中国地方株人乳头瘤病毒16型E7基因一级结构及其变异

从湖北地区一宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ，采取加端聚合链反应（Ａｄｄ－ｏｎ ＰＣＲ）技术，获得了人乳头瘤病毒１６型E７基因（ＨＰＶＩ６Ｅ７）。将该基因克隆于载体ｐＵＣ１８后，进行了该基因一级结构顺序分析。完整的ＨＰＶ１６Ｅ７湖北株基因（ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ）全长２９４ｂｐ，与已发表的德国株（ＧＳ）大小一致，但其核苷酸顺序中有２处发生了变异，均为Ｃ→Ｔ变异。第４３位ＣＡＡ→ＴＡＡ使相应的谷氨酰胺密码子变为终止密码，形成无义突变（Ｎｏｎｓｅｎｓｅｍｕｔａｔｉｏｎ）。将重组质粒中０．３ｋｂ的ＨＰＶ１６Ｅ７基因在表达载体ＰＷＲ５９０－１中进行克隆，经诱导使重组表达质粒在大肠杆菌中高效表达，得到了预计的、分子量约为６９×１０~３的融合蛋白。该蛋白的表达量占菌体总蛋白量的３０％左右。该试验表明ＨＰＶ１６Ｅ７一级结构以及所编码的蛋白多肽在不同的国家和／或不同的地区可能存在着差异。本文首次报道了中国地方株ＨＰＶ１６Ｅ７基因的一级结构。     

中国地方株人乳头瘤病毒16型E7基因的高效表达

人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）至今没有合适的体外培养系统。为了研究ＨＰＶ１６Ｅ７蛋白的免疫学性质，采用分子克隆技术构建了我国地方株（湖北株ＨＢ）ＨＰＶ１６Ｅ７基因重组表达质粒。经鉴定显示：该基因在大肠杆菌中得到高效表达，分子量约为６９ＫＤ，为ＨＰＶ１６－ＨＢＥ７与载体蛋白（β－半乳糖苷酶α肽）融合蛋白。融合蛋白表达量占整个菌体蛋白含量的３０％～４０％；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果表明：融合蛋白保留了ＨＰＶ１６Ｅ７抗原决定簇的抗原性，能与Ｅ７单克隆抗体特异性结合。该表达系统的建立为进一步研究Ｅ７蛋白的免疫学性质提供了充足的材料来源     

人乳头瘤病毒16型E6E7 ORF转化作用的研究

构建了含人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）－Ｅ６Ｅ７ＯＲＦｓ（ｎｔ８３－８５５）片段和ＨＰＶ１６长控制区（ＬＣＲ）加Ｅ６Ｅ７ＯＲＦｓ片段（ｎｔ７００７－７９０４／０－８７９）的逆转录病毒载体ｐＨ２１和ｐＨ１８质粒，利用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ分别将它们导入病毒包装细胞ｐＡ３１７中，经过筛选获得Ｇ４１８抗性的病毒包装细胞，产生的重组病毒Ｈ２１和Ｈ１８感染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞都具有恶性细胞的形态学特征，并能在裸鼠体内形成肿瘤。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果证明，上述两基因片段都整合到细胞基因组中。本实验结果说明ＨＰＶ１６－Ｅ６Ｅ７基因片段是ＨＰＶ１６转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞的关键早期区，其自身ＬＣＲ区在该转化过程中没有显示出重要作用。     

中国地人株人乳头瘤病毒16型E7基因的高效表达

人乳头瘤病毒至今没有合适的体外培养系统。为了研究ＨＰＶ１６Ｅ７蛋白的免疫学性质，采用分子克隆技术构建了我国地方株ＨＰＶ１６Ｅ７基因重组表达质粒。经鉴定显示：该基因在大肠杆菌中得到高效表害，分子量约为６９ＫＤ，为ＨＰＶ１６－ＨＢＥ７与载体蛋白融合蛋白。     

人乳头瘤病毒16型转换基因的序列分析

为了解中国地区宫颈癌病人中人乳头瘤病毒１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点,从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取组织ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标本中感染ＨＰＶ型别,选单纯感染ＨＰＶ１６两例标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因后,重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。ＤＮＡ序列分析表明：两例标本的ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７序列全长均为７７６ｂｐ,与已发表的德国标准株长度相等,两     

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型L1基因的克隆及序列分析

目的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）晚期基因区（Ｌ１）编码病毒的主要衣壳蛋白,且ＨＰＶ１６感染与宫颈癌发生、发展关系密切,故对中国妇女感染的ＨＰＶ１６基因进行克隆及序列分析有重要实际意义。方法采用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）扩增了３例中国妇女宫颈癌组织中ＨＰＶ１６的Ｌ１基因片段,并对其进行了克隆及全序列分析。结果发现３个ＨＰＶ１６Ｌ１基因核苷酸序列有４处均与最初报道的ＨＰＶ１６Ｌ１ＤＮＡ序列不同,并由此引起所编码的氨基酸亦发生变化。结论中国妇女宫颈癌组织中ＨＰＶ１６Ｌ１核苷酸有一定程度变异。     

人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强

利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16,HPVl6)E6E7融合基因(fmE6E7)，研制治疗HPVl6相关疾病的DNA疫苗。用PCR扩增fmE6E7基因后，插人真核表达质粒获得pVRl012-fmE6E7，瞬时转染Cos-7细胞，免疫荧光法检测证实其表达后，在C57BL／6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫，5lCr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性Cytotoxic T lymphocyte，CTL)，间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应，与单独野生型E7基因免疫相比，E6E7融和基因可更好的活化CTT反应。表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPVl6治疗性DNA疫苗的靶基因。     

人乳头瘤病毒16型中国株L1基因的体外真核表达

目的 构建人类乳头瘤病毒16型(HPV16)中国株晚期基因L1的真核表达系统.方法 将HPV16中国株L1基因从pCR2.1/HPV16L1定向亚克隆至pTacer-CMV载体,构建重组质粒pTaeer-CMV/HPV16L1,将重组质粒用脂质体转染N1H3T3、HeLa细胞,用透射电镜、SDS-PAGE、蛋白印迹等方法观察HPV16 L1蛋白的表达.结果 NIH3T3、HeLa细胞经pTacer-CMV/HPV16L1转染后,SDS-PAGE、蛋白印迹等实验显示可表达HPV16 L1蛋白,电镜下可见病毒样颗粒(VLP).结论 pTacer-CMV/HPV16L1构建成功,可在体外表达HPV16中国株L1蛋白.     

鲍温氏病组织人乳头瘤病毒16型结构基因L1的克隆及其序列分析

本研究采用ＰＣＲ法从中国妇女鲍温氏病组织标本扩增获得了宫颈癌密切相关的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）的晚期基因Ｌ１,并装入测序载体测序分析了其ＤＮＡ的序列,与标准型进行了比较,发现有若干变异,此研究对序列及变异意义进行了分析和讨论,为今后Ｌ１基因分子流行病学调查,Ｌ１蛋白的结构与功能研究、疫苗研制以及ＨＰＶ相关的基础性研究提供了有用的资料,同时在国内外首次报道了鲍温氏病组织中ＨＰＶ１６Ｌ１的序列     

人乳头瘤病毒16型结构基因L1在昆虫细胞中的表达及其生物学活性

目的 研究与宫颈癌及人类其它多种组织癌症密切相关的人乳头瘤病毒16型（HPV16）的晚期基因L1的表达及其生物学活性。方法 采用PCR法从pBSSK-B/16L1扩增了来自中国妇女鲍温病组织标本的HPV16晚期基因L1,装入杆状病毒转移载体;在DH10Bac内通过转座子Tn7的介导,使携带有杆状病毒多角体蛋白基因启动子Ppolh的HPV16 L1基因整合入杆状病毒,形成重组杆状病毒;转染昆虫细胞Sf9进行表达;将感染72h的Sf9细胞包埋、切片、染色后,电镜观察。提取L1蛋白,免疫BALB／ c小鼠。结果 重组杆状病毒在Sf9细胞内高效表达出L1蛋白,经Western blot发现能与L1抗体特异地结合;薄层扫描显示所表达的L1蛋白占Sf9细胞总蛋白的比例高达31％。经透射电镜观察表明,在细胞核里有大量的重组杆状病毒形成;并且产生了大量的由HPV16 L1蛋白单体自组装的病毒样颗粒（virus-like particles,VLP)。小鼠免疫实验结果表明,所表达的HPV16 L1蛋白单体自组装的病毒样颗粒（virus-like particles,VLP)。小鼠免疫实验结果表明,所表达的HPV16 L1蛋白具有强免疫原性。结论 此研究为今后L1基因分子流行病学检查、L1蛋白的结构生物学研究、疫苗研制以及HPV相关基础性研究提供了有用的资料。     

人乳头瘤病毒16型E6和E7基因特征分析

目的 对北京15例宫颈癌病变组织中的人乳头瘤病毒(HPV)16型E6和E7基因进行扩增及序列测定,分析E6和E7基因突变特征,并探讨宫颈癌病变中HPV16的感染情况.方法 自行设计HPVl6型E6和E7基因扩增引物,采用PCR法扩增15例宫颈癌组织中HPV16 E6和E7片段,将PCR产物克隆到TA载体,进行序列测定.通过Sequencer、Bioedit、Mega等生物学软件对E6和E7基因进行核苷酸和氨基酸序列分析.结果 15例宫颈癌中8例鳞癌检出E6和E7基因,检出率为8/15.2例腺癌、1例腺鳞癌和其他4例鳞癌中均未检出HPV16 E6E7 DNA.8例鳞癌中的4例检出的HPVl6为亚洲类似株,在E6基因178位(T→G,D25E)和E7基因647位(A→G,N29S)发生突变;另外4例为欧洲类似株,其中1例(BJ16)的HPV16在E6基因335位点发生突变(C→T,H78Y).结论 HPV16是致宫颈癌的重要因素;宫颈鳞状细胞癌HPV16感染的发生频率较腺癌和腺鳞癌高;E6基因178位点可能是区分亚洲株和欧洲株的重要位点;E6基因178位点和E7基因647位点是突变频率较高的位点,可能导致HPV16致癌能力发生改变.     

人乳头瘤病毒（地方株）16型E7蛋白的抗原性和免疫原性研究

以融合蛋白包含体形式在大肠杆菌中高效表达了人乳头瘤病毒１６型（湖北株）Ｅ７基因（ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ）。用蛋白质印迹技术对该基因表达产物ＨＢＥ７融合蛋白的性质进行了鉴定。发现ＨＢＥ７融合蛋白能与ＨＰＶ１６Ｅ７单克隆抗体结合，表明该融合蛋白至少部分保留了Ｅ７蛋白的抗原特性。因此，将该融合蛋白免疫小鼠。３ｗｋ后，在小鼠血清中既检测到了抗载体蛋白的抗体，又检测到了特异性抗ＨＢＥ７抗体。实验表明：ＨＢＥ７     

人乳头瘤病毒16型内变异株与宫颈病变

目的 研究患宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia,CIN）的汉族妇女中人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）16型内变异株的类型及其在临床上的意义.方法 随机收集中日友好医院妇科门诊就诊的77例感染HPV16的汉族患者的宫颈脱落细胞DNA,用PCR法扩增HPV16型包含E6和E7基因的DNA片段并测序.通过对测序得到的E6基因序列与GenBank下载的参考株的比对,研究77例汉族患者中HPV16变异株的类型并探讨其与CIN的关系.结果 纳入研究的77例患者中,最小年龄21岁,最大年龄56岁,平均年龄36.39±6.86岁.其中,CIN Ⅱ级以下病变16例（占比20.8%）,CIN Ⅱ级及以上病变61例（占比79.2%）.HPV16型内变异株只有亚洲株和欧洲株两种,亚洲株38例,欧洲株39例.经χ^2检验,χ^2=0.0034,P〉0.05,尚不支持亚洲株与欧洲株的致癌作用不同.结论 虽然本研究未发现HPV16型亚洲株与欧洲株的致癌作用不同,但本研究发现77例汉族患者感染的HPV16型内变异株以亚洲株和欧洲株为主,故我们有理由推测,HPV16型内变异株在我国汉族妇女中的分布以亚洲株和欧洲株为主,而其他变异株,特别是高致癌的亚美株并不常见.     

宫颈癌患者外周血中的人乳头瘤病毒16例E6及E7蛋白…

本研究证明进展期宫颈癌患者１０／３７例和１０／４６例外周血中分别存在有ＨＰＶ１６Ｅ６和Ｅ７蛋白致敏的淋巴细胞，而４０例献血员中分别为１２．５％（５／４０）和１７．５％（７／４０）。４６例中有１７例和２５例分别进行了宫颈癌组织中的ＨＰＶ１６Ｅ６和Ｅ７基因序列检测，Ｅ６蛋白致敏淋巴细胞阳性的６例中检出与未检出Ｅ６序列的各占３例，Ｅ７蛋白致敏淋巴细胞阳性的５例中有３例未检出，有２例检出Ｅ７序列。     

人乳头瘤病毒E5基因

本文对人乳头瘤病毒早期基因之一E5基因的致癌性的分子机理进行了综述,对E5蛋白与生长因子受体的相互作用、一些癌基因的反式激活作用及细胞缝隙连接的损伤作用进行了讨论。     

含人乳头瘤病毒16型E6E7反意基因的假型逆转录病毒对人乳头瘤病毒16型转化细胞生长的抑制作用

构建了一个含人乳头瘤病毒１６型Ｅ６Ｅ７反意基因片断的逆转录病毒载体ｐＨ１９。用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将ｐＨ１９导入病毒包装细胞ｐＡ３１７，使之产生假型逆转录病毒Ｈ１９。Ｈ１９病毒感染人乳头瘤病毒１６型转化的细胞后，使转化细胞的生长速率和裸鼠体内形成肿瘤的能力均明显下降。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E2蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E2血清.方法 采用PCR技术扩增HPV16E2基因,构建入pET21b载体,重组表达载体pET21 b-HPV16E2经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达并鉴定表达产物.经纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E2蛋白.免疫BALB/c小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pET21b-HPV16 E2构建成功.表达蛋白相对分子质量(Mr)为42 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4+T细胞数量和CD4/CD8比值升高,小鼠IFN-γ无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E2蛋白和小鼠抗HPV16 E2高效价的抗血清.     

人乳头瘤病毒16型E4蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E4蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E4血清.方法 将HPV16 E4基因克隆入pQE30,重组质粒pQE30-HPV 16E4经鉴定后转化大肠埃希菌M15(PREP4),诱导表达并鉴定表达产物.因纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E4蛋白.免疫Bal B/C小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ水平、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pQE30-HPV16F4构建成功.表达分子相对分子量(Mr)为10 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4/CD8无升高,小鼠γ干扰素(IFN-γ)无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E4蛋白和小鼠抗HPV16 E4高效价的抗血清.     

人乳头瘤病毒16型E6和E7基因突变体表达蛋白的稳定性和抗原性分析

目的 筛选适合于宫颈癌治疗性疫苗研制的人乳头瘤病毒16型（HPV16）E6和E7突变基因。方法 采用定点诱变技术对E6和E7基因进行改造，得到几种E6和E7基因的突变体；构建成表达野生型和突变型E6与E7的重组痘苗病毒，对这些重组痘苗病毒表达的E6和E7蛋白的稳定性及其免疫原性进行了比较研究。结果 E6蛋白第50位氨基酸的突变、E7蛋白第24和26位氨基酸的突变都不影响蛋白的稳定性和抗原性，但E7蛋白第91位氨基酸的突变使E7蛋白的稳定性和抗原性大大减弱。结论 证实了E7蛋白C－末端的锌指结构对E7蛋白结构的完整性和稳定性是非常重要的。     

人乳头瘤病毒16型 E5基因克隆、原核表达及产物鉴定

目的 克隆HPVl6 E5基因,构建原核重组工程菌并诱导表达,对表达产物HPVl6E5蛋白进行鉴定.方法 提取宫颈癌组织DNA作为模板,用PCR方法扩增HPVl6 E5基因,经BamH I和HindⅢ双酶切后,插入相同酶切的pET21b载体质粒,转化DH5α,筛选阳性克隆.经酶切和测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),建屯重组工程菌株pET21b-HPVl6E5/BL21(DE3).经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物.结果 HPVl6 E5基因扩增片段0.27kb.测定序列与HPVl6原型株E5基因比较,出现4处核苷酸变异,分别为3979、4042、4077和4089位,引起144L和165V氨基酸改变.重组质粒经酶切和序列测定证实构建正确.SDS-PAGE分析重组菌在16 kDa处出现蛋白条带.该蛋白条带可被组氨酸标签单克隆抗体特异性识别.结论 成功克隆HPVl6E5基因,并构建原核表达质粒,E5 蛋白在BL21(DE3)中表达.本实验为进一步研究E5生物学活性、转化活性和肿瘤杀伤免疫作用奠定了实验基础.