链霉亲和素修饰的CdSe–ZnS量子点对聚合酶链反应的影响作用初步研究

目的:探讨链霉亲和素修饰的CdSe–ZnS量子点对聚合酶链反应的影响。方法:将链酶亲和素修饰的量子点浓度进行稀释观察其对于聚合酶链反应体系的浓度效应;反应体系中含有一定浓度的链酶亲和素修饰的量子点,在不同的退火温度下进行扩增,观察链酶亲和素修饰的量子点对退火温度的影响;将不同浓度的BSA加入到含有一定浓度的链酶亲和素修饰的量子点的反应体系中,观察BSA的影响作用;将不同公司的Taq酶与不同浓度链酶亲和素修饰的量子点组合,观察对扩增体系的影响。结果:一定浓度链霉亲和素修饰的量子点可以促进聚合酶链反应的扩增效率,拓宽PCR的退火温度范围;BSA可以逆转链霉亲和素修饰的量子点对于PCR的优化作用;量子点可能是与Taq酶相互作用,来影响PCR的扩增效能。结论:一定浓度的链霉亲和素修饰的量子点可以优化PCR的反应体系。     

用量子点标记技术检测肺炎支原体抗原

目的:通过建立鼠肺炎支原体肺炎模型,研究CdSe/ZnS量子点标记技术检测肺炎支原体抗原的最佳时期,并探讨其临床应用的可行性。方法:以CdSe/ZnS量子点标记兔抗肺炎支原体P1重组蛋白IgG作为检测抗体,对不同感染时期的鼠支气管灌洗液标本及105份临床呼吸道感染标本进行测定,观察CdSe/ZnS量子点标记方法检测肺炎支原体感染阳性率与病程的关系,以及该方法与聚合酶链反应(PCR)检测法的符合率。结果:感染3 d～7 d的鼠支气管灌洗液检测Mp阳性率最高。临床标本PCR检测阳性率为35.2%(37/105),量子点标记方法阳性率为31.4%(33/105),两者符合率达86.7%(91/105)。结论:量子点标记方法适用于肺炎支原体感染早期的检测,方法操作简单、检测快速,在实验室诊断中有良好的应用前景。     

非荧光法与荧光法芯片检测细菌感染的研究

目的 研制一种用于快速检测急症常见感染细菌的芯片反应系统。方法 应用生物信息学技术，设计检测细菌的探针和聚合酶链反应扩增引物，探针点制成寡核苷酸芯片，待测样本经扩增并标记生物素或CY5荧光素后与芯片杂交，再经链酶亲和素-碱性磷酸酶显色反应后，获得肉眼可见的杂交信号，或通过荧光检测仪读出样本的检测结果。结果 建立了针对临床急症患者标本的非荧光法与荧光法芯片检测系统，芯片的检测灵敏度(大肠埃希菌)为10～100CFU／反应体系。结论 两种方法不仅能快速、灵敏地检测靶细菌感染，且重复性好、信号强及不易出现非特异信号。生物素酶联显色芯片法由于更为经济、简便而有重要的临床价值。     

CdSe/CdZnS核壳结构量子点的制备及对大肠杆菌O157的生物标记

目的制备CdSe/CdZnS核壳结构量子点并将其作为荧光探针对大肠杆菌O157进行生物标记,为建立病原微生物的量子点标记快速检测新技术提供科学依据。方法利用高温有机合成方法制备CdSe/CdZnS核壳结构量子点,采用透射电镜、荧光光谱、吸收光谱进行表征。以巯基乙酸为稳定剂将量子点转移到水相并对大肠杆菌O157进行标记,利用荧光显微镜进行表征。结果制备的CdSe/CdZnS核壳结构量子点尺寸均匀,分散性良好,粒径为5~6 nm,发光峰半峰宽为23 nm。标记量子点上的细菌在365 nm激发下发出明显红光,且形态清晰,边界分明。当菌体浓度低于3.6×106cfu/ml时对量子点荧光强度具有增效作用,随着细菌浓度增大量子点荧光强度增强。结论制备的CdSe/CdZnS核壳结构量子点可用于大肠杆菌O157的快速检测。     

食源性致病菌96微孔板DNA诊断芯片的研制

目的:建立一种能同时检测12种常见食源性致病菌的基于微孔板阵列技术的检测平台,以满足食物中毒处置中能快速、准确提供实验室结果的要求。方法:针对12种最常见的食源性致病菌,设计种特异性的PCR引物和寡核苷酸探针,按照5×5的阵列格式将探针点制到96微孔板的微孔内,建立稳定的微孔杂交体系,采用链霉亲和素碱性磷酸酶和化学显色底物NBT/BCIP来检测特异性的PCR杂交产物。结果:经标准菌株验证已建立的食源性致病菌微孔板DNA诊断芯片,获得比较敏感、特异和稳定的实验结果;同时经食物中毒样品检测应用,与传统的细菌分离培养和生化鉴定的结果相符。结论:本研究建立的能同时检测12种常见食源性致病菌的基于微孔板阵列技术的检测平台具有快速、准确、自动化和高通量等特点,作为应对食物中毒等突发公共卫生事件的实用检测技术具有重要意义。     

DNA芯片联合检测耐利福平与异烟肼结核分枝杆菌及其临床应用

目的 开发快速检测耐利福平与异烟肼结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA基因突变的DNA芯片.方法 根据结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA基因序列设计探针并制作基因芯片,从临床样品中分离出结核分枝杆菌的基因组DNA,PCR扩增含有上述几个基因突变位点的特异DNA片段,并事先在PCR引物的5′端作生物素标记,然后与膜条芯片上的检测特异突变位点的寡核苷酸探针进行杂交,通过生物素-链霉亲和素-过氧化物酶体系显色,直接观察突变情况,以此来判断耐药结果 .结果 35个利福平和异烟肼单耐药或多药耐药的结核分枝杆菌中有82.9%用芯片法检出的结果 与药敏培养法一致;其中利福平耐药样品突变检出率为100.0%;有20.0%异烟肼耐药的样品芯片未检出突变,可能是突变发生在芯片检测位点范围之外.结论 用DNA芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性,具有较高的特异性和敏感性,可用于临床结核分枝杆菌耐药性检测.     

肠道传染病病原体可视化基因芯片检测技术的研究

〔目的〕研究建立能同时检测7种肠道传染病病原体的可视化的快速、高效的基因芯片检测技术。〔方法〕针对霍乱弧菌、副溶血弧菌、沙门菌、大肠埃希菌O157：H7、金黄色葡萄球菌、轮状病毒、诺瓦克病毒（Ⅰ型和Ⅱ型）等7种肠道传染病病原体,设计特异引物和探针,构建芯片。以链霉亲和素包被的磁珠为信号标记分子检测芯片上的特异杂交反应,结果采用裸眼观察或普通光学设施成像保存。测试构建芯片的特异性、重复性及灵敏度等参数。〔结果〕该芯片具有较好的特异性和重复性,检测灵敏度可达25ng/μl;对27份临床粪便样本分别进行PCR和芯片检测,芯片检测结果与PCR方法检测结果一致。〔结论〕本研究建立的基于磁珠标记的可视化芯片技术,能够用于快速筛查选定的7种主要的肠道传染病病原体。该技术对于进一步开发更多指标的微生物检测方法具有很好的示范作用。     

寡核苷酸芯片技术检测肠杆菌科食源性感染常见致病菌的研究

目的：建立肠杆菌科食源性感染常见致病菌的快速检测方法。方法：选带正电荷的尼龙膜作为寡核苷酸芯片载体，采用寡核苷酸芯片技术对肠杆菌科食源性感染常见致病菌进行检测和鉴定。结果：在同一条件下运用多重PCR扩增出14种（属）细菌的16SrRNA、23SrRNA基因片段，随后应用寡核苷酸芯片技术对致病菌进行检测得到了相应的特异性杂交图谱。结论：建立的寡核苷酸芯片技术可快速检测肠杆菌科食源性感染常见致病菌，为食源性感染的快速诊断与预防奠定了良好的基础。     

细菌核糖体23 S亚单位基因芯片在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的研究建立快速检测细菌DNA的方法,建立含有10种细菌探针的检测用基因芯片模型. 方法使用合成的扩增细菌核糖体23 S亚单位(23S rDNA)寡核苷酸探针,制备基因芯片;设计23S rDNA通用引物,应用PCR(聚合酶链反应)法,扩增细菌核糖体23S亚单位基因(23S rDNA),扩增后产物与芯片上的探针杂交,用荧光扫描仪检测信号;对23种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用本方法进行检测,并与常规细菌培养法比较. 结果基因芯片检测临床致病菌具有较高的特异性和灵敏性. 结论利用寡核苷酸探针基因芯片检测系统具有一定的种属鉴别能力,比常规培养法快速、准确.     

运用23S rDNA芯片技术进行食源性感染常见致病菌的快速鉴定

[目的]应用23S rDNA芯片技术，建立食源性感染常见致病菌的快速鉴定方法。[方法]利用带正电荷尼龙膜为芯片载体，合成寡核苷酸探针，点样于载体制成寡核苷酸芯片，对食源性感染常见致病菌23S rDNA基因片段扩增产物进行杂交检测。[结果]获得扩增食源性感染常见致病菌23S rDNA基因片段的特异性引物，并在同一条件下扩增出14种细菌目标片段。在均一的杂交条件下与寡核苷酸芯片杂交，用地高辛酶联免疫法进行显色。结果表明，10种细菌杂交结果显示很好的灵敏度和特异性，4种细菌由于探针因素或杂交条件不合适未能显示预期的种(属)杂交结果。对于食源性感染模拟标本，本方法也可以获得预期的结果。[结论]建立的23S rDNA芯片技术在食源性感染常见致病菌鉴定上快速准确的优点，为食源性感染的诊治与预防提供了有效的技术手段和方法依据。