抗体轻链可变区基因真核表达框架及抗CD3鼠/人嵌合轻链基因的构建

利用抗乙肝表面抗原的单抗２Ｈ１的轻链可变区基因的一部分，以核酸定点突变法引入ＭｌｕＩ限制性内切酶识别位点，构建了含有启动子、前导肽序列以及剪接供体信号等真核表达元件和“ＥｃｏＲＶ－Ｍｌｕ Ｉ”外显子克隆“匣”的通用的抗体轻链可变区基因真核表达框架ｐＧＥＭ－ＬＰＣＲ。从分泌ＣＤ３单抗的杂交瘤细胞中提取基因组ＤＮＡ，通过ＰＣＲ扩增及序列分析证实获得了ＣＤ３单抗轻链可变区基因的外显子。将其克隆到ｐＧＥＭ－ＬＰＣＲ中，切下完整的真核转录单位，与带有人Ｋａｐｐａ链恒定区基因及选择标记基因的表达载体相连接，成功地构建了抗ＣＤ３鼠／人嵌合轻链基因。此表达框架可用于多种抗体轻链可变区基因外显子的克隆及其真核转录单位的制备，大大简化了基因工程抗体的研制。     

抗VEGF165的嵌合抗体在小鼠骨髓瘤细胞中的表达

目的减少鼠源性单抗的免疫原性,获得抗人血管内皮生长因子１６５（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１６５,ＶＥＧＦ１６５）的人／鼠嵌合抗体。方法 将抗ＶＥＧＦ１６５鼠单抗ＶｍＤ１１鼠单抗ＶｍＤ１１的轻链可变区基因ＶＬ和重链可变区基因ＶＨ分别克隆到带有人ＩｇＧ１轻链恒定区基因ＣＫ,重链恒定区基因Ｃγ１的真核表达载体ｐＡｃｙｃ－ｎｅｏ－Ｃｋ和ｐｓｖ２－Ｃγ１上,构建了真     

抗人C1q轻链可变区基因在E.coli中的表达

应用基因工程技术，将抗人Ｃ１ｑ轻链可变区基因的重组质粒ｐＧＥＭ－Ｃ１ｑＶＬ中分离，克隆进表达载体ｐＪＬＡ５０２。该表达截体含ＣＩＴｓ８５７抑制子基因，通过开温诱导法，重组表达子在宿主菌ＨＢ１０１中表达，获得抗人Ｃ１ｑ轻链可变区片段，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明其分子量范围为１２－１３ＫＤ。这为进一步抗人Ｃ１ｑ小抗体的表达积累了经验，有利于用于抗原－抗体结构功能的研究。     

抗人Clq轻链可变区基因在E．coli中的表达

应用基因工程技术，将抗人Ｃｌｑ轻链可变区基因（ＣｌｑＶ＿Ｌ）由重组质粒ｐＧＥＭ－ＣｌｑＶ＿Ｌ中分离，克隆进表达载体ｐＪＬＡ５０２。该表达载体含ＣＩＴｓ８５７抑制子基因，通过开温诱导法，重组表达子在宿主菌ＨＢ１０１中表达，获得抗人Ｃｌｑ轻链可变区片段，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明其分子量范围为１２～１３ＫＤ。这为进一步抗人Ｃｌｑ小抗体的表达积累了经验，有利于用于抗原－抗体结构功能的研究。     

鼠抗hTNF－α单克隆抗体轻链可变区基因片段的克隆和cDNA序列测定

目的：获得鼠抗人肿瘤坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）单克隆抗体轻链可变区基因序列。方法：采用反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，以一对针对鼠Ｉｇ轻链可变区（ＶＬ）基因的引物，从分泌鼠抗ｈＴＮＦ－α单克隆抗体的Ｅ６杂交瘤细胞株中扩增和克隆ＶＬ基因片段，用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列，并进行计算机分析。结果：此ＶＬ基因长３４２ｂＰ，可编码１１４个氨基酸，为开放读框；有明确的框架区（ＦＲＳ）和抗原互补决定区（ＣＤＲＳ）；含有抗体可变区特征性的两个半胱酸残基。在基因数据库（ＥＭＢＬＧｅｎｅＢａｎｋ１９９５）中，未查见相同序列的基因。结论：此ＶＬ基因系重排的鼠Ｉｇ轻链基因。     

抗人红细胞血型B抗原单链抗体基因的构建表达

我室曾建立分泌抗Ｂ血型抗原ＩｇＭ类单克隆抗体的5Ｄ12杂交瘤细胞株[1] ,本文应用基因工程技术 ,分离和克隆了 5Ｄ12株单抗的ＶＨ 和ＶＬ 基因 ,采用重叠延伸拼接ＰＣＲ(ＳＯＥＰＣＲ )技术[2 ] 体外成功构建 5Ｄ12单链抗体基因 ,获得较高水平的表达。1　材料和方法1 1　细胞和载体　Ｅ ｃｏｌｉＴＧ1为英国Ｗｉｎｔｅｒ教授惠赠 ;质粒ｐＧＥＸ 4Ｔ 2购自Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司 ;含十五肽接头质粒ｐＳＴＥ 2 15由德国Ｄｕｂｅｌ教授惠赠。1 2　引物和试剂　用于扩增重链可变区的一对引物为ＶＨＢａｃｋ (5 ＡＧＧＴ (Ｃ/Ｇ )ＣＡＧＣＴＧ…     

抗人红细胞血型A抗原双价小分子抗体基因的构建和表达

目的 分离抗人红细胞血型Ａ抗原单抗５０Ａ可变区基因。构建并表达其双价小分子抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）融合蛋白。方法 设计合成抗体重轻链可变区引物,通过加端ＰＣＲ技术。在５０ＡＶＨ和ＶＬ基因两端引入连结短肽和适当的限制性酶切位点,体外构建５０Ａｄｉａｂｏｄｙ基因并将其克隆ｐＧＥＸ－４Ｔ－２表达载体中,在大肠杆菌中诱导高效表达。用双肿氧核苷酸链末端终止法分析其核苷酸序列。结果 序列分析表明,５０Ａｄｉａｂ     

抗胃癌鼠单抗3H11V区基因的克隆及人—鼠嵌合轻链的表达

利用前导肽序列设计引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从分泌抗人胃癌的单抗杂交瘤细胞系３Ｈ１１分离克隆了抗体的轻重链可变区基因序列。经ＤＮＡ序列分析表明所获基因含有全部前导序列，其成熟蛋白编码部分与从第一骨架区引物所克隆的序列相符。将轻链基因组建到人－鼠嵌合轻链表达载体中，转染至小鼠骨髓瘤细胞Ｓｐ２／０中，可获得人鼠嵌合轻链的表达，证明所克隆的基因具有表达活性，为人－鼠嵌合抗体的构建奠定了基础。     

直接从中国人胎肝染色体DNA中克隆粒细胞集落刺激因子（G－CSF）外显子及其在大肠杆菌中的高效表达

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，直接从正常人胎肝染色体ＤＮＡ库中分离克隆了中国人粒细胞集落刺激因子（ｃ－ＣＳＦ）外显子，全长５３７ｂｐ，它包括除信号肽氨基酸外的所有编码区，为了使克隆的Ｇ－ＣＳＦ外显子在大肠杆菌中高效表达，对其５’端进行了修饰，去除第１个编码Ｔｈｒ的密码子，在不改变氨基酸的前提下，变换为ＡＴ丰富的密码子；并将某些密码子换成大肠杆菌喜用的密码子。对于每段目的ＤＮＡ所进行的２次独立的ＰＣＲ反应所获得的产物分别进行了核苷酸序列测定。结果完全一致，证明所克隆的Ｇ－ＣＳＦ外显子的序列是可靠的，与国外发表的Ｇ－ＣＳＦ外显子序列相比，未发现变异。将上述人Ｇ－ＣＳＦ外显于基因插入ｐＢＶ２２０表达载休，构建了ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ质粒，将其转化入ＤＨ５ａ菌，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明其表达量约占菌体总蛋白量的２０％，用依赖性细胞系ＮＦＳ－６０进行测定，活性为５ｘ１０ｖＩＵ／Ｌ。     

原核分泌型表达载体的构建及癌胚抗原单链抗体的表达

目的构建分泌型载体并表达癌胚抗原单链抗体。方法以ｐＧＥＭ－１１ｚｆ（＋）为基础，插入化学合成的１４个寡核苷酸片段（共１７６ｂｐ），构建成含核糖体结合位点（ＲＢＳ）、翻译起始点（ＡＴＧ）、果胶酶信号肽基因（ｐｅｌＢ）和翻译终止点（ＴＡＡ）的分泌型表达载体（ＲＰＹ）。化学合成带有抗体重、轻链可变区基因插入位点和惰性连接序列的８２ｂｐ片段，并克隆到ＲＰＹｐｅｌＢ信号肽的下游，构建成抗体分泌型表达载体ＲＰＹＡ。将ＣＥＡ单抗重、轻链可变区基因（ＶＨ、ＶＬ）插入到ＲＰＹＡ的相应位点，转化大肠杆菌ＨＢ２１５１，ＩＰＴＧ诱导表达。结果序列测定表明ＲＰＹＡ的序列与原设计序列一致，免疫印迹实验表明表达产物具有ＣＥＡ结合活性，分子量为２．６×１０３，胞浆内结合有ｐｅｌＢ信号肽的表达产物分子量为３２×１０３。结论ＲＰＹＡ载体可用于单链抗体基因的表达     

抗人ClqMcAb轻、重链可变区基因的克隆、序列分析及轻链可变区基因的表达（摘要）

抗人ＣｌｑＭｃＡｂ轻、重链可变区基因的克隆、序列分析及轻链可变区基因的表达（摘要）陈克敏，朱锡华应用ＰＣＲ技术，从一株抗人ＣｌｑＭｃＡｂ杂交瘤细胞基因组ＤＮＡ及反转录合成ｃＤＮＡ中，扩增、克隆分别获得抗人Ｃｌｑ轻、重链可变区基因，序列分析表明：抗人Ｃ...     

抗人TNF-α单抗基因的克隆及鉴定

目的克隆抗人ＴＮＦ－α鼠单抗得可变区基因以构建人－鼠嵌合抗体表达载体。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,以前导肽序列的引物从１个分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因（Ｖκ,ＶＨ）,在大肠杆菌中表达Ｆａｂ段核实其功能活性。结果分别得到了２个Ｖκ和２个ＶＨ基因。ＤＮＡ序列测定表明,其中１个轻链可变区基因为骨髓瘤细胞系中固有的无功能基因。１个重链可变区基因经原核系统表达测活表明无抗体活性。另一个轻链和重链可变区基因的成熟蛋白编码部分与从第一骨架区引物所克隆的、可在大肠杆菌表达出抗体活性的Ｖκ、ＶＨ序列相符。将该轻链、重链基因分别克隆到了人－鼠嵌合轻链、重链表达载体中。结论通过原核表达系统核实,获得了抗ＴＮＦ－α单抗的可变区基因     

抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达

目的 将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ从两株抗ＭａｇａｉｎｉｎⅡ杂交瘤细胞株（２Ｄ１,３Ｆ８）中克隆出ＶＨ和ＶＬ基因,然后利用重组ＰＣＲ技术,将ＶＨ和ＶＬ基因通过柔性肽段（ＧＬＹ４Ｓｅｒ）３的Ｌｉｎｋｅｒ拼接成单链抗体基因（ＳｃＦｖ）,将ＳｃＦｖ克隆到表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ上并将其分别在大肠杆菌Ｅ．ｃｏｋｉ ＨＢ２１５１及ＴＧ１中进行     

抗骨形成蛋白（BMP）单链抗体的构建

从一株鼠抗ＢＭＰ单克隆抗体杂交瘤中扩增出其可变区基因片段，并将其分别克隆入ＰＵＣ１８、１９载体，利用双脱氧链终止法进行序列测定和计算机分析后，应用一段人工合成的含１５个氨基酸的连接肽，将重链基因的Ｃ端和轻链基因的Ｎ端连接起来，构建成单链抗体。将其克隆入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，在大肠杆菌ＪＭ１０９中获得初步表达。     

跨膜型CD59分子的构建及其在小鼠NIH3T3和EL-4细胞表达的研究

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ中扩增得到编码人ＣＤ４６分子跨膜区和膜内区ｃＤＮＡ片段,用ＰＣＲ方法扩增得到编码成熟的ＣＤ５９胞外区蛋白的ｃＤＮＡ片段,连接并构建了跨膜型的ＣＤ５９分子ｃＤＮＡ。快速克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体进行序列测定,证实了其阅读框的完整和序列的正确性。     

中国株白喉杆菌白喉毒素全基因编码序列的克隆及其…

通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）从一中国株中型白喉产毒杆菌的β噬菌体基因组中克隆出１０６５碱基对的白喉毒素全基因编码序列，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ／载体系统，经有关限制性内切酶消化，核苷酸序列分析表明，成功的克隆出白喉毒素全基因编码序列。利用上下游引物中导入的Ｎｄｅ Ⅰ和ＢａｍＨ Ⅰ位点，将白喉毒素基因插入原核表达载体ＰＥＴ－３ａ，从而构建出白喉毒素表达载体ＰＥＴ／ＤＴ。以ＢＬ２１（ＤＥ３）     

AMPLIFICATION AND CLONING OF THE VARIABLE GENES OF MOUSE MONOCLONAL ANTIBOBY TO HUMAN C1q BY IN-CELL PCR AND SEQUENCE ANALYSIS

免疫球蛋白可变区信息包含了Ｂ淋巴细胞克隆产生的分子机制，对了解抗原、抗体间相互作用及在自身免疫中的作用机制具有重要意义。本研究应用两对通用引物，采用细胞内ＰＣＲ，从分泌高亲和力抗人Ｃ１ｑ单抗杂交瘤细胞扩增其轻、重链可变区基因。即杂交瘤细胞以４％多聚甲醛固定，经ＮＰ４０处理增加膜通透性后，直接作细胞内反转录合成ｃＤＮＡ，继以ｃＤＮＡ为模板作细胞内ＰＣＲ，从而无需提取细胞ＲＮＡ或ＤＮＡ便扩增获得轻、重链Ｖ基因。同时，通过建立快速、高效、高分辨率毛细管电泳技术检测ＰＣＲ扩增产物，达到ＰＣＲ扩增及检测的自动化。扩增的轻、重链可变区基因分别克隆进ｐＧＥＭ－１１Ｚｆ（－）并作序列测定。计算机序列分析及同源性检索证实所克隆基因片段归属鼠免疫球蛋白家族。按Ｋａｂａｔ分类标准，抗－Ｃ１ｑ轻链Ｖ基因（Ｖκ）属鼠Ｉｇ第Ｖ组，而其重链Ｖ基因（ＶＨ）属ⅡＢ组。令人感兴趣的是，抗－Ｃ１ｑＶκ与自身抗体的Ｖκ高度同源，而抗－Ｃ１ｑＶＨ主要与胚系基因及某些自身抗体显著同源（达７５％以上）。由胚系基因编码的不同特异性抗体往往具有与自身抗原结合特性，自身抗体亦多由胚系基因编码。因此，本株高亲和力抗－Ｃ１ｑＩｇＧ与胚系基因及自身抗体Ｖ基因密切相     

抗人血管生长素噬菌体基因工程单链抗体的初步制备

采用ＰＣＲ等分子克隆实验手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗人血管生长素抗体可变区重，轻链基因，以ＤＮＡ接头连接后与噬菌粒ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ重组转化大肠杆菌形成抗体可变区基因库。通过噬苏体表面表达技术把抗体可变区表达在噬菌体表面，。     

人CD19基因在痘苗系统中的表达

目的 在痘苗系统中表达人ＣＤ１９基因,为研究ＣＤ１９分子的豚研制抗ＣＥ１９的单克隆抗体（ｍＡｂ）打下基础。方法 用ＰＣＲ技术扩增人ＣＤ１９全长基因,并 组人克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ,进行序列测定。将ＣＤ１９全长基因克隆人痘苗表达载体ｐＪＳＡ１１７５中,用脂 本介导的方法,与野生 人转染ＴＫ－１４３细胞。运用蓝斑筛选获避人ＣＤ１９全长基因的重组痘苗病毒,并用此重组病毒感染ＴＫ－１４３细胞,以ＡＰＡＡＰ法     

中国人血友病甲患者FⅧ基因突变研究

为研究血友病甲发病的分子机理，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合限制性内切酶ＴａｑⅠ酶切分析和ＰＣＲ结合变性梯度凝胶电泳（ＰＣＲ－ＤＧＧＥ），分别研究了７４名中国血友病甲患者ＦⅧ基因外显子１８、２２～２４、２６和外显子８与１４的３′端的基因突变情况，结果检测到一例基因突变，该突变位于第２４号外显子２２０９位密码子，ＣＧＡ－ＴＧＡ，导致了终止密码子的产生。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ发现２例基因突变，分别位于外显子８的３４９位密码子，ＧＡＴ－ＧＡＧ，导致Ａｓｐ３４９Ｇｌｕ和外显子１４的１６８９位密码子，ＣＧＣ－ＴＧＣ，使Ａｒｇ１６８９Ｃｙｓ。血友病甲基因突变的研究将有助于开展遗传咨询和产前诊断工作。