基于PI3K/Akt/mTOR信号通路调控巨噬细胞自噬探讨黄芪甲苷抗动脉粥样硬化的作用机制

目的观察黄芪甲苷对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的调控,研究黄芪甲苷抗动脉粥样硬化的作用机制。方法体外细胞实验中,将小鼠巨噬细胞RAW264.7随机分为5组,即对照组、黄芪甲苷组、康士得组、雷帕霉素组以及si RNA组。分别用黄芪甲苷含药血清、Akt抑制剂康士得、mTOR抑制剂雷帕霉素及mTOR-si RNA体外处理RAW264.7细胞48 h,透射电镜观察巨噬细胞自噬体的变化,免疫荧光法及Western blotting法检测微管相关蛋白LC3-II表达,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western blotting法检测Akt、mTOR及自噬相关蛋白Beclin 1的表达,ELISA检测RAW264.7细胞分泌炎症因子白细胞介素-4(IL-4)、IL-10、IL-2和γ-干扰素(IFN-γ)水平。体内实验采用HE染色检测各组小鼠主动脉横截面病理损伤程度;q RT-PCR和Western blotting法分别检测小鼠主动脉组织中Akt、mTOR的mRNA和蛋白表达。结果体外实验结果显示,与对照组比较,黄芪甲苷含药血清组和各抑制剂组细胞透射电镜下观察到自噬体明显增多(P0.05),LC3-II和Beclin1蛋白的表达水平明显上调(P0.05),而Akt及mTOR的mRNA及蛋白表达水平明显减少(P0.05),巨噬细胞分泌的IL-10明显降低,而分泌的IFN-γ显著增加(P0.05)。小鼠主动脉HE染色结果显示,与模型组比较,黄芪甲苷组小鼠血管各层结构正常,排列整齐,局部有小灶性的钙化颗粒物沉积,病变轻、斑块小,泡沫细胞和脂质减少,弹力板基本完整,病变程度明显较轻,并较各抑制剂组轻。黄芪甲苷组小鼠主动脉组织Akt、mTOR的mRNA和蛋白表达均较低(P0.05)。结论黄芪甲苷抑制动脉粥样硬化斑块的形成机制与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路、抑制炎症反应有关。     

基于TLR3/TLR9介导巨噬细胞自噬/极化效应探讨血管软化丸抗AS的作用机制

目的:观察血管软化丸通过对TLR3的影响,调控PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而对巨噬细胞自噬产生影响,以及观察血管软化丸通过对TLR9的影响,调控下游NF-κB和IRF7信号途径,影响巨噬细胞M2/M1平衡,探讨血管软化丸抗动脉粥样硬化(AS)的分子机制。方法:体外实验,将巨噬细胞随机分为6组,即对照组(空白血清),血管软化丸高剂量组、血管软化丸中剂量组、血管软化丸低剂量组、ODN组(TLR9激动剂:ODN1826)、poly组(TLR3激动剂:poly(I:C))。体内实验,将ApoE~(-/-)小鼠分为6组,对照组(生理盐水,灌胃)血管软化丸高剂量组(浓度为3.456 g/mL),血管软化丸中剂量组(浓度为1.728 g/mL)、血管软化丸低剂量组(浓度为0.864 g/mL)、ODN组(ODN1826,腹腔注射)、poly组(poly(I:C),腹腔注射),腹腔注射每周两次,灌胃每日1次,连续给药8周后取材进行检测。观察血管软化丸含药血清和TLR9对巨噬细胞的极化状态的影响,对动脉斑块iNOS和CD206的表达的影响,对巨噬细胞(M1/M2)平衡相关炎症因子的影响和对巨噬细胞(M1/M2)平衡相关炎症因子的影响;采用ELISA法检测细胞分泌炎性因子相关水平,采用Western blot检测和RT-PCR法检测血管软化丸对主动脉斑块TLR9和TLR3及其下游信号分子表达的影响,观测指标:采用Western blot检测各组细胞TLR9的蛋白含量,及主动脉TLR9及其下游的分子MyD88,p-NF-κB和IRF7的蛋白含量;采用流式细胞术和免疫化学荧光检测各组细胞M1型和M2型的比例;采用RT-PCR和ELISA法检测各组细胞TNF-α的表达;采用RT-PCR和免疫荧光检测RAW264.7细胞和动脉斑块的M1型和M2型巨噬细胞的相关标志性因子和炎症因子;病理学检测验证血管软化丸抗动脉粥样硬化的疗效。结果:血管软化丸含药血清可以诱导巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞的标志CD206;中药组斑块中iNOS的荧光密度表现为低表达(P0.05),而斑块中CD206的荧光密度则表现为高表达(P0.05);血管软化丸含药血清调低IL-1β、iNOS、Ciita表达(P0.05),调高Ym1、Fizz1表达水平(P0.05);能够改善细胞分泌炎性因子IFN-γ和IL-10相关水平(P0.05);血管软化丸含药血清调低TLR9蛋白和TLR3蛋白表达水平(P0.05);血管软化丸含药血清调低TLR9下游信号MyD88、p-NF-κB、IRF7 mRNA表达水平(P0.05);血管软化丸含药血清调低TLR3下游信号LC3Ⅱ、Beclin、Akt、mTOR mRNA表达水平(P0.05)。结论:血管软化丸通过影响TLR9,调控下游NF-κB和IRF7信号途径,进而调节巨噬细胞M2/M1平衡;通过调控TLR3影响PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而调节巨噬细胞自噬,抑制动脉粥样硬化的发生发展。     

加味四妙勇安汤颗粒剂含药血清对兔肺泡巨噬细胞PI3K/Akt信号通路的影响

目的观察加味四妙勇安汤颗粒剂含药血清对CP-Rb001兔肺泡巨噬细胞PI3K/Akt信号通路的影响,探讨其治疗动脉粥样硬化的作用机制。方法采用高、中、低剂量加味四妙勇安汤颗粒剂溶于水灌胃干预日本大耳白兔,制备含药血清;经MTT法观察各浓度含药血清对细胞增殖的影响后,选择各剂量浓度为20%的含药血清干预体外培养的兔肺泡巨噬细胞,采用荧光定量PCR方法检测自噬相关基因Beclin-1、LC3 mRNA表达水平;Westernblot检测Beclin-1、LC3、Akt、p-Akt和mTOR、p-mTOR蛋白的表达变化。结果与正常对照组血清相比,在10%~40%的浓度范围内加味四妙佤勇安汤颗粒剂含药血清的OD值与正常对照组的OD值比较无明显差异(P>0.05);加味四妙勇安汤颗粒剂各剂量组含药血清Beclin-1、LC3mRNA及蛋白的表达均显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而p-Akt和p-mTOR蛋白的表达显著低于正常对照组(P<0.05),Akt及mTOR蛋白表达与正常对照组比较无明显差异(P>0.05)。结论加味四妙勇安汤颗粒剂含药血清具有抗动脉粥样硬化的作用,可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活,诱导巨噬细胞的自噬活动,减少斑块内巨噬细胞的浸润,进而达到稳定动脉粥样硬化易损斑块的目的。     

定心方抑制PI3K/Akt通路减轻脂质运载蛋白-2诱导巨噬细胞炎症反应的机制研究

目的：探讨定心方（DXR）含药血清对脂质运载蛋白-2(LCN2)诱导巨噬细胞炎症反应的保护作用及机制。方法：以LCN2作用RAW264.7巨噬细胞,分别加入空白血清、5%DXR含药血清、PI3K抑制剂LY294002及Akt抑制剂Triciribine,CCK-8法检测RAW264.7巨噬细胞活力,ELISA法检测细胞培养液炎症标记物白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超敏C反应蛋白（hs-CRP）水平,Western blot检测巨噬细胞中IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表达,透射电镜检测巨噬细胞自噬小体数量,免疫荧光标记自噬标记物LC3-II。结果：与LCN2组比较,DXR含药血清可显著减轻由LCN2诱导的巨噬细胞活力的下降,减少细胞培养液IL-6、TNF-α、hs-CRP水平,下调巨噬细胞中IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表达,增加巨噬细胞自噬小体数量,增加自噬标记物LC3-II表达,均有统计学意义（P<0.05）。与DXR含药血清组比较,LY294002及Triciribine可进一步加强DXR含药血清功效（P<0.05）。结论：...     

血管软化丸治疗脑梗死对血栓相关因子和自噬的影响

目的:观察血管软化丸治疗脑梗死对血栓相关因子和自噬的影响。方法:80例随机分为观察组和对照组各40例。两组均用常规疗法,观察组加用血管软化丸治疗。治疗4周后观察治疗前后血浆HCY、VWF和GMP-140等血栓相关因子水平,检测血清中微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)和自噬相关蛋白Beclin1表达量。结果:观察组Hcy、VWF和GMP-140血栓相关因子水平与治疗前降低(P0. 05)、并低于对照组(P0. 05)。观察组LC3-Ⅱ、Beclin1表达量与治疗前及对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。观察组NIHSS积分和BI积分较治疗前明显改善,且改善程度大于对照组(P0.05)。结论:血管软化丸能够降低血栓相关因子水平,改善自噬相关指标。     

薯蓣皂苷元对人骨肉瘤细胞自噬的影响

目的 探讨薯蓣皂苷元对人骨肉瘤细胞自噬的影响。方法 MTT法检测薯蓣皂苷元对人骨肉瘤MG63和U2OS细胞增殖的影响,透射电镜技术观察细胞超微结构,免疫荧光法观察细胞自噬蛋白Beclin1表达,Western blot法检测细胞自噬分子标记物LC3、Beclin1和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达。薯蓣皂苷元联合PI3K通路抑制剂LY294002处理MG63和U2OS细胞,RT-qPCR法检测细胞Beclin1 mRNA表达;联合自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)处理MG63和U2OS细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率,Western blot法检测细胞cleaved-caspase3蛋白表达,RT-qPCR法检测细胞caspase3 mRNA表达。结果 薯蓣皂苷元能抑制骨肉瘤MG63和U2OS细胞增殖,促使自噬体生成,增加LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达(P<0.05,P<0.01),降低LC3 I蛋白表达(P<0.01),可抑制PI3K/Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平(P<0.05,P<0.01);联合自噬抑制剂干预后...     

健脾益肾化痰方通过VEGF/PI3K/AKT/FOXO1诱导肺鳞癌SK-MES-1细胞自噬的实验研究北大核心CSCD

目的:观察健脾益肾化痰方含药血清对肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖、凋亡、自噬及SK-MES-1细胞内Beclin1、LC3、VEGFR、PI3K、AKT、FOXO1相关蛋白的影响,探讨健脾益肾化痰方通过上述蛋白诱导肺鳞癌细胞SK-MES-1自噬的可能作用机制。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、32.2 g/kg健脾益肾化痰方组,各组分别灌胃生理盐水或药物,连续7 d后收集血清;采用CCK-8法测定人肺鳞癌细胞株的存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡;激光共聚焦显微镜观察GFP-LC3脂质体转染干预肺鳞癌细胞后自噬发生情况;Western Blot法检测对人肺鳞癌细胞株SK-MES-1细胞Beclin1蛋白和LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、VEGFR、PI3K、AKT、FOXO1相关蛋白表达的影响。结果:32.2 g/kg健脾益肾化痰方含药血清各浓度组均能够有效抑制肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖,其抑制率与药物浓度呈正相关;与正常对照组相比,32.2 g/kg健脾益肾化痰方16%含药血清组使SK-MES-1细胞凋亡率明显增高(P<0.05);8%、16%含药血清组自噬小体显著增多(P<0.05);16%含药血清组SK-MES-1细胞内自噬相关蛋白Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ表达显著上调(P<0.01);FOXO1蛋白表达显著上调,VEGFR、PI3K、AKT蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论:健脾益肾化痰方含药血清能够诱导肺鳞癌SK-MES-1细胞发生自噬,其作用机制可能是通过调节VEGF/PI3K/AKT/FOXO1信号通路,上调SK-MES-1细胞内Beclin1、LC3蛋白表达,促进LC3B-Ⅰ转化为LC3B-Ⅱ有关。     

基于miR-33a调控ABCA1表达探讨血管软化丸抗动脉粥样硬化的作用机制

目的:通过观察血管软化丸是否通过调控miR-33a,进而影响下游信号ABCA1的表达,促进巨噬细胞内胆固醇流出,研究血管软化丸抗动脉粥样硬化的作用机制。方法:通过病理学检测观察血管软化丸对动脉粥样硬化的影响,通过体外实验建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,然后用血管软化丸含药血清处理,Real-Time PCR技术检测细胞miR-33a表达。细胞随机分为空白对照组、血管软化丸含药血清处理组、血管软化丸含药血清+miR-33a mimic处理组,RT-PCR和Western blotting法检测细胞ABCA1 mRNA和蛋白表达,油红O染色和高效液相色谱法检测细胞内脂质含量,[3H]法检测细胞内胆固醇流出。结果:体内实验显示,各中药组血管各层结构正常,排列整齐,局部有小灶性的钙化颗粒物沉积,病变轻,斑块小,泡沫细胞和脂质减少,弹力板基本完整,病变程度明显低于空白对照组。与空白对照组相比,血管软化丸高、中、低三个剂量组小鼠主动脉的miR-33a表达量降低、ABCA1基因和蛋白相对表达量均升高,差异有统计学意义(P0.05)。体外实验显示,在不影响细胞活性状况下,血管软化丸含药血清呈浓度和时间依赖性下调miRNA33a表达;血管软化丸含药血清能明显上调ABCA1 mRNA和蛋白的表达,但能被转染miRNA33mimic抑制;血管软化丸含药血清可减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中的脂质蓄积,但能被细胞中转染miRNA33 mimic所弱化;EGCG减少细胞内胆固醇蓄积是与其促进细胞内胆固醇流出有关,细胞中转入过量miRNA33a可以抑制胆固醇流出。结论:血管软化丸可通过减少miRNA33a的生成,进而上调ABCA1表达,促进巨噬细胞中胆固醇流出,这可能是血管软化丸抗动脉粥样硬化作用的分子机制之一。     

解毒活血方调控PI3K/Akt/mTOR信号通路对ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠斑块稳定性的影响

目的 研究解毒活血方是否可通过调控磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路诱导巨噬细胞自噬抑制炎症反应稳定AS易损斑块。方法 30只高脂饲料喂养ApoE^-/-小鼠随机分为模型组、解毒活血方（中药）低、中、高剂量组、雷帕霉素组,6只普通饲料喂养的ApoE^-/-小鼠为正常组,6只普通饲料喂养的C57BL/6J小鼠为空白组,造模7周后开始灌胃给药,中药组予解毒活血方溶液（5.35、10.7、21.4 g·kg^-1·d^-1）,雷帕霉素组予自噬诱导剂雷帕霉素（2 mg·kg^-1·d^-1）,连续给药4周,余各组予等容积生理盐水。检测血清血脂及炎症因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、白细胞介素-6（IL-6）水平,苏木素-伊红（HE）染色观察主动脉根部血管壁病理变化,免疫组化法测定巨噬细胞/单核细胞单克隆抗体（MOMA-2）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达水平,透射电镜观测主动脉自噬体数量,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测巨噬效应蛋白（Beclin-1）、自噬相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白及PI3K、Akt、mTOR通路蛋白水平。结果 与正常组比较,模型组血清血脂和炎症因子MCP-1、IL-6水平升高（P<0.05）,MOMA-2、α-SMA蛋白表达减少（P<0.05,P<0.01）,自噬蛋白Beclin-1表达增加（P<0.05）,通路蛋白PI3K、Akt、mTOR表达减少（P<0.05,P<0.01）;主动脉内壁可见明显粥样斑块,斑块内可见炎性细胞浸润,斑块附着处血管内膜明显增厚且结构紊乱;自噬体和线粒体数量更少,且线粒体结构不完整。与模型组比较,中药组及雷帕霉素组总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）水平和MCP-1、IL-6水平降低（P<0.05）,高密度脂蛋白（HDL）水平升高（P<0.05）,MOMA-2、α-SMA蛋白表达减少（P<0.05,P<0.01）,Beclin-1、LC3Ⅱ表达增加（P<0.05,P<0.01）,PI3K、Akt、mTOR表达减少（P<0.05,P<0.01）;主动脉内壁可见少量粥样斑块,炎性细胞浸润程度及血管壁厚度减轻;自噬体和自噬溶酶体数量增多。结论 解毒活血方改善AS小鼠脂质代谢,增强巨噬细胞自噬活性,减轻AS炎症反应,提高易损斑块稳定性,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活化有关。     

稳斑汤含药血清对巨噬细胞泡沫化自噬相关蛋白LC3B和Beclin 1表达的影响

目的探讨稳斑汤防治动脉粥样硬化的可能作用机制。方法 20只SD大鼠随机分为空白组及稳斑汤低、中、高浓度组各5只。稳斑汤低、中、高浓度组分别给予稳斑汤4.275、8.55、17.1 g/(kg·d)灌胃,空白组给予4 ml蒸馏水灌胃,每天1次,连续灌胃7天。灌胃第8天腹主动脉取血,离心后分离血清。体外培养小鼠巨噬细胞,分为空白对照组、模型组、雷帕霉素组及稳斑汤低、中、高浓度组,每组6孔。除空白对照组外其余各组均进行巨噬细胞泡沫化。空白对照组及模型组予10%大鼠空白血清培养;雷帕霉素组用雷帕霉素10μl/孔(终浓度10 nmol/L)培养;稳斑汤低、中、高浓度组分别用10%稳斑汤低、中、高浓度含药血清200μl/孔培养。48h后收集细胞,在透射电镜下观察各组细胞自噬体的变化,Western Blot法检测各组细胞LC3B和Beclin 1蛋白表达水平。结果透射电镜下观察到,空白对照组无明显自噬体出现,模型组可见少量自噬体出现;与模型组比较,稳斑汤各浓度组与雷帕霉素组的自噬体数量均明显增加,雷帕霉素组数量更多。与空白对照组比较,其余各组LC3B和Beclin 1蛋白表达水平均升高(P<0.05);与模型组比较,稳斑汤各浓度组及雷帕霉素组LC3B和Beclin 1蛋白表达水平均升高(P<0.05);与雷帕霉素组比较,稳斑汤高浓度组LC3B和Beclin 1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论稳斑汤含药血清能够上调巨噬细胞泡沫化自噬相关蛋白LC3B和Beclin 1表达,促进泡沫化的巨噬细胞的自噬,从而抑制巨噬细胞泡沫化的进展,这可能是稳斑汤防治动脉粥样硬化的分子机制之一。     

理中汤合四神丸对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠JNK/Beclin 1/Bcl-2信号通路相关蛋白及基因表达的影响

目的观察以温补脾肾法为指导的理中汤合四神丸对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎(UC)大鼠的影响,探讨其可能的作用机制。方法制备脾肾阳型UC大鼠模型,将成模大鼠随机分为模型组、柳氮磺吡啶组(SASP组)、肠胃宁组和理中汤合四神丸低、中、高剂量组,每组16只,同时设空白组16只。各给药组予相应药物灌胃,空白组和模型组予等体积蒸馏水灌胃,连续21 d。观察大鼠结肠黏膜组织损伤情况,对结肠黏膜损伤指数(CMDI)进行评分;HE染色观察大鼠结肠组织病理变化;免疫组化和RT-qPCR分别检测大鼠结肠组织JNK1、Beclin 1、Bcl-2、LC3B蛋白和m RNA表达;Western blot检测大鼠结肠组织JNK1、p-JNK1、Bcl-2、p-Bcl-2、Beclin 1和LC3B蛋白表达,并计算LC3BⅡ/LC3BⅠ比值。结果与空白组比较,模型组大鼠CMDI评分显著升高(P<0.01),结肠组织腺体排列紊乱,黏膜层消失,有大量炎性细胞浸润,黏膜基层与基底层分界不清;结肠组织JNK1、Beclin 1、Bcl-2、LC3B mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01),p-JNK1、p-Bc...     

养心康片通过Akt/AMPK-mTOR通路对心肌梗死后心力衰竭模型兔心肌细胞自噬的影响

目的观察养心康片通过Akt/AMPK-mTOR通路对心肌梗死后心力衰竭模型兔心肌细胞自噬的影响。方法对实验兔应用结扎冠脉的方法建立心肌梗死后心力衰竭兔模型,随机分为模型组、养心康组、AMPK抑制剂组、Akt抑制剂组和mTOR抑制剂组。并另取不造模的兔设立空白对照组。每组5只,共30只。造模后第3天开始分别给予相应的处理措施,共4周。观察养心康片对模型兔心肌beclin 1、LC3蛋白表达,心肌beclin 1和Atg5 mRNA的表达的影响,电镜检测各组心肌细胞超微结构。结果养心康组的beclin 1 mRNA的表达量、beclin 1蛋白表达量较模型组、mTOR抑制剂组降低(P<0.05或P<0.01),较空白对照组、AMPK抑制剂组升高(P<0.05或P<0.01);养心康组的LC3-Ⅱ/LC3-I比值较模型组、mTOR抑制剂组降低(P<0.05),较空白对照组、AMPK抑制剂组升高(P<0.05)。养心康组的Atg5 mRNA表达量较模型组降低(P<0.05),较空白对照组、AMPK抑制剂组升高(P<0.05或P<0.01)。电镜结果显示养心康组的自噬体、自噬体溶酶体数量较模型组、Akt抑制剂组和mTOR抑制剂组降低减少,较AMPK抑制剂组增多。结论养心康片可通过干预Akt/AMPK-mTOR通路调控心肌细胞自噬水平,改善心肌梗死后心衰模型的心肌细胞超微结构。     

更年汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞PI3K/Akt/m TOR通路的影响

目的研究更年汤对围绝经期模型大鼠颗粒细胞磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素蛋白(m TOR)信号通路的影响。方法 10～14月龄雌性SD大鼠150只,筛选出围绝经期模型大鼠,随机分为模型组、替勃龙组(0.22 mg/kg)和更年汤低、中、高剂量(1.0、2.0、4.0 g/kg)组,连续ig给药15 d,1次/d,第15天后采血,制备大鼠含药血清;3～4月龄雌性SD大鼠120只,筛选出动情前期老鼠,剔出卵巢行体外颗粒细胞原代培养,分别用各组含药血清培养液培养颗粒细胞,72～120h后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测颗粒细胞中PI3K、Akt、m TOR、生长分化因子9(GDF9)、翼状螺旋转录因子2(FOXL2)mRNA表达水平;Western blotting法检测PI3K、Akt、mTOR、GDF9、FOXL2蛋白表达。结果与模型组比较,替勃龙组和更年汤各剂量组卵巢颗粒细胞中PI3K、m TORm RNA和蛋白表达水平均显著升高(P0.05、0.01),Akt mRNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05、0.01),GDF9、FOXL2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P0.01)。结论更年汤含药血清在临床剂量上可提高卵巢颗粒细胞PI3K、mTOR的表达,抑制Akt及其下游的GDF9、FOXL2表达,从而推测更年汤可调节卵泡的生长发育,抑制卵泡闭锁、改善卵巢功能。     

定坤丹对宫腔粘连大鼠血管生成及PI3K/AKT/mTOR通路的影响研究

目的：观察定坤丹对宫腔粘连（IUA）大鼠的防治作用机制。方法：SD大鼠60只，按体质量随机分为空白组、模型组、戊酸雌二醇组、定坤丹低剂量组、定坤丹中剂量组、定坤丹高剂量组等6组，每组10只。采用机械刮宫+脂多糖（LPS）感染双重损伤法制备IUA模型，戊酸雌二醇组给予0.3 mg/kg灌胃，定坤丹低剂量组、中剂量组、高剂量组给予不同剂量灌胃治疗，1次/d，持续28 d。HE染色观察大鼠子宫组织形态变化，Masson染色观察子宫内膜纤维化面积比，酶联免疫吸附试验检测血清血管内皮生长因子、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）水平，免疫组织化学法观察子宫内膜血管内皮生长因子的表达，蛋白质印迹法及反转录PCR检测子宫组织磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)通路的蛋白和mRNA表达。结果：定坤丹能有效促进IUA大鼠损伤子宫的愈合，减少子宫组织纤维化面积，降低血清中血管内皮生长因子、IL-6和IL-8水平，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）；经定坤丹各剂量治疗后，大鼠子宫内膜中血管内皮生长因子的表达较模型组明显减少（P<0.05）；子宫组织中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白和mRNA表达水平明显下调（P<0.05）。结论：定坤丹对IUA大鼠具有较好的治疗效果，其机制可能与下调PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白的表达，抑制血管增生及炎症介质的分泌相关。     

活血消瘿方含药血清调控AMPK/mTOR通路对脂多糖诱导的甲状腺滤泡上皮细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨活血消瘿方含药血清对脂多糖(LPS)诱导的甲状腺滤泡上皮细胞(TFECs)自噬和凋亡的影响以及作用机制。方法 光学显微镜观察分离培养的SD大鼠TFECs细胞的形态;免疫荧光染色鉴定TFECs中特异抗原甲状腺球蛋白(Tg)。取对数生长期的TFECs,分为对照组、LPS组、含药血清组、含药血清+compound C(AMPK抑制剂)组、含药血清+MHY1485(mTOR激活剂)组,MTT法检测各组细胞活力;绿色荧光蛋白(GFP)标记质粒转染检测各组细胞自噬小体变化;流式细胞术检测各组细胞凋亡;western blot检测各组细胞中微管相关蛋白1轻链3(LC3)I、LC3II、Beclin1、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)及AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白表达。结果 光学显微镜观察显示,TFECs形态为梭形、形态均一,且可成簇生长。免疫荧光结果显示,TFECs细胞质中可见较强的Tg荧光染色。与对照组比较,LPS组TFECs细胞活力、自噬小体数量、LC3II/LC3I、Beclin1、Bcl-2、p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量显著降低,炎性因子IL-6 、TNF-α水平、细胞凋亡率、Bax、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量显著升高(P< 0.05);与LPS组比较,含药血清组TFECs细胞活力、自噬小体数量、LC3II/LC3I、Beclin1、Bcl-2、p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量显著升高,炎性因子IL-6 、 TNF-α水平、细胞凋亡率、Bax、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量显著降低(P< 0.05);与含药血清组比较,含药血清+compound C组、含药血清+MHY1485组TFECs中相应指标与上述趋势相反。结论 活血消瘿方含药血清对LPS诱导的TFECs自噬的促进作用及细胞凋亡的抑制作用可能与激活AMPK/mTOR通路有关。     

黄连温胆汤对胰岛素抵抗大鼠肝脏脂质蓄积的影响

目的观察黄连温胆汤对胰岛素抵抗(IR)大鼠肝脏脂质蓄积的影响,从自噬角度探讨其作用机制。方法50只雄性SD大鼠随机分为空白组10只和造模组40只,造模组采用高脂高糖饮食诱导IR大鼠模型,将成模大鼠随机分为模型组、黄连温胆汤组和二甲双胍组,分别予蒸馏水、黄连温胆汤药液和二甲双胍溶液灌胃,连续8周。透射电镜观察大鼠肝组织自噬小体形成情况;油红O染色观察肝脏脂质蓄积;ELISA检测大鼠空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);GPO-PAP法检测大鼠肝组织三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)含量;Western blot检测肝组织LC3、p62、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p-mTOR蛋白表达;RT-PCR检测肝组织mTOR mRNA表达。结果与空白组比较,模型组大鼠肝组织红色脂滴明显增多,并有少量自噬小体形成,FPG、FINS和HOMA-IR明显升高(P<0.01),肝组织TC、TG含量明显增加(P<0.05,P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,p62蛋白表达降低,p-mTOR/mTOR比值降低(P<0.01);与模型组比较,黄连温胆汤组和二甲双胍组大鼠肝组织红色脂滴数量减少,未见明显自噬小体,FPG、FINS和HOMA-IR明显降低(P<0.05,P<0.01),肝组织TC、TG含量减少(P<0.05,P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低,p62蛋白表达升高,p-mTOR/mTOR比值升高(P<0.05,P<0.01)。各组大鼠肝组织mTOR mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论黄连温胆汤可改善IR大鼠肝脏脂质蓄积,其机制与上调大鼠肝组织p-mTOR蛋白表达,抑制肝脏自噬有关。     

桂枝茯苓丸调节PI3K/Akt/mTOR通路对PCOS-IR大鼠排卵障碍的影响

目的:探讨桂枝茯苓丸对来曲唑联合高脂乳剂导致的多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗(PCOS-IR)大鼠排卵障碍的影响.方法 :将72只雌性SD大鼠随机分为空白组、模型组、二甲双胍组和桂枝茯苓丸低、中、高剂量组,每组12只.除空白组外,其余大鼠每日予来曲唑0.001 g·kg1结合高脂乳剂15 mL?kg1连续灌胃30 d建立P...     

补肾活血法调控PI3K/AKT/mTOR通路修复卵巢颗粒细胞自噬损伤机制研究

目的:观察补肾活血法调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)通路对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞(OGCs)自噬损伤的影响。方法:将原代培养的大鼠卵巢颗粒细胞分为六组：空白对照组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、果纳芬组。采用ELISA法检测各组中雌二醇(E₂)、孕酮(P)分泌量;Western blot法和免疫荧光法分别检测各组OGCs中PI3K、AKT、mTOR及自噬关键分子酵母Atg6同系物1(Beclin 1)、微管相关蛋1轻链3(LC3)、自噬受体蛋白p62的蛋白表达。结果:模型组E₂含量显著降低,中药各剂量组E₂含量均上升(均P<0.05),且中药高剂量组与果纳芬组E₂含量相当;各组对P的含量均没有影响(均P>0.05)。中药各剂量组及果纳芬组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR水平和p62的表达上调,Beclin 1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达下调,且中药高剂量组效果优于果纳芬组(均P<0.05)。结论:补肾...     

基于AMPK/mTOR信号通路探讨左、右归丸对绝经后骨质疏松症大鼠骨吸收的影响

目的:观察左、右归丸对绝经后骨质疏松症(PMOP)大鼠骨组织AMPK/mTOR基因与蛋白表达影响,并基于此信号通路对PMOP大鼠骨吸收进行实验研究,探索其防治PMOP的作用机制。方法:将60只SD大鼠随机分为空白(KB)组、假手术(SHAM)组、模型(OVX)组、左归丸(ZGW)组、右归丸(YGW)组、补佳乐(BJL)组。经过12周治疗后,应用数字化全身骨密度仪进行腰椎骨密度(BMD)检测,以ELISA法检测大鼠血清中Ⅰ型前胶原羟基端前肽(PICP)含量,以荧光定量-PCR和Western blot检测骨组织中OPG、RANKL、AMPK、mTOR基因和蛋白的表达。结果:与KB组比较,OVX组大鼠BMD、OPG、mTOR基因和蛋白表达显著降低(P<0.01);血清中PICP含量、RANKL、AMPK基因和蛋白表达显著升高(P<0.01);与OVX组比较,各治疗组BMD、OPG、mTOR基因和蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05);血清PICP含量、RANKL、AMPK基因和蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论:左、右归丸基于AMPK/mTOR信号通路可影响骨组织中OPG、RANKL基因与蛋白的表达,这可能是其调控骨吸收的机制之一。     

黄芪多糖抑制缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞凋亡与自噬机制研究

目的:探讨黄芪多糖(APS)对缺氧/复氧(H/R)所致乳鼠心肌细胞凋亡与自噬抑制作用的相关机制。方法:分离并体外培养乳鼠心肌细胞3 d后制备H/R损伤细胞模型,设正常对照组、H/R组、APS低、中、高剂量(20、40、80 μmol/ml)组,各组于造模前30 min给药处理。复氧2 h后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡水平,Western blot法检测p-Akt、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、p-mTOR、Beclin1、LC3、P62蛋白表达。结果:与H/R组比较,APS中、高剂量细胞增殖抑制率和凋亡率显著降低(P<0.01),p-Akt、p-mTOR、Bcl-2表达量显著升高而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62表达量显著降低(P<0.05),Bcl-2/Bax比值显著升高、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低(P<0.01)。结论:APS可能通过激活Akt/mTOR通路调控凋亡和自噬相关蛋白表达,对H/R所致乳鼠心肌细胞凋亡与自噬起到抑制作用。