人牙髓干细胞体外分选分化的初步实验研究

目的 体外培养人牙髓细胞,分选牙髓干细胞并诱导其分化.方法 选择因正畸目的 而拔除的健康完整双尖牙,酶消化法进行牙髓细胞培养,并进行来源鉴定.单抗Stro-1标记牙髓干细胞、免疫磁珠分选系统进行分选.矿化液定向诱导分选后的牙髓十细胞,比较诱导前后Stro-1染色及改良Gomori钙钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)的改变.结果 体外培养人牙髓细胞呈成纤维细胞样,抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性.牙髓干细胞Stro-1检测阳性,牙髓细胞中干细胞附性率约为10%.矿化诱导后细胞Stro-1阴性、ALP阳性表达.结论 采用免疫磁珠分选系统分离出人牙髓干细胞,初步验证干细胞分化潜能,为其后续生物学特性研究提供实验基础.     

人牙髓干细胞体外成骨向分化的实验研究

目的：探讨人牙髓干细胞在体外成骨向分化潜能。方法：用免疫磁珠法分选人牙髓干细胞并检测其干细胞表面标志物Stro-1、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105的表达。体外诱导人牙髓干细胞向成骨细胞分化,通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察成骨诱导后细胞的成骨活性和矿化结节形成情况,通过real-time PCR分析成骨相关基因ALP、col I、RunX2、OC的表达,未成骨诱导细胞作为对照。结果：人牙髓干细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物Stro-1、CD29、CD44、CD90、CD105,阴性表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45。成骨诱导5d、7d、14d ALP染色阳性,21d茜素红染色仅诱导组可见明显钙结节形成,对照组为阴性。成骨相关基因ALP、RunX2和Col I mRNA在成骨诱导早期高表达,OC mRNA在成骨诱导14d表达开始逐渐升高。结论：经磁珠分选纯化的人牙髓干细胞在成骨诱导条件下可向成骨细胞分化,形成钙盐沉积和矿化结节,ALP、col I、RunX2、OC参与了成骨向分化的过程。     

应用人恒牙牙髓干细胞与明胶支架构建组织工程骨的研究

目的构建由人恒牙牙髓干细胞和三维明胶支架组成的组织工程骨,并验证其成骨效果。方法从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙牙髓组织中应用酶消化法获得牙髓细胞,单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞。第3代细胞被分别接种到6孔板或三维明胶支架上进行成骨向诱导培养,诱导14天后支架组移植入裸鼠背部皮下。应用ALP染色、Von Kossa染色验证牙髓干细胞的体外成骨能力;应用X线、HE染色和免疫组化验证组织工程骨的体内成骨效果。结果牙髓干细胞体外成骨向诱导后7、14天ALP染色呈阳性;14、21天Von Kossa染色形成矿化结节。在体内组织工程骨成骨明显,X线显示实验侧支架内有团块状高密度阻射影;HE染色显示大量的骨组织形成;免疫组化显示骨结构区域骨桥蛋白、骨涎蛋白和骨钙素阳性表达。结论人恒牙牙髓干细胞和明胶支架构建形成了组织工程骨。     

人恒牙牙髓干细胞分化为脂肪细胞的体外实验研究

目的验证人恒牙牙髓组织来源的牙髓干细胞在体外向脂肪细胞的定向分化,并对分化后的细胞进行鉴定。方法从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙中分离牙髓组织,应用酶消化法获得牙髓细胞。单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞,第3代牙髓干细胞用成脂肪向诱导培养基向脂肪细胞诱导分化。用油红O染色鉴定成脂肪向分化,RT-PCR检测脂肪细胞的特异相关或标志基因。以同期培养的未诱导的普通培养基培养的DPSCs做阴性对照;以同期培养的骨髓间充质干细胞成脂肪向分化的结果做阳性对照。结果人恒牙牙髓干细胞经成脂肪向培养基诱导后表现出脂肪细胞特性,油红O染色结果为阳性,RT-PCR检测成脂肪向分化相关基因过氧化物酶增殖物激活受体γ2、脂肪酶结合蛋白aP2和脂蛋白脂酶均有阳性表达。结论人恒牙牙髓干细胞在体外具有分化为脂肪细胞的潜能。     

Definitive differentiation from human dental pulp stem cells to adipocyte in vitro

目的 验证人恒牙牙髓组织来源的牙髓干细胞在体外向脂肪细胞的定向分化,并对分化后的细胞进行鉴定.方法 从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙中分离牙髓组织,应用酶消化法获得牙髓细胞.单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞,第3代牙髓干细胞用成脂肪向诱导培养基向脂肪细胞诱导分化.用油红O染色鉴定成脂肪向分化,RT-PCR检测脂肪细胞的特异相关或标志基因.以同期培养的未诱导的普通培养基培养的DPSCs做阴性对照;以同期培养的骨髓间充质干细胞成脂肪向分化的结果做阳性对照.结果 人恒牙牙髓干细胞经成脂肪向培养基诱导后表现出脂肪细胞特性,油红O染色结果为阳性,RT-PCR检测成脂肪向分化相关基因过氧化物酶增殖物激活受体γ2、脂肪酶结合蛋白aP2和脂蛋白脂酶均有阳性表达.结论 人恒牙牙髓干细胞在体外具有分化为脂肪细胞的潜能.     

人恒牙牙髓干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的:研究人恒牙牙髓组织来源的牙髓干细胞在体外分化为成骨细胞的能力,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙中分离牙髓组织,应用酶消化法获得牙髓细胞.单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞,第3代牙髓干细胞用成骨向诱导培养基向成骨细胞诱导分化.用碱性磷酸酶染色和Vo...     

小型猪乳牙牙髓干细胞体外分离培养及鉴定

目的体外分离培养小型猪乳牙牙髓干细胞,并对其进行生物学鉴定。方法采用滤纸片法挑取单克隆小型猪乳牙牙髓细胞,免疫组织化学染色检测,体外比较单克隆牙髓干细胞及混合牙髓干细胞向矿化组织、脂肪细胞、及神经细胞诱导分化能力。结果分离培养的小型猪乳牙牙髓干细胞呈集落状生长,克隆形成率2．74％。波形丝蛋白、间充质于细胞表面标志STRO-1染色阳性,神经干细胞特异性标志nestin染色阳性。矿化诱导结果显示单克隆牙髓干细胞及混合牙髓干细胞,均为Von-kossa染色阳性,ATJP表达明显,两者无明著差异。单克隆牙髓干细胞及混合牙髓干细胞经IBMX、胰岛素、消炎痛和氢化可的松诱导3周后,可分化为脂肪细胞,两者成脂率均较低。单克隆乳牙牙髓干细胞向神经细胞诱导分化后免疫荧光鉴定β-tubulin III表达阳性,STRO-1表达阴性。混合牙髓干细胞无明显神经元样细胞分化。结论单克隆分离培养的小型猪乳牙牙髓干细胞具有很强的克隆形成能力及多向分化潜能,其矿化能力与混合的乳牙牙髓干细胞无明显差异。     

成体人牙髓干细胞的分离与鉴定

目的从成体人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，初步探讨其分化潜能。方法选取年轻患者因正畸或阻生拔除的健康第三磨牙，取出牙髓，采用酶消化及过滤法得到单细胞悬液，有限稀释法原代培养。扩大培养细胞克隆，检测STRO-1的表达。体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节形成、牙本质涎蛋白(DSP)表达、Oil Red—O染色、PPARr2基因表达等方面进行检测。结果克隆来源细胞STRO-1表达阳性。在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达DSP，已向成牙本质细胞方向发生了分化。成脂肪诱导后，Oil Red—O染色阳性，可检测到PPARr2基因表达。结论从成体人牙髓组织中可以分离培养出干细胞，在体外能有效增殖并保持低分化状态。     

山羊乳牙牙髓细胞分离培养与矿化诱导的体外研究

目的:分离培养山羊乳牙牙髓细胞,研究其矿化诱导前、后生物学特性的改变。方法:采用改良酶解组织块法培养山羊乳牙牙髓细胞,应用免疫组化方法(SAB法)对第2代细胞进行来源检测,经矿化诱导培养的第4代细胞与常规培养细胞做对照,进行相关生物学特性检测,包括细胞增殖能力、矿化能力、细胞形态改变、蛋白OCN表达、相关成骨基因(ALP、COL-I、OCN、OPN)表达水平。结果:改良酶解组织块法可较快地培养出山羊乳牙牙髓细胞,细胞爬出时间为培养的第3～4天。第2代细胞抗波丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性,证明其间充质来源。MTT法测定显示,未诱导细胞的增殖能力明显高于矿化诱导后的细胞。与未诱导细胞相比较,矿化诱导的细胞ALP染色、钙结节茜素红染色均呈强阳性,免疫组化OCN阳性表达。诱导14d后,定时定量PCR检测证实成骨基因OCN、ALP显著上调。结论:本实验采用改良酶解组织块法成功培养出山羊乳牙牙髓细胞;连续矿化诱导培养14d后,山羊乳牙牙髓细胞分泌矿化基质,具有向成骨细胞分化和形成骨组织的潜能。     

1,25（OH）2维生素D3矿化液对人牙髓干细胞成骨方向诱导作用的研究

目的研究维生素D3矿化液对人牙髓干细胞的成骨方向诱导是否有促进作用。方法从恒牙牙髓中分离培养成纤维样细胞并测试其间充质干细胞的特异性标记物Stro-1阳性率,用一定浓度的1,25（OH）2维生素D3、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的矿化液诱导牙髓干细胞,通过倒置相差显微镜、碱性磷酸酶染色、Vonkossa染色及骨钙素、Ⅰ型胶原基因表达观察和检测矿化液诱导后细胞形态变化及矿化基质分泌情况,以未诱导组为对照。结果维生素D3矿化液连续诱导21d后,诱导组的细胞碱性磷酸酶染色阳性、Ⅰ型胶原和骨钙素的基因表达阳性,并可见明显钙结节形成。结论维生素D3矿化液可以诱导人牙髓干细胞向成骨样细胞分化并促进其产生矿化基质。     

牙髓干细胞分化过程中L型钙离子通道羧基末端的表达

目的:探讨牙髓干细胞(DPSCs)分化过程中L型钙离子通道羧基末端的表达。方法:利用酶消化法体外分离、培养大鼠牙髓干细胞;吉姆萨染色法检测大鼠牙髓干细胞的克隆形成能力;神经诱导体系下诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化,免疫荧光染色检测细胞分化后胶质纤维酸蛋白(glial fibrillary acidic pro-tein,GFAP)的表达和细胞分化前后L型钙离子通道Cav 1.2及羧基末端的表达。结果:牙髓干细胞的克隆形成能力为每1 000个细胞形成2～17个克隆;免疫荧光染色检测诱导后细胞GFAP表达阳性;免疫荧光染色检测显示:牙髓干细胞分化前L型钙离子通道Cav 1.2羧基末端表达于细胞膜上,细胞分化后羧基末端同时表达于细胞膜上和细胞核中。结论:L型钙离子通道Cav 1.2羧基末端在牙髓干细胞分化过程中发生核转位,羧基末端可能在牙髓干细胞的分化过程中发挥着一定的作用。     

The Effect of SIRT6 on the Odontoblastic Potential of Human Dental Pulp Cells

Introduction

The aim of this study was to investigate whether SIRT6 is expressed in human dental pulp as well as the effect of SIRT6 on proliferation and odontoblastic differentiation of human dental pulp cells (HDPCs).

Methods

Immunohistochemical and immunocytochemical assays were used to detect the expression of SIRT6 in human dental pulp tissue and HDPCs. To determine the effect of SIRT6 on odontoblast differentiation, HDPCs with loss (HDPCs SIRT6 knockdown) and gain (HDPCs SIRT6 overexpression) of SIRT6 function were developed, and their proliferation ability was examined. Odontogenic differentiation of HDPCs was determined by alkaline phosphatase (ALP) activity, ALP-positive cell staining, alizarin red staining, and von Kossa staining. Mineralization-related genes, including ALP, dentin sialophosphoprotein (DSPP), and dentin matrix acidic phosphoprotein 1, were determined by real-time quantitative polymerase chain reaction. Western blot analysis was performed to detect the expression of DSPP protein.

Results

SIRT6 was found in the dental pulp tissue and HDPCs. SIRT6 knockdown decreased ALP activity in HDPCs; calcium nodule formation ability; and the expression of mineralization-related genes such as ALP, DSPP, and DMP1, whereas these were increased with the overexpression of SIRT6.

Conclusions

SIRT6 is expressed in human dental pulp and participates in the odontoblast differentiation of HDPCs.