骨形态发生蛋白2对14d胎鼠端脑神经干细胞分化为胆碱能神经元的影响

背景：骨形态发生蛋白2可能是参与胆碱能神经元前体细胞分化的细胞外调控因子。目的：观察骨形态发生蛋白2在孕14d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元过程中的作用。方法：取孕14d胎鼠端脑,用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞,种植于涂有多聚赖氨酸的培养板,细胞原代培养24h后半量换液,加入10μg/L骨形态发生蛋白2继续培养。结果与结论：胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性,获取的神经干细胞纯度大于99%;ChAT免疫荧光鉴定骨形态发生蛋白2可以将孕14d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元,细胞纯度大于97%。     

在端脑发育过程中胆碱能前体细胞发生和分化与不同浓度骨形态发生蛋白4的影响

目的:在神经元的发育过程中,骨形态发生蛋白具有多向诱导功能,实验观察不同浓度骨形态发生蛋白4对端脑胆碱能前体细胞发生和分化的影响,探寻其诱导条件及作用规律。方法:实验于2004-11/2005-03在吉林大学白求恩医学院组织胚胎学教研室细胞培养室和免疫组化实验室完成。采用无血清原代培养E16大鼠端脑细胞,分别在实验组培养液中加入终浓度为10,20和40μg/L骨形态发生蛋白4,细胞培养4 d时,实施乙酰胆碱转移酶免疫细胞化学染色,同时计算乙酰胆碱转移酶免疫反应阳性细胞的百分率。结果:乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应细胞分布于对照组和实验组细胞团的边缘和细胞团之间。20μg/L骨形态发生蛋白4组细胞团之间分散的细胞多伸出突起为乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应,可见少量具有典型放射状胶质细胞形态的细胞也呈乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应。10μg/L骨形态发生蛋白4组与对照组相比乙酰胆碱转移酶免疫反应阳性细胞数量差异无显著性(P>0.05),20μg/L骨形态发生蛋白4组乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应细胞数量明显多于对照组(P<0.05),40μg/L骨形态发生蛋白4组乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应细胞数量明显少于对照组(P<0.05)。结论:低浓度(20μg/L)骨形态发生蛋白4可诱导端脑胆碱能前体细胞发生和分化;较高浓度(40μg/L)骨形态发生蛋白4抑制端脑胆碱能前体细胞发生和分化。     

胎鼠端脑神经干细胞原代单层化贴壁培养

目的介绍利用胶原酶消化特点,简单而快速地实现神经干细胞原代单层化贴壁培养的方法。方法孕14d的SD大鼠无菌条件下取胎鼠端脑,剪碎后用含EDTA的Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞,种植于涂有多聚赖氨酸的培养板;Nestin免疫荧光鉴定细胞性质;计算细胞纯度。结果细胞Nestin免疫荧光阳性;获取的神经干细胞纯度>99%。结论本方法可以简单而快速地获得原代单层化贴壁生长的神经干细胞。     

骨形态发生蛋白2和7共转染骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:骨形态发生蛋白最主要的作用是诱导骨形成,但因提取困难、代谢速度快、难以准确控制其使用浓度、价格昂贵等限制了其在体外和体内相关研究中的应用。目的:构建含特异细胞生长因子基因骨形态发生蛋白2,7的腺病毒载体,观察骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7基因共转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用。方法:将全骨髓贴壁法分离得到兔骨髓间充质干细胞传至第3代,分为5组,空白组和常规诱导组分别以常规培养基和成骨诱导分化培养基培养;骨形态发生蛋白2,7腺病毒转染组:分别单独以骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7腺病毒进行转染;联合转染组:以2种骨形态发生蛋白腺病毒联合转染。结果与结论:转染第7天,联合转染组成骨相关基因Runx-2、Osx、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶mRNA表达均较其他各组增高(P<0.05);骨形态发生蛋白2,7腺病毒转染组上述指标较空白组和常规诱导组增高(P<0.05)。转染第14天,联合转染组4个指标均较其他各组明显增高(P<0.05);同时,4个指标表达均高于第7天(P<0.05)。病毒转染后第7天,联合转染组Ⅰ型胶原和骨钙素蛋白表达均较其他组明显增高(P<0.05)。提示对骨髓间充质干细胞进行骨形态发生蛋白2腺病毒和骨形态发生蛋白7腺病毒共转染后,较单基因转染和成骨诱导液诱导更能促进成骨相关基因和蛋白的表达。     

胶原酶和胰酶对胎鼠端脑神经干细胞培养的影响

背景：神经干细胞为神经发育和神经功能重建的研究带来了广阔前景,其体外培养已成为神经科学的一个研究基础。目的：比较胶原酶和胰酶对体外培养神经干细胞的作用。方法：取孕14d的SD大鼠,无菌条件下取胎鼠端脑,剪碎后分别用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞。结果与结论：胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长,而用胰酶消化得到的则形成聚集体;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性;获取的神经干细胞纯度大于99%。提示用胶原酶可以简单而快速地获得原代单层化贴壁生长的神经干细胞。     

小胶质细胞对体外培养神经干细胞向胆碱能神经元分化的影响

背景:神经干细胞的定向分化与小胶质细胞的浓度有关,浓度倍数过小可能达不到应有效应,太大则会产生细胞毒性.目的:观察不同比例的小胶质细胞对体外培养的神经干细胞向胆碱能神经元方向分化的影响.方法:取新生24,48 h内Wistar大鼠用于神经干细胞与小胶质细胞的原代培养,免疫组化进行鉴定.神经干细胞与小胶质细胞共同接种于6孔板,接种密度分别为10∶1,4∶1,1∶1,1∶4,1∶10,每种密度设6孔,以单纯神经干细胞作为对照,共培养3,7,14 d,观察细胞的生长情况.结果与结论:原代培养的神经干细胞聚集成球状,悬浮生长,Nestin染色阳性,胞核不着色.小胶质细胞贴壁生长,折光性强,大部分细胞有短的突起呈分支状,小胶质细胞特异性标记抗体CD11b/c染色结果显示细胞纯度在80%以上.与单纯神经干细胞对照组相比,神经干细胞与小胶质细胞以10∶1,4∶1,1∶1,1∶4,1∶10接种密度共培养组ChAT阳性细胞数均明显升高.共培养组神经干细胞与小胶质细胞比例为4∶1时升高幅度显著高于其他接种密度 (P < 0.05),且在培养第7天时生长达到高峰.结果提示小胶质细胞可以促进神经干细胞向胆碱能神经元方向分化,神经干细胞与小胶质细胞4∶1比例共培养第7天时效果最佳.     

骨形态发生蛋白2和音猬因子体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景:研究表明,骨形态发生蛋白2和音猬因子联合诱导干细胞的定向分化存在理论上的可能性,但目前联合诱导间充质干细胞的方向纷繁复杂,且众说纷纭.目的:观察骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外联合和单独应用促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-12在江苏大学临床医学院实验室完成.材料:6周龄SPF级SD大鼠10只,体质量140～160 g,雌雄不拘,用于间充质干细胞的获得、培养和传代.重组人骨形态发生蛋白2、音猬因子为PeproTech公司产品.方法:将SD大鼠的间充质干细胞分离培养后分为4组:重组人骨形态发生蛋白2组:加入100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2:音猬因子组:加入20 μg/L音猬因子:联合组:100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2联合20 μg/L音猬因子作用于SD大鼠间充质干细胞:对照组:不加任何干预措施.主要观察指标:倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化;MTT法检测细胞培养第3,6,9,12天细胞增殖数和细胞碱性磷酸酶活性;以及成骨细胞表型的检测和Ⅰ型胶原蛋白免疫印迹分析,以比较各组诱导成骨能力的差异.结果:①间充质干细胞培养24 h后部分贴壁,贴壁细胞呈圆形或椭圆形,第7天左右细胞铺满瓶底,多为梭形.条件培养基培养3 d后,联合组细胞由长梭形转变为多角形.随后重组人骨形态发生蛋白2组细胞发生成骨样改变,音猬因子组细胞未见明显形态学改变.②相同时间点联合组、重组人骨形态发生蛋白2组、音猬因子组细胞吸光度均高于对照组(P<0.05).联合组和重组人骨形态发生蛋白2组在各时间点碱性磷酸酶表达量均高于音猬因子组和对照组(P<0.05).③间充质干细胞经诱导培养7 d后,碱性磷酸酶细胞化学染色联合组和重组人骨形态发生蛋白2组呈阳性,联合组可见胞质中棕黄色颗粒,音猬因子组和对照组阴性.诱导培养14 d后,Ⅰ型胶原免疫荧光染色音猬因子组和对照组均为阴性,联合组和重组入骨形态发生蛋白2组为阳性,但联合组细胞数量明显增多,细胞间融合较好,重组人骨形态发生蛋白2组细胞融合欠佳.矿化沉积茜素红染色音猬因子组和对照组仍为阴性,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性,联合组细胞间可见红色的钙结节.④蛋白免疫印迹分析显示,与对照组相比,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组Ⅰ型胶原蛋白表达增加,联合组尤其明显,音猬因子组与之接近.结论:骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外能明显促进间充质干细胞向成骨细胞分化并且具有明显的协同相关性.     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达

背景：有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道。目的：观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。方法：取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1d后将细胞分为两组：对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原。RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;诱导7d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14时骨钙素免疫细胞化学染色、21d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义（P〈0.05）,第7天,两者表达最强。说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞。其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用。     

Brg1调控重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨细胞分化

背景:Brg1是依赖ATP的染色质改变复合物的核心催化亚基,该亚基在基因的转录调控、复制、重组,骨骼肌的分化、抑制肿瘤的发生等活动中起着重要的作用.目的:探索Brg1基因在骨形态发生蛋白2诱导成骨细胞分化过程中的调控机制.方法:采用胶原酶消化法进行小鼠颅骨成骨细胞的原代培养;分别用0,50,200 μg/L的重组人骨形态发生蛋白2诱导原代培养的成骨细胞的分化,摸索骨形态发生蛋白2的最佳作用剂量;实时荧光定量PCR和Western blot进行骨形态发生蛋白2对Brg1的作用时间的动力学分析;实时荧光定量PCR和钙钴染色法检测敲除Brg1对骨形态发生蛋白2诱导的成骨分化的影响;构建Dlx5腺病毒重组表达载体,实时荧光定量PCR和钙钴染色法检测Brg1在骨形态发生蛋白2诱导的成骨分化过程中对Dlx5的调控作用.结果与结论:用自行合成的重组人骨形态发生蛋白2可诱导原代培养小鼠成骨细胞分化,200 μg/L剂量有着较好的诱导分化效果;重组人骨形态发生蛋白2可诱导Brg1基因转录水平和翻译水平表达水平上调;敲除Brg1可抑制重组人骨形态发生蛋白2诱导的成骨分化;Brg1能够调控Dlx5的表达水平.说明Brg1通过调控Dlx5的表达水平调控重组人骨形态发生蛋白2诱导的小鼠成骨细胞的分化.     

碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用，能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨，并最终导致新骨生成；碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质于细胞的软骨与骨的分化。目的：观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响，以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计：随机对照实验。单位：解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料：培养的兔骨髓间充质干细胞。方法：实验于2004-06／12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子（100μg／L人重组骨形态发生蛋白2，100μg／L碱性成纤维生长因子，100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子）和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法，碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节Von Kossa染色观察。主要观察指标：通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果：①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化，特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖，与对照组相比，细胞增值率提高近100％；虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响，但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论：碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子，两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成，可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。     

脑源性神经营养因子对胎鼠神经干细胞向神经元方向分化的诱导

背景:神经元是中枢神经系统起主导功能的细胞,培养干细胞的最终目的是获得相应表型的神经元,从而促进中枢神经系统损伤的修复。但以往相关文献显示神经干细胞分化为神经元的比例不到30%。目的:以脑源性神经营养因子作为诱导分化剂,观察其对胎鼠源性神经干细胞向神经元方向分化的作用。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-08在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成。材料:清洁级孕14~17d的SD大鼠10只,诱导分化剂脑源性神经营养因子为Peprotech产品,胎牛血清为杭州四季青产品。方法:孕鼠处死后取出胚胎,剪碎后机械法体外分离培养神经干细胞,锥虫蓝染色计数,调整细胞密度为2×106,添加B27及碱性成纤维细胞生长因子,置于37℃、体积分数为0.05的CO2恒温箱中原代培养,待细胞克隆球明显增大、中央变暗时传代扩增。将培养所得的干细胞克隆球分为2组,诱导组添加体积分数为0.01的胎牛血清 20μg/L脑源性神经营养因子共培养,血清对照组仅添加体积分数为0.01的胎牛血清。主要观察指标:在倒置显微镜下观察细胞生长、贴壁和分化情况。诱导分化5d后,行神经元免疫组化鉴定,流式细胞仪检测神经元阳性细胞率。取原代培养未分化的神经干细胞及诱导分化3d的两组细胞,RT-PCR检测内源性bHLH基因MASH-1的表达。结果:原代培养可获得数十至数百个神经干细胞聚集在一起的神经克隆球,形态规则,立体感强;悬浮生长的克隆球经诱导分化后,逐渐失去其球状的立体外观,邻近克隆球发出的突起可相互连接,3d后即有神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞从克隆周围出现。培养的神经干细胞呈巢蛋白阳性表达,诱导分化后呈微管相关蛋白2阳性表达。与血清对照组比较,诱导组神经元阳性细胞率显著升高(χ2=16.0,P<0.05)。与未分化的神经干细胞比较,诱导组、血清对照组细胞MASH-1的表达均明显升高,且前者升高幅度明显强于后者(F=21.7,P<0.05)。结论:脑源性神经营养因子能促进神经干细胞向神经元方向分化,可能与内源性bHLH基因MASH-1的表达升高有关。     

骨形成蛋白4诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力

目的骨形成蛋白 4( bone morphogenetic protein 4,BMP4)体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力. 方法采用 BMP4体外定向诱导第五代骨髓间充质干细胞,免疫组化鉴定神经丝蛋白( NF)、胶质纤维酸性蛋白( GFAP)的表达. 结果成年大鼠骨髓间充质干细胞受 BMP4诱导后出现神经元样细胞 ,细胞免疫组化显示诱导出的神经元样细胞 NF表达阳性,诱导后 5 h, 12 h, 1 d, 3 d, 5 d和 7 d的 NF神经样细胞阳性率分别为 (40± 7)%, (71± 6)%, (58± 3)%, (53± 6)% , (37± 5)%, (13± 2)% ,诱导后 12 h,NF神经元样细胞阳性表达到高峰 ,与诱导后 5 h比较,差别有显著性 (t=1.380～ 2.621,P< 0.05). 结论 BMP4可以在体外诱导成年大鼠骨髓间充质分化为神经元.     

人胎脑神经干细胞在年幼大鼠脑内的成神经元分化

目的:脑组织中不同部位的的神经元因功能不同具有特定的细胞形态,移植的神经干细胞能不能在相应部位分化成其相应的神经元还不明确.实验拟观察人胎脑神经干细胞植入年幼大鼠脑后的成神经元分化的作用,探讨神经干细胞替代治疗小儿脑病的可行性.方法:实验于2007-04/07在海军总医院细胞实验室内完成.①实验材料:16周孕龄的人胎脑组织由海军医院妇产科提供,实验经孕妇及家属知情同意,并经医院伦理委员会批准.14只出生后10d的同窝年幼SD大鼠,雌雄不分,由北京大学医学部实验动物中心提供,为二级清洁动物,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:自孕16周的人胎脑组织分离培养神经干细胞球,在脑脊液中培养诱导分化实验以证明其分化潜能.将培养14 d的神经干细胞球移植于10 d龄大鼠侧脑室内,于移植后第4,7,14天行人神经丝特异性标志的免疫荧光分析,显示神经元的分布和细胞形态.结果:①培养获得典犁神经干细胞球,呈漂浮生长,在小儿脑脊液中能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.②采用抗人神经丝混合单抗检测移植物的成神经元分化,移植后第4天,观察到阳性反应细胞在颗粒层表现为颗粒性细胞,锥体细胞层则出现长突起的锥体细胞,还有连接神经元样中间神经元,小脑内有单层排列的浦肯野细胞.对比各时间点的观察结果,阳性细胞分布位置未变,随着移植后天数的后延,阳性细胞数量呈减少趋势,但锥体细胞的突起明显加长.结论:体外培养获得的人神经干细胞经脑室途径移植于年幼大鼠,在脑内发生迁移,并分化成形态上与其所在位置的宿主细胞一致的神经元.提示宿主脑组织微环境在引导移植物分化成神经元中发挥了重要作用,该结果对细胞替代治疗小儿脑病有重要启示意义.     

室管膜前下区神经干细胞向神经元分化中骨形成蛋白2及DLX5的作用

背景:目前神经干细胞应用的最大障碍还在于分化的调控,而对干细胞分化调控机制尚知之甚少.室管膜前下区是目前公认的神经干细胞富集区之一.在此区的神经干细胞可以长距离迁移到嗅球而保持神经干细胞不分化,最后在嗅球分化为中间神经元.骨形成蛋白2及DLX5在室管膜前下区神经干细胞向嗅球迁移分化过程中起着重要作用.目的:研究室管膜前下区神经干细胞的构筑及迁移特点,以及目前国内外有关骨形成蛋白2及DLX5在此区神经干细胞迁移分化中的作用,希望对神经干细胞的分化调控机制有一定的认识.方法:由第一作者利用中文检索词神经干细胞,室管膜前下区,骨形成蛋白2,DLX5及英文检索词neural stem cells,SVZa,BMP-2,DLX5,在PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)、中国期刊全文数据库(www.cnki.net/index.htm)、万方数据库(http://www.wanfangdata.com.cn)中检索1997-01/2009-01关于骨形成蛋白2、DLX5在室管膜前下区神经干细胞向神经元分化中作用的文献.排除内容陈旧或重复文献.结果与结论:初检得到121篇文献,中文86篇,英文35篇.最后对符合标准的28篇文献作进一步的分析.结果提示,室管膜前下区神经干细胞具有其独特细胞构筑和长距离迁移的特点,骨形成蛋白2及DLX5在其迁移分化过程中起着重要作用,但其具体作用机制仍不清楚.     

骨形态发生蛋白9诱导骨骼肌源性干细胞的成骨分化

背景：已有实验报道部分骨形态发生蛋白能够诱导间充质干细胞等向成骨细胞的分化。目的：评估骨形态发生蛋白9定向诱导骨骼肌源性干细胞成骨分化的能力。方法：采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法提取兔骨骼肌源性干细胞,用重组腺病毒的方法将骨形态发生蛋白9导入细胞,通过碱性磷酸酶定量测定、钙盐沉积实验观察骨形态发生蛋白9对于骨骼肌源性干细胞成骨分化的定向诱导作用。结果与结论：成功分离培养兔骨骼肌源性干细胞,免疫细胞化学染色80%以上的细胞呈Sca-1阳性。骨形态发生蛋白9能诱导骨骼肌源性干细胞碱性磷酸酶的表达,且能够促进细胞的钙盐沉积。提示,骨形态发生蛋白9具有定向诱导骨骼肌源性干细胞分化成骨的能力。     

不同诱导条件对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

目的:已证实骨髓间充质干细胞体内移植能改善心脏功能,但其机制尚不清楚。观察不同诱导条件对骨髓间充质干细胞体外分化为心肌样细胞的影响。方法:实验于2005-05/2006-04在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成。①实验材料:健康供体骨髓(自愿捐赠),孕16周水囊引产胎儿(胎儿家属同意捐赠)。②实验方法:取健康供体骨髓,采用淋巴细胞分离液并结合骨髓间充质干细胞贴壁特性分离细胞。取第4代骨髓间充质干细胞进行诱导实验,分为生物诱导组和化学诱导组。生物诱导组分别采用胚胎心肌细胞与骨髓间充质干细胞直接混合培养、胚胎心肌细胞与骨髓间充质干细胞间接混合培养及胚胎心肌细胞匀浆液诱导培养,化学诱导组用5,10,15μmol/L5-aza分别处理12,24,48h进行诱导。③实验评估:采用免疫细胞荧光染色法检测胞浆中的肌节肌动蛋白。结果:①骨髓间充质干细胞只有在其与胚胎心肌细胞直接混合培养时,才能分化为心肌样细胞,而在其他生物诱导模型下却未见其分化为心肌样细胞。②化学诱导组骨髓间充质干细胞经免疫细胞荧光染色鉴定后,均未见胞浆中有肌节肌动蛋白表达,证实经5-aza诱导处理后,未见骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞。结论:①胚胎心肌细胞可诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞,机械因素是促进骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞必不可少的因素之一。②骨髓间充质干细胞经5-aza诱导是否分化为心肌样细胞未能获得证实。     

骨形态发生蛋白9诱导骨骼肌源性干细胞的成骨分化

背景:已有实验报道部分骨形态发生蛋白能够诱导间充质干细胞等向成骨细胞的分化。目的:评估骨形态发生蛋白9定向诱导骨骼肌源性干细胞成骨分化的能力。方法:采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法提取兔骨骼肌源性干细胞,用重组腺病毒的方法将骨形态发生蛋白9导入细胞,通过碱性磷酸酶定量测定、钙盐沉积实验观察骨形态发生蛋白9对于骨骼肌源性干细胞成骨分化的定向诱导作用。结果与结论:成功分离培养兔骨骼肌源性干细胞,免疫细胞化学染色80%以上的细胞呈Sca-1阳性。骨形态发生蛋白9能诱导骨骼肌源性干细胞碱性磷酸酶的表达,且能够促进细胞的钙盐沉积。提示,骨形态发生蛋白9具有定向诱导骨骼肌源性干细胞分化成骨的能力。     

骨形态发生蛋白2体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:目前研究者尝试使用各种细胞因子、中药单体和组织裂解液等诱导剂作用于其分化过程,用以修复梗死的心肌组织。目的:探索骨形态发生蛋白2在大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞过程中的作用。方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。应用含有骨形态发生蛋白2的培养基定向诱导培养(对照组为普通培养基培养)72h,其后换用普通培养基继续培养4周。结果与结论:初分离的细胞经纯化培养后,显示CD29阳性、CD34阴性,符合骨髓间充质干细胞的特征,生长曲线显示各代细胞生长规律相近。经骨形态发生蛋白2体外诱导培养后,细胞形态狭长,排列紧密、方向一致。分化后的细胞均阳性表达C-TnI、C-TnT、desmin、α-sarcomericactin和P38MAPK。空白对照组则基本不表达以上蛋白。提示骨形态发生蛋白2可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌样细胞,是骨髓间充质干细胞体外心肌分化的一种新的有效诱导剂。