siRNA干扰沉默EZH2基因对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

目的探讨小分子RNA(siRNA)干扰沉默靶基因EZH2对人肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法取对数生长期的HepG2细胞,分为转染组、阴性对照组及空白对照组,转染组与阴性对照组按照Lipofectamine2000使用说明分别瞬时转染EZH2 siRNA、荧光物FAM,对照组不予任何干预。分别采用MTT法检测细胞增殖活性、流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期;qRealtime-PCR和Western blot方法检测EZH2 mRNA和蛋白表达。结果与阴性对照组相比,转染组细胞增殖明显受抑;与阴性对照组及空白对照组比较,转染组细胞凋亡率明显升高,G0/G1期细胞明显增多,S期明显细胞减少;转染组EZH2 mRNA和蛋白表达明显下调,P均<0.05。结论 EZH2 siRNA可抑制人肝癌细胞增殖活性,是一种潜在基因治疗新方法。     

Nucleostemin基因沉默对食管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨RNA干扰沉默Nucleostemin(NS)基因后对食管癌Eca-109细胞株增殖和凋亡的影响。方法用NS基因特异性siRNA表达载体转染食管癌Eca-109细胞株,通过绘制细胞生长曲线和克隆形成实验检测细胞增殖能力;CCK-8法测试细胞增殖抑制率;RT-PCR法检测NS基因表达量的变化,TUNEL法和DNA Ladder检测细胞凋亡情况。结果与对照组相比,S组细胞的增殖速率降低,24、48及72h细胞增殖抑制率分别为60.32%、72.29%和86.00%;NS基因表达量下降;细胞凋亡指数增加(18.28%),可见梯状DNA降解带。结论 NS基因沉默导致食管癌Eca-109细胞株增殖抑制,凋亡增加。     

shRNA抑制EZH2基因表达对膀胱癌细胞增殖的影响

目的探讨RNA干扰（RNAi）技术下调EZH2基因表达对膀胧癌细胞增殖的影响。方法设计、合成EZH2基因小发夹RNA（shRNA）表达载体,用脂质体包裹并转染膀胱癌EJ细胞。RT-PCR和免疫组化法检测基因沉默效果,细胞克隆形成检测细胞生长情况,流式细胞仪测定细胞周期。结果EZH2的shRNA表达载体能有效下调EJ细胞的EZH2基因表达,并显著抑制EJ细胞生长,EJ细胞周期发生G1期阻滞。结论RNAi技术可显著下调EJ细胞的EZH2基因表达,阻止EJ细胞进入S期并抑制其增殖。     

GRHL2沉默对肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨GRHL2沉默对肺癌A549细胞的增殖、凋亡的影响。方法利用RNA干扰技术,构建GRHL2沉默慢病毒表达载体,将肺癌A549细胞分为3个组,实验组:GRHL2沉默慢病毒感染的A549细胞系;阴性对照组:空载慢病毒感染的A549细胞系;空白对照组:不给予任何处理的A549细胞系。采用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的强度,通过实时定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹法检测肺癌A549细胞中GRHL2 mRNA和蛋白质表达水平。采用细胞计数试剂盒检测GRHL2沉默对A549细胞增殖的影响。采用Annexin V-APC/PI细胞凋亡检测试剂盒及流式细胞术分析GRHL2沉默对A549细胞凋亡的影响。结果实验组中GRHL2 mRNA及蛋白质表达水平均较空白对照组及阴性对照组显著降低(F=48.13、42.57,P值均<0.05),A549细胞的增殖能力明显下降(F=65.64,P<0.05),凋亡显著增强(F=56.76,P<0.05)。结论靶向沉默GRHL2能显著抑制肺癌A549细胞的增殖并促进其凋亡,GRHL2有望成为临床肺癌靶向治疗的新靶点。     

Med19基因沉默对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响

目的 研究Med19基因在胃癌MGC-803细胞中沉默后对细胞增殖和周期的影响.方法 应用shRNA慢病毒载体感染胃癌MGC-803细胞沉默Med19基因,通过MTT和克隆形成实验观察Med19基因在胃癌细胞增殖中的作用,并用流式细胞术验证抑制Med19基因对细胞周期的影响.结果 构建的shRNA慢病毒载体感染MGC-803细胞后细胞增殖能力显著降低、细胞克隆形成能力明显减弱,同时,细胞周期阻滞于G1期.结论 Med19基因沉默后胃癌细胞的增殖能力和细胞周期均受到显著影响,提示Med19在肿瘤形成过程中具有重要作用.     

靶向抑制胃癌细胞中TROP2基因的表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响研究

目的探讨RNA干扰肿瘤相关钙信号传导因子2(TROP2)基因的表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法以人胃黏膜正常细胞GES-1作为对照,RT-PCR检测人胃癌SGC-7901、MNK-28、BGC-823细胞中TROP2 mRNA表达;TROP2 siRNA、Control siRNA转染SGC-7901细胞,不作任何处理的细胞作为空白对照组,48 h后Western blotting检测TROP2、Ki67、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达;CCK8实验和流式细胞仪分别检测细胞的增殖及凋亡情况。结果 TROP2 mRNA在人胃癌SGC-7901、MNK-28、BGC-823细胞表达均显著高于GES-1细胞(P0.01),TROP2基因在SGC-7901细胞中的表达最高,选择作为后续的研究对象;转染TROP2 siRNA后TROP2蛋白表达显著降低(P0.01);与对照组及Control-siRNA组比较,TROP2-siRNA组细胞存活率及Ki67、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著降低,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著升高(P0.01)。结论RNA干扰抑制TROP2基因的表达可降低胃癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制是下调Wnt/β-catenin信号通路。     

siRNA沉默USP22基因对胃癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)沉默泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase22,USP22)对胃癌细胞增殖的影响.方法:针对USP22基因设计3条siRNA及阴性siRNA,用脂质体Lipofectamine 2000转染胃癌AGS细胞,通过实时定量PCR和Western blot检测转染后AGS细胞USP22基因中mRNA和蛋白表达水平的变化情况,流式细胞术检测细胞周期分布变化情况,CCK8法检测细胞增殖率及抑制率.结果:转染48h后,3条siRNA均能显著抑制USP22 mRNA和蛋白的表达.其中,以转染USP22 siRNA3后效果最明显,mRNA和蛋白表达分别下降80.47%±2.99%和79.40%±3.58%.细胞增殖明显受到抑制,USP22 siR-NA3组细胞增殖抑制率为27.33%±3.49%.细胞周期中G0/G1期细胞增多,S期细胞减少.结论:采用RNA干扰技术能够有效地沉默USP22基因的表达,并显著抑制胃癌细胞的增殖.     

Twist基因沉默对人胃癌SGC7901细胞凋亡的影响

目的探讨Twist基因沉默对人胃癌SGC7901细胞凋亡的影响。方法以本课题组稳定转染pGenesil-Twist质粒的人胃癌SGC7901细胞作为研究对象,实验分为三组:对照组、空载体组、Twist基因沉默组。通过倒置显微镜和透射电镜观察Twist基因沉默对SGC7901细胞形态的影响;通过Rhodamine123染色后流式细胞仪检测各组细胞线粒体跨膜电位的变化;采用DAPI染色和TUNEL法观察Twist基因沉默对SGC7901细胞凋亡情况的影响。结果与对照和空载体组相比,倒置显微镜下观察显示基因沉默组细胞生长缓慢,细胞形态发生明显改变,有较多细胞呈圆形,细胞异型性小;透射电镜观察显示Twist基因沉默组细胞体积变小,微绒毛减少,细胞突触变短且增多,空泡增多,核质比例降低,异染色质团块状分布,核周间隙更大;Rhodamine123染色后流式细胞仪检测结果显示Twist基因沉默组阴性细胞数增高;DAPI染色结果显示细胞核边缘不规则,染色质凝集,着色较重,核固缩,核小体碎片增加;TUNEL法检测显示Twist基因沉默组可见明显细胞核棕黄色染色的阳性细胞。结论 Twist基因沉默促进SGC7901细胞凋亡,提示Twist在胃癌恶性进展中起重要作用,Twist可能成为肿瘤基因治疗的靶点。     

TPX2基因在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖凋亡的影响和机制研究

目的探讨Xklp2靶蛋白(TPX2)基因在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖凋亡的影响和机制。方法 RT-PCR及Western blotting检测胃癌组织及癌旁组织中TPX2 mRNA和蛋白表达;将NC-siRNA、TPX2-siRNA1、TPX2-siRNA2、TPX2-siRNA3转染人胃癌SGC-7901细胞,未转染任何siRNA作为对照组,Western blotting检测转染后各组细胞中TPX2蛋白表达;CCK8实验检测人胃癌SGC-7901细胞转染12、24、48 h后细胞增殖情况;细胞转染48 h后,流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blotting检测PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。结果胃癌组织中TPX2 mRNA和蛋白表达均显著高于癌旁组织(P0.01);NC-siRNA组TPX2蛋白表达与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05);TPX2-siRNA1、TPX2-siRNA2、TPX2-siRNA3组的TPX2蛋白表达均显著低于对照组(P0.01),TPX2-siRNA3组的抑制效果更明显,选择作为后续研究;NC-siRNA组在12、24、48 h后的细胞存活率与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05),TPX2-siRNA组在12、24、48 h后的细胞存活率均显著低于对照组,且随着时间延长细胞存活率降低(P0.01);NC-siRNA组细胞凋亡率及Cleaved caspase3、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05),TPX2-siRNA组细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达均显著高于对照组,PI3K、p-AKT蛋白表达显著低于对照组(P0.01)。结论 TPX2在胃癌中高表达,沉默TPX2的表达能抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖和促进细胞凋亡,其机制可能与PT3K/AKT信号通路的调控有关。     

RNA干扰沉默HDAC1基因对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的: 研究下调HDAC1的表达对大肠癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响. 方法: 设计合成HDAC1的特异性shRNA, 将其插入至pSilencer载体中, 并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染SW480细胞株. 用RT-PCR和Western blot检测shRNA对细胞内HDAC1基因表达的影响, 同时采用Western blot对细胞周期相关基因进行检测. 采用MTT法检测生长抑制作用. 运用流式细胞术检测细胞的凋亡情况和细胞周期分布. 结果: 成功构建和筛选出HDAC1特异性的shRNA质粒载体, 与空白对照组相比, 转染HDAC1-shRNA的大肠癌细胞HDAC1 mRNA蛋白质表达水平明显下降(30.4%±4.5% vs 64.6%±4.4%, P<0.01; 27.4%±4.5% vs 58.1%±3.3%, P<0.01), p21(/WAF-1/CIP-1)表达增加(97.4%±2.6% vs 62.6%±3.4%, P<0.01), CdK2和Cyclin E蛋白下降(CdK2: 27.7%±6.0% vs 42.6%±4.1%, P<0.01; Cyclin E: 42.0%±8.5% vs 82.8%±3.7%, P<0.01), 细胞生长抑制率增加(24 h: 35.9%±4.9% vs 1.2%±0.6%, P<0.01; 48 h: 47.5%±7.0% vs 1.3%±0.6%, P<0.01; 72 h: 45.7%±6.2% vs 1.0%±0.5%, P<0.01; 96 h: 48.2%±4.7% vs 1.2%±0.7%, P<0.01), 凋亡率明显增加(31.3%±2.8% vs 3.9%±0.7%, P<0.01), G0/G1期和G2/M期细胞比例增加(G0/G1: 64.5%±0.9% vs 57.8%±1.8%, P<0.01; G2/M: 17.4%±1.3% vs 14.5%±0.6%, P<0.05), S期细胞比例相应下降(17.5%±1.0% vs 27.7%±1.5%, P<0.01). 结论: HDAC1特异的shRNA能够有效下调HDAC1基因, 诱导大肠癌细胞发生凋亡和细胞周期阻滞, 从而抑制细胞的增殖.     

RNAi沉默survivin基因对胰腺癌细胞增殖、凋亡和周期的影响

目的 应用RNAi技术沉默胰腺癌细胞株中survivin基因对肿瘤细胞凋亡、细胞周期和增殖的变化.方法 靶向survivin的RNAi载体转染胰腺癌细胞,Western印迹检测基因沉默效果,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖、凋亡及细胞周期.结果 survivin基因沉默效率可达85%;MTT检测显示,干扰组survivin沉默细胞增殖抑制与非特异性质粒对照组相比显著增高(P<0.01).流式细胞术显示,干扰组细胞凋亡百分率显著高于非特异性质粒对照组(P<0.01);G_2/M期显著高于非特异性质粒对照组(P<0.01或P<0.05),而S期则显著降低(P<0.05).结论 survivin基因沉默可引起胰腺癌细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖.     

AKR1B10基因沉默对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探索肝细胞癌(HCC)中醛酮还原酶家族1成员B10(AKR1B10)的生物学功能和相关的病理机制。方法通过CCLE数据库分析正常肝细胞与HCC细胞系中AKR1B10 mRNA的表达,UALCAN以及Oncomine数据库分析癌旁组织与HCC组织中AKR1B10 mRNA的表达,Western Blot法验证HCC患者癌组织与癌旁组织中AKR1B10蛋白表达差异。使用慢病毒分别敲减HepG2及Huh7细胞中的AKR1B10,分为对照组和AKR1B10敲减组(shAKR1B101#、shAKR1B102#)。采用AnnexinV-APC/PI双染法、细胞克隆实验、皮下移植肿瘤的方法检测敲减AKR1B10后HCC细胞凋亡、克隆形成、皮下成瘤体积的变化。过氧化物敏感性荧光探针DCFH-DA以及Western Blot检测敲减AKR1B10后HCC细胞内活性氧(ROS)以及p-ATMser1981、γ-H2AX、c-Caspase-3和c-RARP等蛋白的变化。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验。结果CCLE数据库提示AKR1B10 mRNA在HCC细胞中的表达明显高于正常肝细胞;Oncomine数据库显示,与癌旁组织相比,HCC组织中AKR1B10 mRNA的表达增加了10倍以上;UALCAN数据库提示AKR1B10基因在HCC组织中高表达;本研究的6例HCC患者中AKR1B10在HCC组织中的表达高于癌旁组织。与对照组相比,AKR1B10敲减组中HCC细胞的克隆形成能力明显下降(P值均<0.001),细胞凋亡率明显增加(P值均<0.001)。与对照组相比,AKR1B10敲减组ROS的水平升高,DNA损伤指标p-ATMser1981、γ-H2AX蛋白,细胞凋亡指标c-Caspase-3和c-RARP蛋白增加。此外,在BALB-c/Nude小鼠模型中,从异体移植后第13天开始,与对照组相比,AKR1B10敲减组肿瘤体积明显缩小(P值均<0.05)。结论AKR1B10可能是治疗HCC的有效治疗靶标。     

RNA干扰沉默CLIC4基因对胃癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨氯离子胞内通道(CLIC)4对胃癌细胞增殖和侵袭的影响.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测人胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中CLIC4的表达.应用Lipofectamine2000将CLIC4 siRNA转染到SGC-7901细胞和MGC-803细胞中,分为siRNA1组、siR...     

沉默miR-345联合5-FU对胃癌MGC803细胞增殖能力及凋亡的影响

目的 观察沉默miR-345联合5-FU对胃癌MGC803细胞增殖及凋亡的影响。方法 采用脂质体介导转染miR-345反义寡核苷酸至胃癌细胞MGC803以沉默miR-345表达。应用40μg/ml 5-FU单独处理胃癌细胞MGC803或联合miR-345沉默组,克隆形成实验观察细胞的增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果 脂质体介导转染miR-345反义寡核苷酸至胃癌细胞MGC803可以抑制miR-345的表达;细胞克隆形成实验显示,反义miR-345+5-FU联合组与单独5-FU处理组相比,克隆形成率[(4.29±0.83)%vs(7.68±0.34)%]显著降低(P0.01);流式细胞凋亡检测表明,反义miR-345+5-FU联合组细胞凋亡率显著高于反义miR-345组、5-FU组(P0.01)。结论 沉默miR-345联合5-FU能抑制5-FU对MGC803细胞增殖能力,并促进其凋亡。     

SLP-2 siRNA对裸鼠胃癌移植瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨SLP-2siRNA对裸鼠胃癌移植瘤细胞增殖及凋亡的影响.方法:设计合成化学修饰的SLP-2siRNA,将胃癌细胞SGC-7901接种于裸鼠皮下建立裸鼠胃癌移植瘤模型,随机分为转染SLP-2siRNA组、阴性对照组和空白对照组,于肿瘤局部分别多点多次注射化学修饰SLP-2siRNA、阴性对照siRNA及生理盐水.检测3组移植瘤细胞增殖及凋亡状况,RT-PCR及免疫组织化学技术检测移植瘤细胞内SLP-2mRNA及蛋白的表达.结果:与两对照组相比,注射化学修饰的SLP-2siRNA后,裸鼠胃癌移植瘤细胞生长速度减慢、移植瘤体积减小(P=0.009,P=0.003).抑制瘤率分别为26.74%和30.15%,细胞凋亡无明显变化(P>0.05),肿瘤细胞内SLP-2mRNA及蛋白的表达量降低.结论:SLP-2siRNA可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长,但对细胞凋亡无影响,提示SLP-2基因参与促进胃癌细胞增殖.     

RNAi沉默Sp3基因对肝癌HepG2细胞增殖的影响

目的:采用基因沉默和慢病毒转染技术,沉默人肝癌细胞HepG2中特异蛋白3(specificity protein 3,Sp3)的表达,观察沉默Sp3基因后的肝细胞的增殖能力变化.方法:采用Sp3-siRNA慢病毒转染人肝癌细胞HepG2,通过免疫印迹法和PCR技术检测Sp3的表达以验证转染效果,通过MTT检测细胞生长曲线和流式细胞技术测定细胞周期.结果:Western blot实验表明,实验组的Sp3表达量明显少于空白组和阴性对照组(0.37±0.08 vs 0.83±0.17,0.66±0.13,F=8.442,均P<0.05).RT-PCR也得到相同的结果(0.47±0.05 vs 0.74±0.08,0.70±0.16,F=7.322,均P<0.05).MTT实验结果显示,与空白对照和阴性对照组相比,实验组细胞在48、72和96h时的增殖明显受到抑制(0.28±0.18 vs 0.34±0.19,0.35±0.07,F=3.888;0.57±0.11 vs 0.84±0.05,0.74±0.08,F=12.721;0.72±18.1 vs 0.98±0.05,0.93±0.9,F=6.342,均P<0.05).流式细胞术结果显示实验组细胞主要分布在G1期.结论:RNAi沉默Sp3基因导致人肝癌HepG2细胞体外增殖能力下降.     

体外RNA干扰抑制RegⅣ基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:拟探讨RegⅣ基因在胃癌细胞中的表达及干扰该基因对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.方法:应用实时定量PCR方法检测九株胃癌细胞株中RegⅣ基因的mRNA表达. 针对RegⅣ基因设计三条小干扰RNA片段(siRNA1、siRNA2、siRNA3), 瞬时转染高表达胃癌细胞株, 实时定量PCR方法检测转染后RegⅣ基因的mRNA的表达水平, CCK-8法检测细胞增殖能力, 流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:以永生化正常胃黏膜细胞株GES-1作为参照, 除MKN-45和SNU-1胃癌细胞株外, 其余胃癌细胞株中RegⅣ表达水平均升高5倍以上, 尤以SNU-16细胞株明显, 其RegⅣ的表达水平高出GES-1细胞数千倍, 遂选用SNU-16细胞进行RNA干扰. 合成的三对siRNA对RegⅣ基因表达均有明显抑制作用, 抑制率分别为79.3%、77.4%和60.4%. 选用siRNA1干扰SNU-16细胞株后96 h和120 h, 其细胞增殖率受到明显抑制( P = 0.0057, 0.0173). 流式细胞仪检测显示72 h细胞凋亡率明显增加( P =0.0231).结论:干扰RegⅣ基因具有抑制胃癌细胞增殖,促进凋亡的作用, RegⅣ基因可能成为胃癌基因靶向治疗的分子靶点.     

基因沉默血管内皮生长因子受体3对胃癌细胞增殖的抑制作用

目的: 探讨靶向血管内皮生长受体-3(vascularendothelial growth factor receptor-3, VEGFR-3)小干扰RNA重组载体对胃癌细胞增殖的作用.方法: 构建pSUPER-shRNA/VEGFR3重组载体, 将其转染入胃癌细胞SGC-7901, 采用MTT法观察细胞的生长曲线, RT-PCR检测重组载体在转染前后VEGFR-3 mRNA表达水平的变化, Western blot检测VEGFR-3的蛋白表达.结果: pSUPER-shRNA/VEGFR3重组载体可显著抑制SGC-7901细胞中VEGFR-3基因的表达( P<0.05); 转染pSUPER-shRNA/VEGFR3的SGC-7901细胞生长明显受抑制( P<0.05),VEGFR-3基因蛋白表达明显降低( P<0.05).结论: pSUPER-shRNA/VEGFR3重组载体能够对胃癌细胞SGC-7901中VEGFR-3形成基因沉默, 并抑制胃癌细胞的增殖.     

节律基因Per2对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨节律基因Per2对胶质瘤细胞的影响及其作用机制。方法将Per2表达质粒pcDNA3.1-Per2及空载对照质粒pcDNA3.1分别经阳离子脂质体介导转染CHG-5细胞,用G418筛选出Per2稳定表达细胞株;分别用MTT法、流式细胞仪、RT-PCR技术,检测CHG-5细胞增殖、细胞周期和凋亡,以及该细胞株中增殖、凋亡相关基因p53和c-myc表达。结果筛选到稳定表达Per2基因的细胞株CHG-5/Per2细胞,Per2有抑制肿瘤细胞增殖能力;与对照组（pcDNA 3.1-CHG-5）和未处理组（CHG-5）比较,转染组CHG-5/Per2细胞在G1期阻滞,细胞凋亡明显增加（P均〈0.05）;Per2可明显上调p53基因表达,抑制c-myc基因表达。结论节律基因Per2可促进胶质瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖,是胶质瘤中的肿瘤抑制因子。