含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景：前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞。目的：模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾（AGM）区、胎肝（FL）及骨髓（BM）基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件。方法：将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体（EB）,并利用Transwell非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM＋FL和EB/AGM＋FL＋BM共4组。共培养6d后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1＋c-Kit＋细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态。结果与结论：①EB/AGM＋FL组和EB/AGM＋FL＋BM组收获细胞涂片均发现原始造血细胞。②拟胚体来源细胞经AGM区基质细胞诱导后Sca-1＋c-Kit＋细胞明显升高（P〈0.05）。③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组（P〈0.05）,而EB/AGM＋FL、EB/AGM＋FL＋BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高。提示AGM＋FL和AGM＋FL＋骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层。     

含人AGM区基质细胞对小鼠胚胎干细胞诱导体外分化为造血干/祖细胞的作用

为探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对小鼠胚胎千细胞(embryonic stem cells,ESC)体外诱导分化为造血干细胞(HSC)的影响及其作用机制,将小鼠E14 ESC诱导为拟胚体(EB),收获的EB细胞以Tran-swell非接触共培养体系分别在人AGM区、胎肝(FL)或骨髓(BM)基质细胞饲养层上进一步诱导分化,分为EB对照、AGM诱导、FL诱导、BM诱导、AGM + FL诱导和AGM + BM诱导共6组.分别收获各组EB来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+ c-Kit+细胞含量,并进行各系造血细胞集落形成单位(CFU)分析.结果显示:经不同基质细胞饲养层诱导后EB来源细胞中Sca-1+ c-Kit+细胞比例均较诱导前明显升高(p<0.01),AGM+FL诱导组为(21.96±2.54)%,显著优于其它诱导组(p<0.01),AGM+BM诱导组阳性细胞比例亦较单纯BM诱导组明显增加(p<0.O1);EB对照组造血集落产率明显低于其它诱导组,AGM+FL、AGM+BM诱导组集落产率较高,尤以AGM+FL诱导组最佳(p<0.01).结论:人AGM区基质细胞有助于维持一定的原始HSC数目及高增殖潜能,在AGM区基质细胞诱导基础上可明显提高FL或BM基质细胞对ESC源性原始HSC的进一步扩增作用.     

人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建

背景:研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化.目的:以人主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响.方法:将小鼠E14 胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6 d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性.再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Co γ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组.结果与结论:拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+细胞占(13.12±1.30)%.NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成.静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21 d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因.提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力.     

人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建

背景：研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化。目的：以人主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephros,AGM）区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响。方法：将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性。再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Coγ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组。结果与结论：拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1＋c-Kit＋细胞占（13.12±1.30）%。NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成。静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因。提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力。     

按造血发育程序诱导小鼠胚胎干细胞为造血干细胞重建体内造血的实验研究

为研究小鼠胚胎干细胞(ESC)定向诱导分化为造血干细胞(HSC)在体内重建造血的功能,将小鼠E14ESC诱导为拟胚体(EB),EB细胞利用Transwell非接触共培养体系在人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞饲养层上依次诱导,收获各阶段EB细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,并接种于NOD-SCID小鼠以检测体内致瘤性。再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植到经致死量60Coγ射线照射的BALB/c雌鼠,将受鼠随机分为5组:①AGM组,②AGM+FL组,③AGM+FL+BM组,④照射对照组,⑤正常对照组。观察各组生存率、造血重建和植入状况。结果显示:EB细胞经人AGM区和FL基质细胞共培养后Sca-1+c-Kit+细胞达到峰值(21.96±2.54)%;NOD-SCID小鼠在接种经人AGM区基质细胞诱导的EB细胞后可出现畸胎瘤,而接种经人AGM区+FL基质细胞诱导EB细胞后未见肿瘤形成;AGM组及照射对照组动物全部死亡,而AGM+FL组及AGM+FL+BM组生存率分别为77.8%、66.7%,移植后21天外周血象基本恢复,在存活受鼠检测到供体来源Sry基因。结论:按胚胎造血发育程序,体外经人AGM区、FL及BM基质细胞连续诱导小鼠ESC分化的HSC可安全、有效地重建体内造血。     

人胚AGM区造血干／祖细胞的分离及其在含AGM区基质细胞体系中的培养

本研究分离人胚主动脉-性腺-中肾（AGM）区造血干／祖细胞（HSPC）并在含人AGM区基质细胞的培养体系中进行培养，以了解人AGM区基质细胞对HSPC的作用。以免疫组织化学方法检测人胎龄28—45天胚胎AGM区细胞CD34、Flk-1、VEGF的表达；分离AGM来源的HSPC，通过直接接种和经Transwell非直接接触两种方法接种于含人AGM区基质细胞系（hAGMS3和hAGMS4）饲养层的培养体系，观察HSPC生长情况和卵石区形成细胞（cobblestone area—forming cells，CAFC）并计数卵石区（cobblastone area，CA）；用间接免疫荧光方法检测培养体系中悬浮细胞和CAFC的cD34、Flk-1表达；收获细胞进行半固体造血集落培养以检测两种培养方法对AGM—HSPC的集落形成能力影响。结果表明：人AGM区造血细胞表达cD34和Flk-1。两种接种方法均显示有CFC形成，直接接触培养能形成CD34和Flk-1双阳性的CAFC，集落总数明显高于非接触培养（hAGMS3体系：1647-1-194VS389-1-31．P〈0．05；hAGMs4体系：1586±75VS432±35，P〈0．05）。结论：①人胚AGM区含有CD34^＋Flk-1^＋的HSC。②首次建立含人胚AGM基质细胞的AGM—HSPC培养体系，直接接触培养和非直接接触培养均能促进AGM—HSC的生长，AGM基质细胞与HSC直接接触发挥重要作用。     

人胚胎AGM区基质细胞在体外培养中对脐血CD34+细胞的支持作用

目的探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐血CD34+细胞的造血支持作用.方法采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞,接种于底层已制备好的人AGM区基质细胞S1～S5饲养层的24孔板中,同时设无饲养层组及取自同期胚胎的躯干成纤维(hFT)细胞为对照,体外培养28 d,每7 d收获细胞并检测总数,流式细胞术检测CD34+、CD34+CD38细胞含量,并行造血细胞集落培养.结果在未加外源性造血生长因子的条件下,5株人AGM区基质细胞hAGMS1～S5对造血细胞总数、CD34+及CD34+CD38细胞、造血细胞集落均有不同程度的扩增及维持作用,与无饲养层组、hFT细胞组比较差异有统计学意义(P＜0.05).细胞总数在21 d达到峰值[扩增(25.13±4.83)倍],CD34+、CD34+CD38-细胞在扩增14 d达到峰值[(2.68±0.51)倍、(2.38±0.45)倍],高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFU)亦在14 d达到峰值[(2.62±0.85)倍].hAGMS1～S5的造血支持作用组间比较差异亦有统计学意义(P＜0.05),其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5.结论人AGM区基质细胞对脐血CD34+细胞具有维持及扩增作用,特别是hAGMS3、S4两株细胞具有更好的维持作用,为胚胎早期造血发生机制和诱导胚胎干细胞造血分化研究提供了重要的模式细胞和基础资料.     

体外培养的人AGM区基质细胞表达多种造血生长因子

本研究检测人胚胎主动脉-性腺-中肾（AGM）区基质细胞表达的造血生长因子，为探讨AGM区基质细胞在胚胎造血发生中的作用及其造血支持作用提供基础资料。采用RT—PCR方法在mRNA水平分析IL-6、SCF、Fit3-L、OSM、IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子在人AGM区基质细胞（hAGMSI—S5）的表达情况，应用ELISA法测定IL-6、SCF、Fit3-L在hAGMSI—S5细胞培养上清液中的分泌水平，并将脐血CD34^＋细胞与hAGMSI—S5饲养层细胞共培养14天后行造血细胞集落培养以进一步检测人AGM区基质细胞的造血支持作用。结果表明：hAGMSI—S5均表达IL-6、SCF、Flt3-L、OSM等造血生长因子mRNA，不表达IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子mRNA。在hAGMSI—S5细胞培养上清液中可测得分泌的SCF、Fit3-L、IL-6等因子，hAGMSI—S5组间比较各因子水平无显著性差异（P〉0．05）。集落培养结果表明，hAGMSI—S5对CFU—GM、BFU—E、CFU-Mix均有不同程度的扩增作用，hAGMSI—S5的造血支持作用组间比较亦显示有显著性差异（P〈0.05），其中hAGMS3,S4优于S1、S2及S5。结论：人AGM区基质细胞表达SCF、Fit3-L、IL-6、OSM等多种造血生长因子，这可能与AGM区基质细胞支持造血细胞原始发生和体外维持造血干细胞功能相关。     

造血干细胞联合AGM基质细胞移植对骨髓移植小鼠造血重建的影响

目的探讨造血干细胞与主动脉-性腺-中肾(Aorta-gonad-mesonephros,AGM)区来源的基质细胞联合移植对同基因骨髓移植(bone marrow transplantation,BMT)小鼠BMT后骨髓造血的影响。方法建立同基因骨髓移植小鼠模型,随机分成4组:空白对照组、BMT组、BMT联合AGM基质细胞移植组(联合移植组)及川芎嗪组,另设正常组。分别于BMT后第7、14、21、28d检测外周血细胞、骨髓单个核细胞(bone marrow mono-nuclear cells,BMMNC)、第3、7、10、14、 21、28d检测骨髓组织学变化。结果联合移植组骨髓单个核细胞较川芎嗪组恢复快,联合移植组及川芎嗪组外周血血细胞、骨髓单个核细胞、骨髓组织恢复均较单纯BMT组快,有显著性差异。结论 BMT联合AGM基质细胞移植对骨髓移植造血重建具有促进作用。     

胚胎AGM区造血发育的研究现状

主动脉-性腺-中肾（AGM）区是哺乳动物体节期胚胎自主产生造血干细胞（HSC）的主要造血组织。AGM区造血发生模式主要是造血发生内皮,而近年来有证据表明造血血管原始干细胞和血管外间质也参与其造血形成。AGM—HSC的表面标志随发育成熟变化活跃,其中CD41是最早建立的造血标志,而内皮细胞特异分子在不同发育阶段HSC的表达变化提示该细胞的逐步成熟和稳定。经典造血生长因子白介素3对AGM-HSC的扩增效应令人兴奋,而联合斑马鱼模型揭示前列腺素对AGM区以及骨髓HSC的调节活性也预示今后的研究手段将更为丰富。最近,AGM区间充质干细胞（MSC）的发现及其显著的造血支持功能将有助今后发掘新型的HSC调控因子。本文就AGM区的造血发生模式、AGM区HSC的表面标志和AGM区造血干细胞的调控进行了综述。     

In vitro hepatic differentiation of mesenchymal stem cells from human fetal bone marrow

We examined whether human fetal mesenchymal stem cells (FMSCs) derived from fetal bone marrow were able to differentiate into functional hepatocyte-like cells in vitro. The surface phenotype of FMSCs was characterized by flow cytometry. To induce hepatic differentiation of FMSCs, we added hepatocyte growth factor, basic fibroblast growth factor and oncostatin M into the cell culture medium. After 21 days of hepatocyte induction, FMSCs expressed the hepatocyte-specific markers, alpha-fetoprotein and cytokeratin 18, as demonstrated by immunofluorescence staining. Differentiated FMSCs also demonstrated in vitro functions characteristic of liver cells, including albumin production, urea secretion and glycogen storage. In conclusion, fetal bone marrow-derived FMSCs are able to differentiate into functional hepatocytelike cells and may serve as a source of cells for liver disease therapy.     

序贯法诱导小鼠胚胎干细胞向神经元样细胞的分化

背景:目前小鼠胚胎干细胞体外向神经方向诱导分化的研究报道诸多,但其分化的过程很难控制,很多实验的操作方法复杂,分化比率也很低.目的:建立一种稳定、高效、简便的实验方法,将小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经细胞.设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-08/2008-01在中国医科大学发育生物学教研室完成.材料:小鼠胚胎干细胞系AB2.1,由美国南加州大学医学院惠赠.方法:在饲养层细胞上培养小鼠胚胎干细胞,采用"序贯诱导法",优化实验条件,将小鼠胚胎干细胞向神经方向诱导,列诱导后细胞进行成熟神经细胞标志物签定,并用流式细胞仪测定诱导分化比率.主要观察指标:①倒置荧光显微镜下观察小鼠胚胎干细胞形态特征.②优化序贯诱导法的3个实验条件.③实验条件优化后诱导至第10天分化细胞的形态特征.④诱导后第10天细胞免疫荧光法和蛋白免疫印迹检测神经细胞特异性标志物的表达.⑤蛋向免疫印迹检测诱导分化第4天和第10天细胞的神经细胞β-微管蛋白J1的表达.⑥流式细胞仪检测神经元特异性核蛋向阳性细胞百分比.结果:①生长于饲养层上的未分化鼠胚胎干细胞聚集呈圆形或椭圆形集落样生长,细胞排列紧密,集落边界清楚.②优化后的"序贯诱导法"在诱导时首次接种所用培养液的血清浓度为12.5%,小鼠胚胎干细胞首次接种最佳密度为1.0×108 L-1,完全更换为无血清培养液的时间为第5天.⑨诱导至第10天分化细胞出现的突起可达胞体长度的10倍以上.也有小部分分化细胞胞体呈多边形,有多个短突起,仅有一个细长突起,出现突触样结构和生长端样结构,类似神经元.④诱导后第10天细胞免疫荧光法检测神经元特异性标志物巢蛋白、神经细胞β-微管蛋白J1、神经元特异性核蛋白、神经细胞黏附分子1表达阳性,神经胶质细胞标志物胶质细胞纤维酸性蛋白表达阴性.⑤与未分化鼠胚胎干细胞相比,诱导分化第4天和第10天的细胞蛋白免疫印迹检测神经细胞β-微管蚩白J1表达升高(P＜0.05).⑥流式细胞仪检测神经元特异性核蛋白阳性细胞百分比,计算出诱导第10天胚胎干细胞分化比率为(89.91±2.03)%.结论:应用优化后的"序贯诱导法",可稳定、简便的诱导小鼠胚胎干细胞高比率分化为神经元样细胞.     

Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region

Hematopoietic stem cells (HSCs) emerge during embryogenesis and maintain hematopoiesis in the adult organism. Little is known about the embryonic development of human HSCs. We demonstrate that human HSCs emerge first in the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, specifically in the dorsal aorta, and only later appear in the yolk sac, liver, and placenta. AGM region cells transplanted into immunodeficient mice provide long-term high level multilineage hematopoietic repopulation. Human AGM region HSCs, although present in low numbers, exhibit a very high self-renewal potential. A single HSC derived from the AGM region generates at least 300 daughter HSCs in primary recipients, which disseminate throughout the entire recipient bone marrow and are retransplantable. These findings highlight the vast regenerative potential of the earliest human HSCs and set a new standard for in vitro generation of HSCs from pluripotent stem cells for the purpose of regenerative medicine.     

人骨髓干细胞异体内诱导分化为肝细胞的实验

背景:如何获取来源丰富的高质量人源性肝细胞是生物人工肝和肝细胞移植共同面临的问题。骨髓干细胞在适当条件下可分化为肝细胞,为获取肝细胞提供了新的思路。目的:探讨人骨髓干细胞在大鼠体内诱导分化为肝细胞的方法,为解决临床肝脏移植和生物人工肝来源提供新的思路。设计:随机对照实验。单位:南方医科大学珠江医院普通外科。材料:实验于2004-05/2005-02在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。选取雄性清洁级SD大鼠40只,随机分为5组:单纯模型组、造模 人骨髓干细胞移植14d组、造模 人骨髓干细胞移植28d组、造模 CL-1细胞(人肝细胞系)移植14d组、造模 CL-1细胞(人肝细胞系)移植28d组,8只/组。方法:①5组均建立2-乙酰氨基芴 四氯化碳 环磷酰胺肝损伤模型。②利用治疗性肝再生策略,将人骨髓干细胞移植到大鼠肝脏内诱导分化为肝细胞。造模 人骨髓干细胞移植14d组移植人骨髓干细胞后观察14d,造模 人骨髓干细胞移植28d组移植人骨髓干细胞后观察28d,造模 CL-1细胞移植14d组移植CL-1细胞后观察14d,造模 CL-1细胞移植28d组移植CL-1细胞后观察28d,单纯模型组未进行细胞移植。③各组在正常状态下以及移植前后进行血清标本的采集与肝功能检测。应用免疫组化、聚合酶链反应法、实时荧光定量反转录聚合酶链反应技术检测各组大鼠肝脏内人白蛋白的mRNA的表达。主要观察指标:①人骨髓干细胞移植对大鼠肝功能转氨酶及总胆红素含量的影响。②各组大鼠病理切片肝细胞形态检查结果。③各组大鼠肝脏中人主要组织相容性抗原-Ⅰ类阳性率。④各组大鼠肝脏中大鼠Sox11序列、人Alu-sx序列、人白蛋白mRNA基因的表达。结果:实验选用40只大鼠,全部进入结果分析。①人骨髓干细胞移植对大鼠肝功能转氨酶及总胆红素含量的影响:各细胞移植组在正常状态以及细胞移植前与单纯模型组基本相似(P>0.05);与正常状态比较,细胞移植前各组均显著增高(P<0.01);与细胞移植前比较,各细胞移植组在细胞移植后均显著降低(P<0.01),但仍高于正常状态下的转氨酶、总胆红素含量(P<0.01)。②各组大鼠病理切片肝细胞形态检查结果:正常情况下肝脏病理切片显示肝细胞排列成条索状,围绕中央静脉成放射状排列,汇管区无炎性细胞浸润;单纯模型组呈大片状坏死表现;人骨髓干细胞移植组可见一些坏死后增生性改变;CL-1细胞移植组可见卵圆细胞以及小胆管增生。③各组大鼠肝脏中人主要组织相容性抗原-Ⅰ类阳性率:单纯模型组为0,造模 人骨髓干细胞移植14d组为(13.03±0.18)%,造模 人骨髓干细胞移植28d组为(9.47±0.46)%,造模 CL-1细胞移植14d组为(10.27±0.50)%,造模 CL-1细胞移植28d组为(9.84±0.23)%。④各组大鼠肝脏中基因序列聚合酶链反应检测结果:单纯模型组大鼠肝脏中只检测到大鼠Sox11序列;而人骨髓干细胞移植、CL-1细胞移植各时间组均可检测到人Alu-sx序列和大鼠Sox11序列。⑤各组大鼠肝脏组织实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测结果:单纯模型组大鼠肝脏组织中未检测到人白蛋白mRNA基因表达,人骨髓干细胞移植、CL-1细胞移植各时间组以及阳性对照均可检测到人白蛋白mRNA基因表达。结论:人骨髓干细胞移植能促进肝损伤大鼠的肝功能恢复,人源性细胞在肝损伤大鼠肝脏中的替代率约10%,提示人骨髓干细胞在异体内均可转化为肝细胞并可实现部分替代。     

人骨髓干细胞异体内诱导分化为肝细胞的实验

背景：如何获取来源丰富的高质量人源性肝细胞是生物人工肝和肝细胞移植共同面临的问题。骨髓干细胞在适当条件下可分化为肝细胞，为获取肝细胞提供了新的思路。 目的：探讨人骨髓干细胞在大鼠体内诱导分化为肝细胞的方法，为解决临床肝脏移植和生物人工肝来源提供新的思路。 设计：随机对照实验。单位：南方医科大学珠江医院普通外科。 材料：实验于2004-05／2005-02在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。选取雄性清洁级SD大鼠40只，随机分为5组：单纯模型组、造模＋人骨髓干细胞移植14d组、造模＋人骨髓干细胞移植28d组、造模＋CL-1细胞（人肝细胞系）移植14d组、造模＋CL-1细胞（人肝细胞系）移植28d组．8只／组。 方法：①5组均建立2-乙酰氨基芴＋四氯化碳＋环磷酰胺肝损伤模型。②利用治疗性肝再生策略，将人骨髓干细胞移植到大鼠肝脏内诱导分化为肝细胞。造模＋人骨髓干细胞移植14d组移植人骨髓干细胞后观察14d，造模＋人骨髓干细胞移植28d组移植人骨髓干细胞后观察28d，造模＋CL-1细胞移植14d组移植CL-1细胞后观察14d，造模＋CL-1细胞移植28d组移植CL-1细胞后观察28d，单纯模型组未进行细胞移植。③各组在正常状态下以及移植前后进行血清标本的采集与肝功能检测。应用免疫组化、聚合酶链反应法、实时荧光定量反转录聚合酶链反应技术检测各组大鼠肝脏内人白蛋白的mRNA的表达。 主要观察指标：①人骨髓干细胞移植对大鼠肝功能转氨酶及总胆红素含量的影响。②各组大鼠病理切片肝细胞形态检查结果。③各组大鼠肝脏中人主要组织相容性抗原-Ⅰ类阳性率。④各组大鼠肝脏中大鼠soxll序列、人Alu-sx序列，人白蛋白mRNA基因的表达。 结果：实验选用40只大鼠，全部进入结果分析。①人骨髓干细胞移植对大鼠肝功能转氨酶及总胆红素含量的影响：各细胞移植组在正常状态以及细胞移植前与单纯模型组基本相似（P〉0．05）；与正常状态比较，细胞移植前各组均显著增高（P〈0．01）；与细胞移植前比较，各细胞移植组在细胞移植后均显著降低（P〈0．01），但仍高于正常状态下的转氨酶、总胆红素含量（P〈0．01）。②各组大鼠病理切片肝细胞形态检查结果：正常情况下肝脏病理切片显示肝细胞排列成条索状，围绕中央静脉成放射状排列，汇管区无炎性细胞浸润；单纯模型组呈大片状坏死表现；人骨髓干细胞移植组可见一些坏死后增生性改变；CL-1细胞移植组可见卵圆细胞以及小胆管增生。③各组大鼠肝脏中人主要组织相容性抗原-Ⅰ类阳性率：单纯模型组为0，造模＋人骨髓干细胞移植14d组为（13．03&;#177;0．18）％，造模＋人骨髓干细胞移植28d组为（9．47&;#177;0．46）％．造模＋CL-1细胞移植14d组为（10．27&;#177;0．50）％．造模＋CL-1细胞移植28d组为（9．84&;#177;0．23）％。④各组大鼠肝脏中基因序列聚合酶链反应检测结果：单纯模型组大鼠肝脏中只检测到大鼠Soxll序列；而人骨髓干细胞移植、CL-1细胞移植各时间组均可检测到人Alu-sx序列和大鼠Soxll序列。⑤各组大鼠肝脏组织实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测结果：单纯模型组大鼠肝脏组织中未检测到人白蛋白mRNA基因表达，人骨髓干细胞移植、CL-1细胞移植各时间组以及阳性对照均可检测到人白蛋白mRNA基因表达。 结论：人骨髓于细胞移植能促进肝损伤大鼠的肝功能恢复．人源性细胞在肝损伤大鼠肝脏中的替代率约10％，提示人骨髓千细胞在异体内均可转化为肝细胞并可实现部分替代。     

以骨髓基质细胞为饲养层培养小鼠精原干细胞

目的:建立精原干细胞与骨髓基质细胞共培养细胞模型,探讨骨髓基质细胞层支持精原干细胞扩增的可能机制。方法:实验于2004-03/2005-04在泸州医学院医学分子生物学实验室完成。以6～8d龄小鼠为材料,脱颈处死后经体积分数为0.75的乙醇浸泡消毒,打开腹腔分离双侧睾丸,采用0.25%胰酶消化离心后培养睾丸细胞,采用差速贴壁法分离支持细胞与生精细胞。同时取小鼠胫骨骨髓,分离后用IMDM培养基培养,待细胞生长至单层时,以10mg/L丝裂霉素C处理的原代培养骨髓基质细胞作为饲养层,并将分离后的生精细胞接种至饲养层上,以含体积分数为0.1的小牛血清的IMDM为培养基,37℃下共培养,在倒置相差显微镜下观察细胞的生长特点,并对培养15d的细胞进行苏木精-伊红染色、碱性磷酸酶染色及C-Kit受体检测。结果:①支持细胞在培养后4～6h就开始贴附变形,此时生精细胞仍呈圆形,且悬浮于培养基中,将悬浮的圆形生精细胞吸出后接种于骨髓基质饲养层上共培养。培养8h后,见体积较小的原形细胞开始贴附增殖,继续培养三四天后见体积相对较大的圆形细胞开始死亡,推测增殖较小的细胞为精原干细胞。增殖细胞的生长特点及形态学特征与文献报道精原干细胞的特征相符合。②苏木精-伊红染色显示培养的生殖细胞大小均匀,核大而圆着色深、胞质浅染、核质比高;碱性磷酸酶染色见胞质和细胞膜为阳性,C-Kit受体显示细胞膜呈强阳性,背景基质细胞为阴性。这些均符合精原干细胞的生物学特征。结论:精原干细胞在未加入细胞因子、原代培养的骨髓基质细胞饲养层中能较长时间生长并分裂增殖,推测骨髓基质细胞通过分泌生物活性物质和细胞黏附分子支持精原干细胞的扩增。