应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒

目的构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒。方法应用PCR扩增出CD和TK基因,经适当改造后插入pAdtrack CMV中构建成转移质粒pAdtrack CMV-CDTK,经酶切线性化后,转化用氯化钙制备的感受态AdEasier-1细菌,获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒,滴度测定后,体外感染血管内皮细胞ECV304。结果PCR检测表明已成功构建了含CD、TK融合基因的重组腺病毒,为进一步开展肿瘤的双自杀基因治疗研究奠定了基础。结论应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统,方法更简便、成功率更高、实验周期更短。     

应用改进的AdEasy系统制备重组腺病毒

目的 改进AdEasy系统，使之更简便、高效、快捷。方法 pAdtrack经酶切线性化后，转化经氯化钙处理的感受态AdEasier-1细菌，获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒。荧光显微镜下细胞中重组腺病毒观察绿色荧光蛋白的表达。结果 应用氯化钙法由pAdtrack转化AdEasier-1细菌，可获得极高比例的(20／20)阳性重组腺病毒克隆。结论 应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统，方法更简便、成功率更高、实验周期更短、对实验室的条件要求低。     

应用改进的AdEasy系统制备重组腺病毒

目的改进AdEasy系统,使之更简便、高效、快捷。方法pAdtrack经酶切线性化后,转化经氯化钙处理的感受态AdEasier-1细菌,获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒。荧光显微镜下细胞中重组腺病毒观察绿色荧光蛋白的表达。结果应用氯化钙法由pAdtrack转化AdEasier-1细菌,可获得极高比例的(20/20)阳性重组腺病毒克隆。结论应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统,方法更简便、成功率更高、实验周期更短、对实验室的条件要求低。     

重组腺病毒Ad-CD/TK对人肝癌细胞的作用

目的:通过构建含CD/TK双自杀基因的重组腺病毒,探讨治疗肝细胞癌的途径.方法:目的基因CD/TK,自真核载体pCEA-CD/TK中切出,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,构建成转移质粒pAdtrack-CMV-CD/TK,经PmeⅠ酶切后与pAdeasy-1质粒混匀共转化细菌BJ5183,挑选克隆pAd-CD/TK,经PacⅠ酶切后转染293细胞,PCR鉴定后,在人肝癌细胞中测定其感染效率并观察其体外对人肝癌细胞的作用.结果:pAdtrack-CMV-CD/TK和pAd-CD/TK经酶切鉴定正确,pAd-CD/TK转染293细胞,制备腺病毒后,发现其对人肝癌细胞有较高的感染效率,给予氟胞嘧啶后,发现被感染细胞能够被杀死,并具有很高的旁观者效应.结论:构建的含CD/TK双自杀基因的重组腺病毒对人肝癌细胞有较高的感染效率,在体外观察到对人肝癌细胞有较好的杀灭作用.     

一种简易、廉价、高效构建重组腺病毒载体的方法

目的：建立构建重组腺病毒载体的简易、廉价、高效方法，为进一步应用含自杀基因的重组腺病毒治疗恶性肿瘤奠定基础。方法：Pme Ⅰ线性化腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV、切胶纯化，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1按一定比例混合后，以化学转化法导人大肠杆菌BJ 5 183，在菌内进行同源重组，构建重组腺病毒质粒rpAdEasyGFP。以脂质体法将重组质粒转染293细胞包装重组腺病毒rAdGFP。结果：细菌内同源重组率高达80％；在293细胞中成功产生重组腺病毒。结论：对目前应用广泛的AdEasy系统进行了有效改进，在获得较高阳性重组率的同时，降低了对实验室设备的要求。     

新型Smad7 重组腺病毒载体的构建

目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7).方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肝脏总RNA,RT PCR获得鼠Smad7 cDNA片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack CMV Smad7,线性化后与腺病毒骨架载体质粒AdEasy 1在细菌BJ5183内同源重组,鉴定后在HEK293细胞包装成重组腺病毒AdSmad7.RT PCR检测AdSmad7在HEK293中的表达情况.结果该重组缺陷型腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后3 d可观察GFP明显表达;RT PCR检测证实Smad7表达增强.结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达GFP和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7,为进一步研究TGFβ信号转导和肝纤维化的基因治疗奠定基础.     

endostatin基因重组腺病毒的构建及在人肺腺癌细胞的表达

目的 利用AdEasy系统构建鼠内皮抑素(ES)基因重组腺病毒Ad.ES,并观察其在人肺腺癌细胞SPCA-1的表达.方法 采用酶切、连接和转化等方法,将质粒pcDNA3.ES中的ES片段插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV.ES,经Pme Ⅰ酶切线性化后与含腺病毒基因骨架的质粒载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内进行同源重组得到腺病毒质粒pAd.ES,重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后,转染人胚肾293细胞包装成腺病毒颗粒Ad.ES,将病毒上清反复感染293细胞获得高滴度病毒,应用氯化铯(CsCl)梯度离心的方法纯化病毒,利用AdEasy系统上的绿色荧光蛋白(GFP)标签测定重组腺病毒的功能滴度.用2 MOI重组腺病毒Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h,流式细胞仪检测GFP表达阳性率,ELISA法测定细胞培养上清液中ES的含量.结果 双酶切证实重组腺病毒穿梭载体pAdTrack.CMV.ES质粒构建正确,卡那霉素抗性筛选和Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d,约20%的细胞表达GEP,回收病毒重复感染293细胞,CsCl梯度离心纯化最终获得约5.6×1010TU/mL滴度的重组病毒.Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h后,细胞GFP阳性率为93%,细胞培养上清液中ES的含量较Ad.GFP感染组和阴性对照组明显增加(P＜0.05).结论 应用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和ES的重组腺病毒,Ad.ES体外感染人肺腺癌细胞SPCA-1可显著提高ES表达,为进一步研究抗血管生成治疗肺癌奠定了基础.     

一种快速构建重组腺病毒的简便方法

目的：对腺病毒AdEasy载体系统进行方法改良，使之成为能被一般实验室采用的快速构建重组腺病毒的系统。方法：用插入有G1VP7基因和绿色荧光蛋白的穿梭载体pAdTrackCMV与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共转化E.coliBJ5183并进行同源重组，获得重组腺病毒质粒，经PacⅠ线性化后，转染293细胞。为便于操作，对AdEasy载体系统的某些操作过程进行了适当改进。结果：得到重组腺病毒rvAdG1VP7(G)。转染重组腺病毒DNA的293细胞出现细胞病变，经PCR对传代的rvAdG1VP7(G)分析证实，有特异性的G1VP7基因整合，荧光显微镜能观察到293细胞内有绿色荧光。结论：腺病毒AdEasy载体系统是一种较为简便，快速的构建重组腺病毒的好方法。经过适当改进后更适合于国内实验室的研究和应用。     

含TKglyES融合基因重组质粒的构建

目的：构建携带胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase，TK）及内皮抑素（Endostatin，ES）融合基因的重组质粒。方法：以pAdE1CMV—TK为模板，经聚合酶链反应（PCR）扩增TK片段，将其插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV，再以PET-19b—ES质粒为模板经PCR扩增glyES片段，将其插入TK片段的下游，构建成pAdTrackCMV—TKglyES。结果：酶切、PCR及DNA测序鉴定表明成功构建了携带胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase）及内皮抑素（Endostatin）融合基因的重组质粒。结论：为进一步构建病毒载体用于肿瘤基因治疗打下基础。     

双自杀基因融合基因重组腺病毒的制备与鉴定

目的：制备含胞嘧部氨酶（CD）基因，胸苷激酶（TK）基因的融合基因重组腺病毒，为恶性肿瘤的基因治疗研究作准备。方法：构建包含有CD，TK融合基因的重组粘粒，将其与腺病毒DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染人胚肾293细胞株细胞，获取重组腺病毒，并进行鉴定。结果：酶切结果及PCR结果显示，重组粘粒中CD，TK融合基因插入正确，经鉴定所获重组腺病毒带有融合基因，并且无具有复制能力的腺病毒存在。结论：所获重组病毒为E1，E3缺陷型，含有所需的双自杀基因，可进一步用于基因治疗研究。     

含血管内皮生长因子启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒的制备及其体外杀伤作用观察

OBJECTIVE: To efficiently construct a recombinant adenovirus containing cytosine deaminase (CD) gene driven by vascular endothelial growth factor (VEGF) promoter using an AdEasier-1 system and observe its killing effect on LoVo cells in vitro. METHODS: The CD gene was amplified by PCR, and amplicons were cloned in JM109 bacteria, and then recombined into pREP8 to obtain pREP8-CD, which was then digested by HindIIIand XbaIfor the CD fragment with polyadenylation site (CD-pA) subcloned into the VEGFP -containing shuttle plasmid pAdtrack-VEGFP to generate pAdtrack-VEGFP-CD-pA. After linearization with PmeI, pAdtrack-VEGFP-CD-pA was transformed into AdEasier-1 cells, and the transformants were selected on LB agar plates containing 25 microg/ml kanamycin followed by identification of the positive pAdEasy-VEGFP-CD with electrophoretic analysis and enzymatic digestion. pAdEasy-VEGFP-CD was then digested with PacIand transfected into 293 cells to produce the recombinant adenovirus Ad-VEGFP-CD, which was finally confirmed by PCR. The positive recombinant adenoviruses were transfected into LoVo cells to observe their in vitro anti-tumor effect. RESULTS: pAdEasy-VEGFP-CD was constructed with a success rate of 70%. After being packaged in 293 cells and purified by CsCl banding, the titer of the recombinant adenovirus Ad-VEGFP-CD reached as high as 4.8x10(12) CFU particle/ml, and the adenovirus was further confirmed by PCR analysis. In the presence of the prodrug 5-FC, the recombinant adenoviruses remarkably inhibited the growth of LoVo cells. CONCLUSION: The recombinant adenoviruses containing CD gene under the control of VEGF promoter can be efficiently generated using the AdEasier-1 system, and exhibit potent anti-tumor effect in vitro.     

含血管内皮生长因子启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒的制备及其体外杀伤作用观察

目的 应用AdEasier-1系统高效制备含血管内皮生长因子(VEGF)启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒并观察其体外肿瘤杀伤作用。方法 以JM109细菌基因组为模板,PCR扩增出含Hind Ⅲ/Bam HⅠ酶切位点的CD基因,亚克隆到pREP8,继而用Hind Ⅲ/XbaⅠ切出含pA加尾信号的CD基因,插入到预先构建的含VEGF启动子的转移质粒pAdtrack-VEGFP构建pAdtrack-VEGFP-CD。经PmeⅠ线性化后转化AdEasier-1细菌,用25 μg/ml卡那霉素筛选阳性克隆,先后进行琼脂糖电泳和PacⅠ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CD。经293细胞包装、扩增获得重组腺病毒Ad-VEGFP-CD,行PCR鉴定。通过测定细胞克隆形成率和细胞存活率观察重组腺病毒对体外培养的LoVo细胞的细胞毒作用。结果 构建重组腺病毒质粒的成功率为70%(7/10)。包装扩增后重组腺病毒的滴度为4.8×10¹² CFU/ml,PCR扩增结果与预期相符。在前药5-氟胞嘧啶存在下,重组腺病毒对LoVo具有明显杀伤作用,细胞克隆形成率和细胞存活率都明显下降。结论 应用AdEasier-1系统可以成功制备含VEGF启动子驱动CD自杀基因的重组腺病毒,该重组体具有明显的肿瘤杀伤作用。     

Betatrophin重组腺病毒过表达载体的构建

［摘要］目的: 应用基因同源重组技术,构建及鉴定携带小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)的复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步研究betatrophin的功能奠定基础。方法: 根据基因库中登录的小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)序列,经化学合成得到含BamHⅠ/ AgeⅠ酶切位点的小鼠betatrophin基因全长cDNA质粒,将其酶切后插入到带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的GV314载体CMV MCS 3FLAG SV40 EGFP中,得到重组病毒穿梭质粒pGV314 betatrophin;经BamHⅠ/ AgeⅠ双酶切后,与线性化的pDC315病毒基因组质粒体外同源重组,构建含有目的基因的腺病毒载体Ad betatrophin,酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,利用聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹法及测序鉴定重组的腺病毒。结果： 阳性克隆质粒Ad betatrophin在HEK293T细胞中成功包装出重组病毒,经PCR、蛋白质印迹及测序检测表明重组腺病毒包装成功。结论： 成功构建了携带小鼠betatrophin基因的复制缺陷型重组腺病毒过表达载体。     

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用.方法 用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给子前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的 基凶的表达,而乳腺上皮细胞无表达.MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优丁任一单自杀基因(P＜0.01).在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中.该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的牛长.其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01).结论 腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统.     

人NP9基因蛋白重组腺病毒的制备

目的：制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法：酶切pMD18T-NP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至芽梭载体构建重组pAcTrack-CMV-NP9载体，线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183，通过同源重组得到重组的pAD-NP9病毒载体将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒。结果：酶切鉴定得到阳性pAD-NP9重组腺病毒载体，该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装，转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(CFP)表达并逐渐增多、增强：结论：成功构建了NP9基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒，为进一步研究NP9基因的功能及应用NP9进行基因治疗奠定基础。     

乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3．1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。