真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞（SH-SY5Y）的总cDNA中,扩增出约1.0kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

Mfn2基因克隆及pEGFPmfn2真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆线粒体融合蛋白2(mitofusin-2,mfn2)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pEGFPmfn2质粒载体。方法采用高效Trizol试剂快速提取大鼠血管平滑肌细胞株A7r5总RNA,经RT-PCR获得mfn2cDNA,扩增、纯化、回收mfn2基因片段并将质粒pEGFP-N1和mfn2基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收2.2 kb片段,再将回收的pEGFP-N1大片段与mfn2基因片段(2.2 kb)重组。对重组pEGFPmfn2质粒进行PCR和双酶切鉴定并测序。结果成功地从A7r5中克隆了mfn2基因,并构建了以pEGFP-N1为载体的真核表达质粒。结论含mfn2基因新型表达质粒构建的成功将为研究mfn2功能、进一步研究该基因异常表达与心血管疾病发生的关系奠定基础。     

pcDNA3.1-flag-pygo2真核表达载体的构建及在C6细胞中的表达

目的构建pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并在C6细胞中进行表达。方法从小鼠脑胶质细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成CDNA，设计引物，调取目的片段，与pcDNA3．1-flag载体连接后转化大肠杆菌DH5α，LB平板筛选菌落，提取质粒。重组质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经过酶切鉴定及测序后，阳离子脂质体法转染C6细胞并经免疫细胞化学染色及蛋白印迹检测重组体的表达。结果重构质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经限制性核酸内切酶EcoRⅠ，HindⅢ酶切分析及测序检查，表明真核表达载体构建正确；瞬时转染C6细胞后，免疫细胞荧光染色及蛋白印迹检测表明转染细胞能够表达外源Pygo2基因。结论成功构建了pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并能够在真核细胞中进行表达，这为今后研究pygo2基因在胶质瘤中的作用机制奠定了基础。     

构建pcDNA3.1/Hygro(+)-Lefty A真核表达载体及Lefty A的稳定表达细胞系

背景:Leffy基因可能通过拮抗转化生长因子β1,信号通路发挥抗肾纤维化作用.目的:为验证其抗纤维化作用,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-LeffyA真核表达载体,并建立LeftyA稳定表达细胞系.设计、时间及地点:基因克隆构建,单一样本观察,于2008-04/07在武汉大学人民医院中心实验室完成.材料:人肾小管上皮细胞株购于中国协和医科大学细胞库;真核表达载体pcDNA3.1/Hygro(+)由美国纽约州石溪大学SiamakTabibzadeh教授惠赠;Leffy A克隆载体pCMV-SPORT6购自武汉晶赛公司.方法:以pCMV-SPORT6为模板经PCR反应获得Leffy A编码区DNA,将其插入pcDNA3.1/Hygro(+)中构建Leffy A真核表达载体;通过LipofectamineTM2000将此重组质粒转染入人肾小管上皮细胞中,通过Hygromycin筛选挑取阳性表达克隆从而构建Leffy A稳定表达细胞系.主要观察指标:PCR扩增产物电泳鉴定结果.重组质粒的酶切鉴定结果.重组质粒基因测序结果.Leffy A稳定表达细胞系的筛选及其细胞内Leffy A mRNA表达.结果:pCMV-SPORT6经针对人Leffy A基因编码区序列的上下游引物PCR扩增后,10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,在10 kb条带处出现稍大于1.0 kb的特异性扩增条带,与预期1.1 kb目的片段大小相符.重组质粒分别被Hind Ⅲ、BamH Ⅰ单酶切后所得片段大小一致,均为6.7 kb,与重组质粒理论大小一致;经双酶切后得到大小分别为5.6 kb和1.1 kb的2条片段,与pcDNA3.1/Hygro(+)及Leffy A片段大小相符.将酶切鉴定阳性重组质粒测序,对测序结果进行生物信息学分析,发现与人Leffy A基因编码区序列完全一致.稳定转染Leffy A重组质粒的人肾小管上皮细胞高表达Leffy A mRNA.结论:pcDNA3.1/Hygro(+)-Leffy A真核表达载体构建成功,并建立了Lefty A稳定表达细胞系.     

真核表达载体pcDNA3.1/VEGF-B-EGFP的构建及在骨髓间质干细胞中的表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子B（vascular endothelial cell growth factor-B,VEGF-B）转染人骨髓间质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）的表达情况。方法将VEGF-B及编码增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid,cDNA）序列通过扩增、酶切、插入pcDNA 3.1质粒的多克隆位点,构建pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP真核表达质粒,应用脂质体介导的基因转染技术,将基因导入MSCs（pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP转染组）;应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况;流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应、蛋白印迹法检测VEGF-B的表达情况。结果 pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP转染组重组质粒转染MSCs 24h后,荧光显微镜下可见强绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率约为15%;RT-PCR检测结果显示,MSCs出现590bp目的基因;Western blot检测显示,在转染后MSCs中有VEGF-B表达。结论构建的VEGF-B真核表达质粒成功转染MSCs,为联合应用MSCs细胞移植和VEGF-B基因治疗心肌缺血的研究奠定了基础。     

真核表达载体pIRES-EGFP-PDGF-B的构建及在293T细胞中的表达

[摘要] 目的: 构建人基因PDGF-B真核表达载体pIRES-EGFP-PDGF-B,并在293T细胞中进行瞬间表达。方法: 采用PCR方法从购自美国典型培养物保藏中心含有PDGF-B基因全长cDAN序列的质粒中扩增出PDGF-B的cDAN片段，并与真核表达载体pIRES-EGFP连接，双酶切鉴定，最后采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将pIRES-EGFP-PDGF-B转入293T细胞中，利用荧光显微镜和Western blotting进行表达鉴定。结果: 成功克隆了PDGF-B基因全长cDAN，真核表达载体pIRES-EGFP-PDGF-B被成功构建，双酶切鉴定正确，表达载体能在293T细胞内正确地表达成熟的PDGF-B蛋白，并可分泌到细胞外。结论: 成功构建了pIRES-EGFP-PDGF-B真核表达载体，为进一步利用PDGF-B对脊髓损伤进行基因治疗奠定基础。     

pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体的构建

从胰腺癌PaTu8988S细胞中提取总RNA,并克隆AKR1B10基因,构建pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体。转化感受态大肠杆菌DH5α细胞,提质粒,酶切及测序鉴定,pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体构建成功。     

人FⅧ基因高效表达质粒的构建及其在Cos-7细胞中的表达

目的：构建人ＦⅧ真核表达质粒——ｐＡｄＣＭＶＬｉｎｋＦⅧＤＢ并观察其在Ｃｏｓ－７细胞中的表达活性。方法：采用缺失大部分Ｂ结构域的人凝血因子ⅧｃＤＮＡ（ＦⅧＤＢ），长度为４．６ｋｂ，将其插入含腺病毒序列表达质粒——ｐＡｄＣＭＶＬｉｎｋ１，构建了ＦⅧ真核表达质粒——ｐＡｄＣＭＶＬｉｎｋＦⅧＤＢ，用脂质体介导法将其转染Ｃｏｓ－７细胞，转染后２４，４８，７２小时分别用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＥＬＩＳＡ法及一期法测定培养细胞中ＦⅧＤＢｍＲＮＡ及ＦⅧ的含量与活性。结果：ＲＴ－ＰＣＲ法可检测到ＦⅧＤＢｃＤＮＡ转录的ｍＲＮＡ，ＥＬＩＳＡ法测得７２小时后ＦⅧ的含量为每２４小时１８ｎｇ／１０６细胞，一期法测得活性为每２４小时０．６Ｕ／１０６细胞，相当于正常人血浆中１００μｇ／ＬＦⅧ所产生的凝血活性的６０％。结论：所构建的ＦⅧ真核表达质粒在Ｃｏｓ－７细胞中具有一定的表达活性。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景:核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。目的:克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。方法:采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经BamHI、XhoⅠ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。结果与结论:经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景：核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。目的：克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。方法：采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经BamHI、XhoⅠ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。结果与结论：经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

人TLR4胞外段真核表达质粒的构建及其在HEK293 细胞中的表达

目的 构建人Toll—like receptor 4（TLR4）胞外段真核表达质粒并观察其表达。方法 通过PCR扩增人TLR4胞外段基因，将其克隆入真核表达质粒pcDNA3．1（＋），重组质粒peDNA3．1（＋）-eTLR4转染入人胚肾293细胞（HEK293 细胞）中，RT-PCR检测TLR4胞外段的表达。结果 测序结果表明，成功构建人TLR4胞外段真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-eTLR4，并在HEK293细胞中获得表达。结论 TLR4胞外段能在HEK293细胞中获得正确表达，为TLR4信号通路的进一步研究打下了基础。     

SV2A基因真核表达质粒构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建鼠突触囊泡蛋白2A(SV2A)基因的真核表达质粒,并瞬时转染至人胚肾细胞(HEK293T)中,对其表达进行鉴定。方法以APP/PS1双转基因小鼠海马组织的cDNA为模板,扩增得到长2239 bp的SV2A基因编码序列,将此序列插入到真核表达载体p3×Flag-CMV-10多克隆位点区域中,得到真核表达质粒p3×Flag-CMV-10-SV2A,转化后挑取单克隆菌落经双酶切鉴定后送公司测序,将构建成功的重组质粒转染至HEK293T细胞中,利用蛋白质印迹法(Western blot)检测SV2A基因的表达情况。结果成功构建p3×Flag-CMV-10-SV2A重组质粒,并在转染至HEK293T细胞后,验证了相应蛋白表达。结论利用分子克隆技术成功构建了p3×Flag-CMV-10-SV2A真核表达质粒并在HEK293T细胞中正确表达,为后续实验奠定了基础。     

人FOXC2真核表达载体的构建及稳定转染C-33A细胞系的建立

目的构建人FOXC2真核表达载体,并转染人宫颈癌C-33A细胞,建立稳定转染的细胞系。方法应用PCR方法从人FOXC2克隆中扩增其cDNA编码区序列,并将其构建于pcDNA3.1（-）真核表达载体。经PCR和测序鉴定后,利用脂质体进行宫颈癌C-33A细胞的转染,应用G418筛选出稳定表达FOXC2的细胞系,通过RT-PCR及Westernblot法检测FOXC2的表达情况。结果成功构建pcDNA3.1（-）/FOXC2真核表达载体,建立稳定转染FOXC2的C-33A细胞系,并鉴定了FOXC2目的基因在C-33A细胞中的过表达。结论FOXC2真核表达载体的成功构建为进一步研究FOXC2基因在宫颈癌中的功能奠定了良好的实验基础。     

人胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒的构建及其稳定表达细胞株的建立

目的构建胰岛素样生长因子1(insulin growth factor1,IGF-1)的真核细胞表达质粒,转染神经胶质瘤细胞(C6细胞),建立hIGF-1稳定表达细胞株,为进一步观察胰岛素样生长因子1基因体内转染后对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响打下基础。方法实验于2004-05/09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室进行。用聚合酶链反应方法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出IGF-1cDNA,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的hIGF-1基因序列;使用C6细胞株,用脂质体方法转染C6细胞。经G418筛选,形成阳性细胞克隆。继续培养4周,进行W estern blot检测。结果重组的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。W estern blot检测结果证实转染的hIGF-1基因在C6细胞内成功表达。结论实验所构建的重组真核细胞表达载体pcDNA3.1-hIGF-1能够稳定表达有活性的hIGF-1,实验结果对进一步观察脊髓损伤后胰岛素样生长因子1抑制神经细胞凋亡的作用有一定意义。     

人胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒的构建及其稳定表达细胞株的建立

目的：构建胰岛索样生长因子1（insulin growth faetor 1，IGF-1）的真核细胞表达质粒，转染神经胶质瘤细胞（C6细胞），建五hIGF-1稳定表达细胞株，为进一步观察胰岛索样生长因子1基因体内转染后对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响打下基础。方法：实验于2004-05／09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室进行，用聚合酶链反应方法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出IGF—1cDNA，然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中，酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的hIGF-1基因序列；使用C6细胞株，用脂质体方法转染C6细胞。经G418筛选，形成阳性细胞克隆。继续培养4周，进行Western blot检测。结果：重组的真核细胞表达质粒pcDNA3．1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。Western blot检测结果证实转染的hIGF-1基因在C6细胞内成功表达。结论：实验所构建的重组真核细胞表达载体pcDNA3．1-hIGF-1能够稳定表达有活性的hIGF-1，实验结果对进一步观察脊髓损伤后胰岛素样生长因子1抑制神经细胞凋亡的作用有一定意义。     

激活素受体相互作用蛋白ARIPzip真核表达载体的构建及表达

目的构建激活素受体相互作用蛋白 （aetivin receptor interacting protein zip, ARIPzip） 真核表达载体,以便进一步探讨其生物学作用。方法从小鼠成纤维细胞3T3中提取HNA,并利用ARIPzip特异性引物通过RT-PCR方法扩增了ARIPzip cDNA,并克隆入pcDNA-Flag载体中,构建重组载体pcDNA-F-ARIPzip。将重组载体转染入HEK293细胞中,并通过免疫印迹方法检测ARIPzip的表达。结果酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;免疫印迹结果显示,瞬时转染重组质粒的HEK293细胞中可有效表达ARIPzip。结论本研究成功构建了激活素受体相互作用蛋白ARIPzip真核表达载体,并能够在真核细胞中进行表达,为进一步研究ARIPzip的生物学功能奠定了基础。     

pcDNA3.1-bFGF真核表达载体的构建及其在犬骨髓基质干细胞中的表达

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs)后的表达情况,并进一步研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法:提取国人脑胶质瘤细胞BT325总RNA,RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段,构建重组载体pcDNA3.1-bFGF,重组载体经脂质体介导转染犬BMSCs,半定量RT-PCR及Western blot检测表达。结果:重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。bFGF在犬BMSCs中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-bFGF,此重组载体在犬BMSCs中能够表达。