茶多酚对人皮肤成纤维细胞Nrf2/Bach1mRNA及核蛋白的影响

目的 探讨茶多酚对人皮肤成纤维细胞(HSF) Nrf2/Bach1 mRNA及Nrf2/Bach1核蛋白表达分布的影响.方法 不同浓度茶多酚(0、2.5、5、10、20、40 mg/L)孵育HSF 24 h,MTT法检测细胞增殖活性,筛选出适宜浓度茶多酚,并用该浓度药物孵育HSF 24 h,RT-qPCR法检测Nrf2和Bach1mRNA表达,Western印迹法检测Nrf2、Bach1核蛋白表达,免疫荧光法检测Nrf2、Bach1蛋白核分布情况.结果 MTT法检测显示,当茶多酚浓度为5 mg/L时,对HSF增殖无明显影响,故后续实验采用5 mg/L茶多酚,对照组浓度为0.HSF加入茶多酚孵育后,Bach1 mRNA相对表达量(0.629±0.077)低于对照组(0.940±0.033,t=6.397,P＜0.05),Nrf2 mRNA(1.467±0.076)高于对照组(0.977±0.091,t=7.133,P＜0.05);Nrf2核蛋白表达(6.929±0.121)高于对照组(3.537±0.126,t=33.636,P＜0.05),而Bach1核蛋白(1.424±0.171)低于对照组(16.966±1.702,t=15.730,P＜0.05).免疫荧光结果显示,Nrf2蛋白在细胞核内的聚集增多,Bach1蛋白在细胞核内聚集减少.结论 茶多酚可促进Nrf2mRNA、Nrf2核蛋白的表达及核分布,抑制Bach1 mRNA、Bach1核蛋白的表达和核分布,从而发挥抗氧化作用.     

紫外线及全反式维A酸对人皮肤及成纤维细胞中Hrd1表达的影响

目的 探讨紫外线照射及全反式维A酸（ATRA）对人皮肤及成纤维细胞中Hrd1表达的影响及机制。方法 2017年12月至2018年6月于南京医科大学附属第一医院皮肤科收集12份人皮肤组织标本,30 ~ 40岁、60 ~ 70岁曝光及非曝光部位标本各3份,免疫组化检测各组Hrd1表达。将40只BALB/c小鼠分为对照组、紫外线组、ATRA组及紫外线 + ATRA组,其中紫外线组、紫外线 + ATRA组每日照射UVA 10 J/cm2和UVB 30 mJ/cm2,紫外线 + ATRA组（照光前给药）、ATRA组小鼠背部剃毛区域每日均匀涂抹1次0.1 ml 0.1% ATRA药膏,对照组既不涂药也不照射紫外线。14周后处死小鼠并取背部皮肤免疫组化观察Hrd1的表达。体外培养的人皮肤成纤维细胞分为对照组、紫外线组、ATRA组及紫外线 + ATRA组,紫外线组和ATRA + 紫外线组照光前用磷酸盐缓冲液覆盖细胞上层,照射10 J/cm2 UVA或30 mJ/cm2 UVB,ATRA + 紫外线组（照光后给药）和ATRA组用含ATRA 1 μmol/L的培养基继续培养24 h。Western印迹法检测各组成纤维细胞Hrd1表达,荧光显微镜观察各组细胞内活性氧水平。组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P < 0.05认为差异有统计学意义。结果 30 ~ 40岁、60 ~ 70组曝光部位皮肤组织中Hrd1表达水平分别为0.307 ± 0.256、0.486 ± 0.579,均明显高于避光部位（0.196 ± 0.330、0.199 ± 0.375）,t值分别为5.486、10.579,P < 0.05。BALB/c小鼠体内实验中,对照组、紫外线组、ATRA组及紫外线 + ATRA组小鼠皮肤中Hrd1表达水平分别为0.189 ± 0.015、0.288 ± 0.017、0.187 ± 0.020、0.226 ± 0.021,差异有统计学意义（F = 19.553,P < 0.001）,紫外线组高于对照组（t = 5.337,P = 0.033）和ATRA + 紫外线组（t = 4.891,P = 0.039）。体外实验中,人皮肤成纤维细胞分别经UVA、UVB照射后,4组细胞Hrd1水平差异均有统计学意义（F值分别为120.704、102.119,均P < 0.001）,UVA或UVB照射对Hrd1表达水平的影响基本一致,紫外线组Hrd1水平均明显高于对照组和ATRA + 紫外线组（均P < 0.05）。紫外线照射后,紫外线组活性氧水平均明显高于对照组和ATRA + 紫外线组（均P < 0.05）。结论 ATRA可以抑制紫外线介导的皮肤成纤维细胞中Hrd1的表达,其机制可能与ATRA抑制细胞内活性氧生成有关。     

紫外线对人皮肤成纤维细胞的影响

紫外线辐射可造成皮肤损伤,引起皮肤出现红斑、光老化等。紫外线作用于成纤维细胞,引起细胞因子分泌及基因表达的改变,不仅能造成真皮层的损伤,还可被用来治疗某些疾病,如局限性硬皮病。从紫外线对皮肤成纤维细胞的损伤、成纤维细胞对紫外线的防御反应及紫外线的应用等方面阐述了紫外线对成纤维细胞的影响。     

UVB对皮肤成纤维细胞相关骨架蛋白表达的影响

目的:确定UVB对皮肤成纤维细胞骨架蛋白的影响.方法:用150 mJ/cm2的UVB照射培养的皮肤成纤维细胞,用MTT法检测细胞活性,用Western blot法检测α-微管蛋白、β-微管蛋白、β-肌动蛋白和波形蛋白的含量.结果:150 mJ/cm2 UVB照射后β-微管蛋白含量逐渐降低,波形蛋白逐渐升高,α-微管蛋白和β-肌动蛋白改变不明显.结论:在UVB诱导人皮肤成纤维细胞光损伤过程中,β-微管蛋白和波形蛋白可能发挥着重要作用.     

中波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞自噬对凋亡影响的初步研究

[目的]探讨不同剂量中波紫外线(UVB)照射人皮肤成纤维细胞诱导的自噬对细胞凋亡活性的影响.[方法]人皮肤成纤维细胞来自于23岁健康男性环切术后包皮的原代培养,连续传代培养后取第3～ 10代的细胞进行实验.通过单丹酰戊二胺(MDC)染色和免疫荧光标记微管相关蛋白1轻链3(LC3)的方法,确定不同剂量3-甲基腺嘌呤(3-MA)对自噬的抑制作用.UVB照射后立即加入0.5 mmol/L 3-MA孵育细胞4h作为自噬的抑制方法.Hoechst和碘化丙啶(PI)染色结合Annexin V-异硫氰酸荧光索(FITC)和PI标记细胞后流式细胞仪检测作为细胞凋亡的定性和定量方法.[结果]0.5 mmol/L 3-MA能明显抑制人皮肤成纤维细胞自噬活性(饥饿诱导组自噬细胞阳性百分数为63.037％±5.876％,3-MA孵育后下降至34.425％±5.183％).空白对照组、30、50、100mJ/cm2UVB照射组标记LC3绿色荧光信号逐渐增强,照射后立即对上述4组加入3-MA孵育4h则LC3蛋白表达差异不明显.0.5 mmol/L 3-MA对细胞活性影响最小.50 mJ/cm2 UVB照射下加入3-MA孵育较未加3-MA孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞增多;100 mJ/cm2 UVB照射后加3-MA孵育较未加3-MA孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞减少.Annexin V -FITC和PI标记细胞后流式细胞仪分析显示,在50 mJ/cm2 UVB照射下,抑制自噬的细胞中晚期凋亡水平[( 10.933±0.839)％]较未抑制细胞[(7.267±0.473)％]上升,两者之间差异具有统计学意义(t=5.20,P＜ 0.05);而在100mJ/cm2UVB照射下,抑制自噬的细胞中晚期凋亡水平[(7.100±0.781)％]较未抑制细胞[( 10.133±0.681)％]下降,两者之间差异具有统计学意义(t=6.29,P＜ 0.05).[结论]50 mJ/cm2 UVB照射诱导人皮肤成纤维细胞自噬通过抑制凋亡对细胞起到保护作用,而在100 mJ/cm2 UVB照射下发生的较高水平自噬可能诱导了自噬性细胞死亡.     

Nrf2-Keap1系统及相关因子在小鼠黄褐斑组织中的表达

目的:探讨核因子E2相关因子2(Nrf2)-Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)系统及相关因子在小鼠黄褐斑模型皮肤中的变化。方法:将24只Balb/c雌性小鼠随机分成2组,每组12只。模型组采用中波紫外线照射联合黄体酮注射方法造模,对照组肌肉注射同剂量的灭菌注射用水,采用q PCR相对定量检测小鼠皮肤的Nrf2和Keap1基因表达水平,化学比色法检测小鼠皮肤中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。结果:与对照组相比,模型组小鼠皮肤组织的Keap1 mRNA表达量明显增强(P<0.01),Nrf2 mRNA表达量无明显改变(P>0.05),模型组SOD和GSH-Px活性明显下降(P<0.01),MDA含量明显上升(P<0.01)。结论:氧化应激在黄褐斑发病中起着非常重要的作用,抗氧化损伤Nrf2-Keap1系统与黄褐斑的发病关系密切,可为黄褐斑的治疗提供新的靶点。     

UVB照射对皮肤成纤维细胞产生受体相互作用蛋白-1的影响

目的:评价UVB照射对培养皮肤成纤维细胞受体相互作用蛋白-1(RIP-1)的影响.方法:采用150 mJ/cm2 UVB照射体外培养的人皮肤成纤维细胞,照射后12、24、36和48 h,MTT法检测细胞活性,RT-PCR法检测细胞中RIP-1 mRNA的变化,Western blot检测RIP-1蛋白水平.结果: UVB照射后,细胞活性进行性下降,RIP-1 mRNA逐渐减少,RIP-1蛋白含量逐渐升高.结论: 在UVB引起的皮肤成纤维细胞急性损伤过程中,RIP-1可能发挥着重要作用.     

α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬的影响

目的：评价α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法人皮肤成纤维细胞与终浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L 的α硫辛酸孵育4、12和24 h 后,采用噻唑蓝法检测细胞增殖活性,单丹酰戊二胺（MDC）染色法检测细胞自噬水平,Western 印迹法检测微管相关蛋白1轻链3-B（LC3-B）表达。结果孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间人皮肤成纤维细胞增殖活性（A490值）差异均无统计学意义（F 值分别为2.85、1.34,均 P >0.05）;孵育24 h 时,各组间差异有统计学意义（F =10.41,P <0.01）。MDC 法检测显示,孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间自噬体阳性细胞百分率差异均无统计学意义（F 值分别为0.11、0.10,均 P >0.05）;孵育24 h 时,各组间差异有统计学意义（F =8.03,P <0.05）。Western 印迹法检测显示,孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间细胞 LC3-Ⅰ向 LC3-Ⅱ转化（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）水平差异均无统计学意义（F 值分别为3.38、2.13,均 P >0.05）,但孵育24 h 时各组间差异有统计学意义（F =37.49,P <0.01）。结论α硫辛酸可能抑制人皮肤成纤维细胞基础自噬。     

UVA1对人体皮肤成纤维细胞的影响及临床应用

UVA1作用于皮肤成纤维细胞,使其凋亡增加、酶活性及细胞因子的分泌改变,造成真皮层损伤,还可促进伤口愈合,被用于治疗某些与皮肤成纤维细胞增生相关的皮肤病,如硬皮病、瘢痕疙瘩及增生性瘢痕等。本文就UVA1对皮肤成纤维细胞的影响及其在皮肤病治疗中的应用作以综述。     

雌激素对人皮肤成纤维细胞骨形态发生蛋白-2mRNA表达的影响

目的探讨雌激素对人正常皮肤成纤维细胞骨形态发生蛋白-2（BMP-2）表达的影响。方法采集正常人皮肤标本,分离培养真皮成纤维细胞。分别在培养细胞中加入PBS、雌激素、BMP-2刺激,应用流式细胞仪观察细胞周期变化情况,通过反转录一聚合酶链反应（RT-PCR）法观察BMP-2mRNA表达情况。结果雌激素和BMP．2处理组细胞增生指数与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0．01）。雌激素处理组BMP-2mRNA表达显著高于对照组（P〈0．05）。结论雌激素可上调人正常皮肤成纤维细胞BMP-2mRNA的表达,促进成纤维细胞增生。     

白介素1受体拮抗剂对紫外线辐射的成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶1的影响

目的探讨白介素1受体拮抗剂(IL—1Ra)对紫外线(UV)辐射的成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶1(MMP-1)的影响。方法模拟环境中UV对人体皮肤的作用方式,UVA辐射的人成纤维细胞换以UVB辐射的HaCaT培养上清继续培养。用ELISA方法检测不同处理后成纤维细胞培养上清中的 MMP-1;用实时荧光定量RT-PCR方法(荧光染料掺入法)检测IL—1Ra处理后成纤维细胞C-Jun、C-Fos 及内参照GAPDH的mRNA表达变化。结果UVA(10 J／cm2)辐射的成纤维细胞在加入不同剂量UVB(0、 1、5、10、15 mJ／cm2)辐射HaCaT的培养上清液后,其MMP—1的分泌呈增高趋势。与UVB 0 mJ/cm2比较, 于15 mJ／cm2时差异有统计学意义(t=8．413,P=0．014)。而IL—1Ra以剂量依赖方式抑制成纤维细胞的 MMP-1分泌。统计C—Jun和C—Fos的初始拷贝数以及其与GAPDH初始拷贝数的比值,结果显示IL—1Ra 以剂量依赖方式抑制成纤维细胞C—Jun的mRNA表达,对C—Fos的mRNA表达则无显著性影响。本实验应用实时荧光定量RT—PCR,其标准曲线均有良好相关性,熔解曲线证实扩增产物是特异的。结论UVB 辐射的HaCaT培养上清液能促进UVA辐射的成纤维细胞分泌MMP-1。IL—1Ra通过抑制C-Jun的 mRNA表达降低成纤维细胞的MMP—1分泌。     

低剂量中波紫外线照射Nrf2基因缺陷小鼠后诱导晒伤反应的实验研究

[目的]观察Nrf2-Keap1通路在保护皮肤免受中波紫外线(UVB)影响中的作用.[方法]8周龄雌性野生型(即Nrf2+/+组)和Nrf2-/-小鼠,每组8只,分别用200 mJ/cm2 UVB(FL120SE灯)照射小鼠耳朵背侧,用刻度计分别测量UVB照射前和照射后1、2、4、7、9、11、14 d小鼠耳朵厚度,记录照射前后两组鼠耳皮肤镜下形态,36 h取各组鼠耳标本进行HE染色及TUNEL实验,记录结果并进行统计学分析.[结果]Nrf2-/-组小鼠耳平均厚度为(0.49±0.22) cm,Nrf2+/+组为(0.25±0.03) cm,经秩和检验,差异有统计学意义(P＜0.01).UVB照射小鼠后36 h组织学检查,Nrf2-/-组真皮水肿和表皮坏死,淋巴细胞浸润和真皮血管扩张更显著;表皮晒伤细胞数[(17.0±3.9)/视野]也较Nrf2+/+组[(5.0±1.7)/视野]明显,两组差异有统计学意义(P＜ 0.01);Nrf2-/-组TUNEL阳性细胞数约是Nrf2+/+组的5倍.单一UVB照射Nrf2-/-小鼠较Nrf2+/+小鼠发生更强烈而持久的晒伤反应.[结论]Nrf2-Keap1通路可保护皮肤免受UVB的影响,包括由于UVB照射引起的细胞凋亡和氧化损伤.     

紫外线A1对真皮成纤维细胞的损伤及Tempol保护作用的研究

目的 研究紫外线Al(UVAl,340nm-400nm)对人真皮成纤维细胞氧化性损伤、对基质金属蛋白酶(MMP)和胶原蛋白表达的影响,观察氮氧化物Tempol对这些改变的保护作用。方法 体外原代培养的人真皮成纤维细胞接受UVAl照射,同时加入或不加Tempol,以生化方法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量,以半定量逆转录-聚合酶链反应及酶连免疫吸附试验测定MMP-1,MMP-3,Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA或蛋白表达水平。结果 15J/cm²UVAl照射可显著抑制细胞SOD活性,提高MDA含量,促进MMP-1,MMP-3mRNA表达,同时显著抑制Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达(P<0.05)。照射同时加入Tempol,在一定浓度范围,可显著抑制UVAl引起的上述改变(P<0.05)。结论 Tempol在体外对UVAl引起的氧化性损伤以及真皮细胞外基质成分代谢紊乱有保护作用,因而有可能成为防治光老化的一种成分。     

紫外线对HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达的影响

目的 观察紫外线照射对人角质形成细胞系HaCaT细胞表达结合珠蛋白的影响。方法 用逆转录-聚合酶链反应法检测长波紫外线UVA、中波紫外线UVB照射后HaCaT细胞各时相结合珠蛋白mRNA表达水平。结果 UVA12J/cm²照射后HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达明显升高。照射后20min结合珠蛋白mRNA表达已开始升高,6h达第一高峰,48h出现第二高峰。照射后2h、4h、6h、24h、48h组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)UVB30mJ/cm²照射HaCaT细胞后结合珠蛋白mRNA表达也出现时相变化:4h达第一高峰,48h出现第二高峰。照射后20min、2h、4h、6h、12h、48h、72h组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 紫外线UVA、311nmUVB上调HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达,随照射时间,结合珠蛋白mRNA表达呈时相变化。     

Nrf2蛋白在中波紫外线照射HaCaT细胞中的光保护作用

【摘要】 目的 探讨Nrf2对中波紫外线（UVB）致HaCaT细胞光损伤的保护作用及其作用机制。方法 将培养的HaCaT细胞分为对照组、UVB组、Nrf2组、Nrf2 + UVB组,Nrf2组、Nrf2 + UVB细胞感染Nrf2基因过表达慢病毒,UVB组、Nrf2 + UVB组细胞以30 mJ/cm2的UVB照射30 s,继续培养24 h,观察UVB照射后HaCaT细胞形态的变化,Western印迹检测各组Nrf2蛋白水平,CCK8法检测各组细胞生存率,流式细胞仪检测各组细胞活性氧（ROS）水平,生化法检测超氧化物歧化酶（SOD）水平。多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 对照组 HaCaT 细胞形态为多角形、呈簇集状生长,UVB照射后细胞出现皱缩、变圆,漂浮细胞数增多,贴壁数量明显减少。对照组、UVB 组、Nrf2组、Nrf2 + UVB组Nrf2蛋白相对表达水平分别为1.84 ± 0.047、0.63 ± 0.082、2.19 ± 0.168、1.43 ± 0.069,差异有统计学意义（F = 64.81,P < 0.05）,Nrf2组水平高于对照组（t = 14.82,P < 0.05）;4组细胞生存率分别为98.00% ± 2.39%、24.40% ± 2.98%、71.63% ± 3.39%、43.38% ± 3.39%,差异有统计学意义（F = 236.66,P < 0.05）,UVB 组细胞活力低于对照组（t = 33.34,P < 0.05）和Nrf2 + UVB组（t = 10.07,P < 0.05）;4组细胞的相对ROS含量分别为1.27 ± 0.10、5.65 ± 0.19、2.10 ± 0.73、3.67 ± 0.19,差异有统计学意义（F = 481.39,P < 0.05）,UVB组高于对照组（t = 33.68,P < 0.05）和Nrf2 + UVB组（t = 12.47,P < 0.05）。4组细胞SOD水平差异有统计学意义（F = 170.76,P < 0.05）,UVB组低于对照组（t = 11.25,P < 0.05）和Nrf2 + UVB组（t = 17.52,P < 0.05）。4组细胞IL-6水平差异有统计学意义（F = 532.34,P < 0.05）,UVB 组高于对照组（t = 28.48,P < 0.05）,Nrf2 + UVB组低于UVB 组（t = 27.82,P < 0.05）。4组细胞TNF-α水平差异无统计学意义（F = 2.02,P = 0.19）。结论 Nrf2可以通过降低细胞内ROS水平,提高内源性抗氧化酶SOD的活性,保护细胞免受UVB照射引起的氧化损伤。     

白藜芦醇对UVB照射的人皮肤成纤维细胞MMP-1水平及细胞凋亡的影响

目的初步探寻红葡萄酒中主要活性成分白藜芦醇对紫外线照射皮肤保护作用的可能机制。方法白藜芦醇对UVB照射的人皮肤成纤维细胞基质金属蛋白酶(MMP)-1水平及细胞凋亡的影响。将培养的人皮肤成纤维细胞分为5组,A组:无UVB照射无干预组,B组:UVB照射无干预组,C组:UVB照射1μmol/L白藜芦醇干预组,D组:UVB照射10μmol/L白藜芦醇干预组,E组:UVB照射100μmol/L白藜芦醇干预组。UVB照射剂量均为30mJ/cm2。用免疫组织化学方法分别检测5组细胞中MMP-1水平,用磷脂酰丝氨酸外翻分析(AnnexinV法)检测细胞凋亡率。结果 A～E组5组细胞MMP-1阳性细胞评分及凋亡率差异均有统计学意义(P均<0.05)。A组评分及凋亡率均明显低于B组,两组比较差异有统计学意义(P均<0.05),B组与C,D,E组评分及凋亡率比较差异均有统计学意义(P均<0.05),C～E组3组评分及凋亡率比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论白藜芦醇可以抑制UVB照射诱导的人皮肤成纤维细胞MMP-1水平的升高,并可减少细胞因UVB照射引起的凋亡,白藜芦醇可能通过此机制对紫外线照射皮肤起到保护作用。