／L浓度下可以显著提高骨髓基质细胞碱性磷酸酶染色的阳性率。结论：成骨生长肽可以明显促进大鼠骨髓基质细胞增殖及向成骨细胞分化，其促成骨活性具有显著的浓度依赖性。     

骨髓基质干细胞体外分化软骨细胞的实验研究

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对兔骨髓基质干细胞(BMSC)体外增殖、分化为软骨样细胞的影响。方法 24只兔等分为4组,抽取骨髓,分离基质干细胞,体外连续传代培养,A组为基础培养液,B、C、D组分别加入TGF-β1、b-FGF、TGF-β1和b-FGF,观察细胞生长情况及形态特征,阿新蓝染色,Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果B组细胞形态变化、C组增殖速度、D组增殖速度及形态变化均较A组加快。阿新蓝染色:原代阴性,传代细胞,A、c组淡染或阴性,B组呈蓝色,D组呈深蓝色。Ⅱ型胶原mRNA表达:A、c组未检出,B组阳性,D组有较强阳性表达。结论 兔BMSC在体外适当条件下可分化为软骨样细胞,TGF-β1能诱导BMSC向软骨方向分化,b-FGF不仅能促进BMSC的增殖,且能延长其生存时间。     

骨髓基质细胞向神经细胞分化研究进展

自2000年美国《科学》杂志首次报道来源于骨髓的细胞进入脑并表达神经表型以来,在动物模型上进行的骨髓基质细胞移植模拟治疗中风、脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化及帕金森病等的研究均显示有一定的疗效.近年来体外诱导骨髓基质细胞向神经系细胞分化的研究颇多,其中涉及到多种生物技术.该文就化合物诱导及潜在问题、蛋白及基因转染问题、骨髓基质细胞与神经细胞共培养等研究作一综述.     

Human bone tissue formation in diffusion chamber culture in vivo by bone-derived cells and marrow stromal fibroblastic cells

Direct grafts of human cells into immunocompromised or cortisone-treated animals, either alone or within carrier materials, have been used with some success to assess the developmental capability of the grafted cells. However, identification of the donor or host origins of the generated tissue in such direct grafts is essential. In an alternative and extensively used experimental system, cells are cultured within the isolated environments of diffusion chambers, which are surgically implanted in appropriate hosts. This system allows the direct study of the cellular potentials for differentiation as host tissues are excluded. In the present study, human osteoprogenitor cell populations derived from trabecular bone explants or marrow suspensions of 3 patients (2 females aged 14 years and 1 male aged 27 years) were cultured in the absence or the continuous presence of dexamethasone (10 nmol/L). Cells were impregnated into porous hydroxyapatite ceramics before subcutaneous implantation, or placed within diffusion chambers before intraperitoneal implantation, in athymic mice. All subcutaneous implants of cells in ceramic showed morphological evidence for the formation of bone tissue. In the diffusion chambers it was found that both marrow- and bone-derived fibroblastic cells cultured in the absence of dexamethasone generally produced fibrous tissue only. When cultured in the continuous presence of dexamethasone (10 nmol/L), these cell populations produced similar osteogenic tissues with active osteoblasts, wide osteoid seams, and mineralized tissue, with cartilage toward the interior of the chamber. These results validate the diffusion chamber as an experimental system to study human osteogenesis using appropriately primed cell populations.     

Nell-1对兔骨髓基质干细胞增殖与黏附的影响

目的探讨Nell-1对兔骨髓基质干细胞（BMSCs）增殖与黏附的影响。方法体外分离与培养兔BMSCs，分别用0、50、100、200、500ng／mL的Nell-1诱导培养基培养48h。利用MTr法测定细胞增殖能力的变化，通过荧光法测定接种后1hBMSCs的黏附率。结果Nell-1浓度为100ng／mL时BMSCs的黏附率增高，Nell-1浓度为200ng／mL时细胞黏附率达最高，但当Nell-1浓度进一步增加时，细胞黏附率却不再增加。Nell-1对BMSCs的增殖无明显影响。结论Nell-1可增强BMSCs的黏附率，同时对BMSCs的增殖无明显影响。