乳腺癌外周血单核细胞自噬相关基因表达及其与肿瘤复发的关系

目的 探讨乳腺癌病人外周血单核细胞自噬相关基因5(autophagy related gene 5,Atg5),自噬相关基因9(autophagy related gene 9,Atg 9),Beclin 1,不协调的51样激酶1(unc-51-like kinase1,ULk1)及线粒体融合蛋白2(mitofusin-2,Mfn2)基因的mRNA表达及其与乳腺癌复发的关系。方法 乳腺癌根治手术的病人100例,分为复发组(37例)和未复发组(63例)。荧光定量RT-PCR检测病人外周血单核细胞Atg5、Atg 9、Beclin 1、ULk1及Mfn2基因的mRNA表达。分析各指标与肿瘤复发的关系。结果 复发组Atg 9、Beclin 1、ULk1及Mfn2基因mRNA表达量低于未复发组,Atg 5基因mRNA表达量高于未复发组(P=0. 007,0. 000,0. 000,0. 000,0. 000)。临床Ⅲ期,组织学分级Ⅲ级,Atg9、Beclin 1、ULk1、Mfn2低表达是乳腺癌病人复发的危险因素,Atg5低表达是乳腺癌病人复发的保护因素(P 0. 05)。结论 乳腺癌中Atg 9、Beclin 1、ULk1及Mfn2基因低表达是乳腺癌病人复发的危险因素,Atg5基因低表达是乳腺癌病人复发的保护因素,检测其表达对判断乳腺癌预后具有临床意义。     

自噬相关基因在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义

目的本研究通过对肾透明细胞癌自噬相关基因蛋白水平的检测,分析其与临床病理资料的关系。方法 Western blot检测肾透明细胞癌中自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达量。结果 Western blot检测显示肾透明细胞癌中自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平均低于癌旁组织组(P0.05);低分化组和中分化组LC3的蛋白表达水平比高分化组低(P0.05);进展期和转移性肾癌组比局限性肾癌组LC3的蛋白表达水平低(P0.05)。结论自噬在肾透明细胞癌中的低表达水平可能与肾透明细胞癌的发生、发展及转移有关。     

缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α与自噬相关分子的表达及相关性分析

目的探讨缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达及其相关性。方法取健康成年SD大鼠髓核组织,分离培养髓核细胞并传代。取第3代髓核细胞行HE染色和Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色鉴定后,随机分为4组。A组细胞于常氧条件下(37℃、5%CO2、20%O2)培养,B组细胞于缺氧条件下(37℃、5%CO2、1%O2)培养,C组细胞转染HIF-1α-小干扰RNA后于缺氧条件下培养,D组细胞加入自噬抑制剂3-MA后于缺氧条件下培养。各组细胞培养8 h后,采用Western blot和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测HIF-1α与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达情况。结果经分离纯化的第3代大鼠髓核细胞HE染色后细胞质呈淡粉色,细胞核呈蓝黑色;Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色为阳性。Western blot和qRT-PCR检测示,B组HIF-1α、Beclin1和LC3B蛋白及mRNA相对表达量均显著高于A组(P<0.05),C组均显著低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。D组HIF-1α蛋白和mRNA相对表达量与B组比较差异无统计学意义(P>0.05),Beclin1和LC3B蛋白和mRNA相对表达量均较B组显著降低(P<0.05)。结论缺氧条件能诱导大鼠髓核细胞中HIF-1α和自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达,且HIF-1α与自噬相关分子的表达具有相关性,即HIF-1α下调能降低自噬相关分子的表达,而缺氧条件下自噬水平下调对HIF-1α的表达无明显影响。     

狼疮肾炎患者自噬水平及其对足细胞相关蛋白表达水平的影响

目的探讨狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)患者自噬水平及其对足细胞相关蛋白表达水平的影响。方法选择2017年5月至2019年5月于榆林市第一医院收治的69例LN患者为LN组,50例系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者为SLE组,50例肾切除手术患者为对照组,观察3组肾脏足细胞内自噬体数量,比较3组肾脏组织中自噬相关蛋白、微管相关蛋白轻链3(LC3)、B淋巴细胞瘤蛋白质-2-相互作用蛋白(Beclin1)的表达,以及足细胞相关蛋白,肾病蛋白(Nephrin)、足突蛋白(Podocin)的表达。分离狼疮肾炎患者肾脏足细胞,将足细胞分为自噬抑制组和自噬诱导组,自噬抑制组加入100 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA),自噬诱导组加入100 nmol/L雷帕霉素(RAPA),比较3组足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin等蛋白的表达。结果LN组、SLE组肾脏足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05);SLE组肾脏足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于LN组(P<0.05);自噬诱导组足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于正常对照组、自噬抑制组(P<0.05);正常对照组足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于自噬抑制组(P<0.05)。结论LN患者自噬水平呈升高状态,自噬水平升高可能通过上调足细胞相关蛋白Podocin、Nephrin水平而减轻足细胞损伤,抑制LN病情进展。     

六味地黄丸含药血清通过诱导自噬对氧化应激状态下成骨细胞增殖的影响

目的 观察六味地黄丸含药血清对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞增殖、活性氧及自噬水平的影响。方法 用过氧化氢(H₂O₂)模拟氧化应激状态后采用不同浓度的六味地黄丸含药血清干预MC3T3-E1细胞，CCK-8法检测细胞增殖情况；通过细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测细胞ROS水平；qRT-PCR检测自噬相关基因Beclin 1、LC3B mRNA表达情况；蛋白印迹法检测自噬相关蛋白Beclin 1、LC3B表达情况。结果 (1)CCK-8结果显示，H₂O₂会抑制成骨细胞的增殖，当其浓度为0.10 mmol/L时具有相对较小程度的抑制增殖效果；六味地黄丸含药血清可以促进氧化应激状态下成骨细胞的增殖，且当体积浓度为20%时促进增殖的效果最好。(2)细胞活性氧检测结果显示，六味地黄丸含药血清组ROS水平降低(P<0.05)。(3)qRT-PCR结果显示，六味地黄丸组Beclin 1、LC3B mRNA表达上调(P<0.05),且该作用会被自噬抑制剂所抑制...     

自噬对于风湿性心脏病瓣膜间质细胞分化以及增殖能力的影响

目的探讨自噬对于风湿性心脏病的瓣膜间质细胞(VICs)生物学特征改变以及增殖能力的影响。方法使用肝素诱导人主动脉瓣膜间质细胞(购自上海赛百慷生物技术股份有限公司)向肌成纤维细胞分化, 而后使用自噬抑制剂LY294002(15 μmol/L)进行干预, 将细胞分为对照组、抑制剂组、诱导组、实验组。使用蛋白质印迹法(Western blot)检测各组细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、碱性磷酸酶(ALP)、Beclin1、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)蛋白表达水平;采用细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)分析自噬对4组细胞增殖的影响。结果蛋白印记结果显示对照组的ALP和α-SMA蛋白(0.827±0.123、0.716±0.141)显著低于诱导组(1.384±0.165、1.315±0.223), 差异有统计学意义(t=4.669, P<0.01、t=3.929, P<0.05);对照组Beclin1和LC3-Ⅱ(0.807±0.182、0.392±0.150)显著低于诱导组(1.271±0.067、1.404±0.018), 差异有统计学意义(t=4.131, P&...     

仙茅苷调节lncRNA MEG3/miR-181a-5p通路对骨质疏松大鼠成骨细胞自噬的影响

目的 探讨仙茅苷（Curculigoside，CUR）对骨质疏松症（osteoporosis，OP）大鼠成骨细胞自噬的影响以及对lncRNA MEG3/miR-181a-5p信号轴的调节作用。方法 体外培养骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）诱导成骨细胞分化，CCK-8法筛选CUR浓度；数据库预测lncRNA MEG3与miR-181a-5p结合位点；利用转染技术将BM-MSCs细胞分为NC组、CUR组、CUR+3-MA组、CUR+pc-NC组和CUR+pc-LncRNA MEG3组，qRT-PCR检测lncRNA MEG3、miR-181a-5p的表达水平，碱性磷酸酶（ALP）染色法检测细胞ALP活性，MDC法检测细胞自噬体数量，免疫荧光检测细胞微管相关蛋白1-轻链3（LC3）、自噬效应蛋白（Beclin1）的表达。肌肉注射地塞米松磷酸钠建立OP大鼠，大鼠分为对照组（CT组）、模型组（OP组）、OP+CUR组（灌胃15 mg/kg CUR），CT检测大鼠胫骨骨形态学，Western blot和qRT-PCR分别检测LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1与lncRNA MEG3、miR-181a-5的表达。结果 25 μg/mL以上浓度的CUR显著提高BM-MSCs细胞增殖活力（P＜0.05）；lncRNA MEG3与miR-181a-5p具有靶向结合位点；与NC组相比，CUR组细胞ALP活性、自噬体数量以及LC3、Beclin1表达增加（P＜0.05）；与CUR组相比，CUR+3-MA组细胞ALP活性、自噬体数量以及LC3、Beclin1表达减少（P＜0.05）；与CUR+pc-NC组相比，CUR+pc-LncRNA MEG3组细胞ALP活性、自噬体数量以及LC3、Beclin1表达减少（P＜0.05）。OP组大鼠骨形态学评价以及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、miR-181a-5p表达较CT组下降，lncRNA MEG3表达增加（P < 0.05）；OP+ CUR组大鼠骨形态学评价以及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、miR-181a-5p表达较OP组增加，lncRNA MEG3表达降低（P＜0.05）。结论 CUR可能通过调节LncRNA MEG3/miR-181a-5p信号轴促进OP大鼠成骨细胞自噬活性。     

自噬在吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡中的作用

目的:研究自噬在吉西他滨(gemcitabine,Gem)诱导胰腺癌细胞SW1990凋亡中的作用,并以氯喹特异性抑制自噬,以探讨其可能机制。方法:采用CCK8法检测Gem对胰腺癌细胞增殖的影响,并用实时定量PCR检测自噬相关基因LC3的表达,以p62免疫荧光染色检测细胞内自噬泡,通过Western印迹法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1的表达,并用AnnexinⅤ/PI流式细胞方法检测Gem诱导后细胞凋亡的变化。进一步通过氯喹抑制自噬,检测自噬抑制前后细胞增殖、自噬及凋亡的变化。结果:Gem对胰腺癌细胞SW1990增殖具有部分抑制作用,Gem作用能迅速激活细胞自噬从而产生耐药。LC3的mRNA表达升高1.4~2.2倍(P<0.05),LC3-Ⅱ蛋白水平升高1.5~2.7倍(P<0.05)。Gem和氯喹联合用药组较Gem单药组细胞凋亡蛋白Caspase-3表达升高,细胞存活率从64.3%±3.1%降低为35.2%±3.4%(P<0.05)。结论:自噬在Gem诱导胰腺癌细胞凋亡的过程中可能起到保护作用,氯喹抑制自噬后可增强Gem的促凋亡作用。     

低频超声微泡增强紫杉醇诱导三阴性乳腺癌细胞自噬的作用及机制

目的 探讨低频超声微泡增强紫杉醇诱导三阴性乳腺癌细胞自噬的作用及机制。方法 将MDA-MB-468细胞分为对照组(不进行处理)、紫杉醇组(6μg/ml紫杉醇)、低频超声组(低频超声+6μg/ml紫杉醇)和低频超声微泡组(低频超声+6μg/ml紫杉醇+微泡),检测各组MDA-MB-468细胞增殖情况,凋亡情况,自噬情况,Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达情况。结果 与0μg/ml相比,1、3、6、12、24μg/ml紫杉醇处理下MDA-MB-468细胞增殖抑制率均升高(P 0. 05)。与对照组相比,紫杉醇组MDA-MB-468细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平升高(P 0. 05),细胞中绿色点状物明显增多,细胞中Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表达水平降低(P 0. 05);与紫杉醇组相比,低频超声组MDA-MB-468细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平升高(P 0. 05),细胞中绿色点状物明显增多,细胞中Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表达水平降低(P 0. 05);与低频超声组相比,低频超声微泡组MDA-MB-468细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平升高(P 0. 05),细胞中绿色点状物明显增多,Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表达水平降低(P 0. 05)。结论 低频超声微泡可通过上调Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达及下调Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表达增强紫杉醇诱导三阴性乳腺癌细胞的凋亡、自噬反应。     

维生素D对睡眠剥夺小鼠认知功能的影响及其作用机制研究

目的探讨维生素D(vitamin D,VD)对睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)小鼠认知功能的影响及其作用机制。方法将40只C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为4组(每组10只):正常对照组(Ctrl组)、SD组、SD+VD组(VD组)、SD+VD+3MA组(3MA组)。Ctrl组不做任何处理,SD组、VD组、3MA组小鼠采用多平台水环境法进行72 h的SD;VD组、3MA组腹腔注射1,25‑二羟维生素D3[1,25‑dihydroxyvitamin D3,1,25(OH)2D3]1.5μg/kg,连续7 d;3MA组腹腔注射自噬抑制剂3MA 2 mg/kg,连续7 d;Ctrl组与SD组腹腔注射等量的生理盐水。造模结束后用Morris水迷宫检测小鼠学习、记忆能力,行为学测试完毕后随即处死取材,采用ELISA试剂盒检测小鼠血清中25羟基维生素D3(25‑hydroxy vitamin D3,25HVD3)的含量以及海马组织中β‑淀粉样蛋白(amyloid β‑protein,Aβ)、TNF‑α、IL‑1β及IL‑6的含量,Western blot法检测小鼠海马组织中自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin 1)和微管相关蛋白1轻链3B亚基(B subunit of microtubule‑associated protein light chain 3,LC3B)的蛋白水平;免疫荧光染色法标记LC3B。结果与Ctrl组比较,VD组、SD组和3MA组小鼠逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数及目标象限停留时间减少,血清中25HVD3含量均减少,海马组织中Aβ、TNF‑α、IL‑1β及IL‑6含量均增加,海马组织中Beclin 1和LC3B蛋白水平均升高(P<0.05)、绿色荧光表达也明显增强。与SD组比较:VD组逃避潜伏期缩短,穿越平台次数及目标象限停留时间增加(P<0.05);VD组和3MA组血清中25HVD3含量增加,海马组织中Aβ、TNF‑α、IL‑1β及IL‑6含量均减少(P<0.05);VD组海马组织Beclin 1和LC3B蛋白水平升高(P<0.05),绿色荧光也表达增强。与VD组比较,3MA组小鼠逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数及目标象限停留时间减少,海马组织中Aβ、TNF‑α、IL‑1β及IL‑6含量均增加,海马组织中Beclin 1和LC3B蛋白水平降低(P<0.05)、绿色荧光表达下降。结论VD改善SD小鼠认知功能的机制可能与激活自噬有关。     

荣筋拈痛方对白细胞介素-1β诱导的体外大鼠软骨细胞自噬相关基因表达的影响

目的:观察荣筋拈痛方对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的体外大鼠软骨细胞自噬相关基因表达的影响,探讨其防治膝骨关节炎的作用机制.方法:取4周龄SD大鼠膝关节软骨,进行软骨细胞的体外分离培养,选取第2代软骨细胞甲苯胺蓝染色进行细胞鉴定.经IL-1β10 ng·mL-1诱导建立体外软骨细胞炎症模型,诱导成功后,给予荣筋拈...     

shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞CXCR7表达的影响

目的 探讨CXCR7的shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞HT-29 CXCR7表达的影响.方法 设计CXCR7的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的plVTHM载体连接,构建3种重组穿梭质粒plVTHM shRNA1,plVTHM shRNA2和plVTHM shR-NA3,并转化于DH5α感受态细胞,Amp筛选阳性克隆,抽取质粒行酶切鉴定并测序.分别将3种重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度.将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人结肠癌细胞HT-29,实时定量PCR和Western blot分别检测CXCR7 mRNA和蛋白的沉默效果.结果 酶切鉴定及测序结果 证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为6×107 TU/mL,4×107 TU/mL和5×107 TU/mL.感染HT-29后,CXCR7 mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P＜0.05);其中以LV-CXCR7 shRNA-2和LV-CXCR7 shRNA-3作用显著,mRNA表达分别下调72%和67%,蛋白表达下调68%和55%(P＜0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P＞0.05)结论 成功构建了3种CXCR7 shRNA慢病毒表达,可有效下调HT-29细胞CXCR7mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以CXCR7为靶点的结肠癌基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础.     

尾型同源盒转录因子2 shRNA慢病毒表达载体的构建及其转染对结肠癌细胞生长的影响

目的:构建尾型同源盒转录因子2(CDX2)shRNA慢病毒表达载体,并观察下调CDX2基因其对结肠癌细胞生长的影响。方法:根据CDX2 m RNA序列设计shRNA,并合成shRNA的互补序列,通过连接酶链接到GV248载体上,用测序方法鉴定阳性克隆后,将构建好的慢病毒表达载体与慢病毒包装载体用Lpofectamine 2000共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒并用稀释法进行滴度测定。将CDX2 shRNA慢病毒表达载体转染人结肠癌细胞SW480、HT29后,分别用q RT-PCR和Western blot检测CDX2 m RNA及蛋白水平,CCK8实验及克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果:DNA测序鉴定证实,CDX2 shRNA表达片段正确插入GV248载体中,包装后的病毒滴度为1×109TU/m L;SW480、HT29细胞转染CDX2-shRNA慢病毒表达载体后,CDX2 mRNA及蛋白表达水平均明显降低(均P0.05),但细胞的增殖与克隆形成能力无明显改变(均P0.05)。结论:成功构建shRNA慢病毒表达载体,其转染结肠癌细胞后能有效地抑制CDX2基因的表达;下调CDX2基因对人结肠癌细胞的增殖无明显影响。     

慢病毒介导的RNA干扰对小鼠胰腺星状细胞中半乳糖凝集素-1基因沉默效应的研究

目的:评价慢病毒介导的RNA干扰技术对小鼠胰腺星状细胞(mPSC)中半乳糖凝集素-1(galectin-1)基因的沉默效应,并观察其对mPSC增殖的影响。方法:设计并合成3条galectin-1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒PLKO.1-PURO载体中。从慢病毒包装转染的293T细胞,获得病毒上清感染的mPSC;采用嘌呤霉素(2μg/μL)筛选出慢病毒感染成功的mPSC。实时荧光定量RT-PCR和Western印迹法检测mPSC中galectin-1 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测mPSC的增值能力。结果:PCR扩增和测序表明成功构建galectin-1慢病毒干扰载体,可以有效沉默mPSC中galectin-1基因的表达。构建的RNAi慢病毒载体感染mPSC后galectin-1 mRNA表达量同对照组比较,分别为(19.4±4.8)%、(6.2±4.3)%、(27.6±5.7)%,galectin-1蛋白表达量同对照组比较分别为(25.9±3.6)%、(10.8±4.1)%、(30.2±3.2)%。稳定的galectin-1沉默mPSC在第4天细胞增殖能力下降(22.9±2.7)%(P     

缺氧条件下骨髓间充质干细胞对人冠状动脉内皮细胞自噬和凋亡的影响

目的探索缺氧状况下MSC对内皮细胞自噬的诱导以及对早期凋亡率的影响。方法构建HCAEC与MSC间接共培养模型,实验分组:共培养组:MSC与HCAEC共培养;单独培养组:HCAEC单独培养;对照组:HCAEC使用与共培养组相同的培养基进行单独培养。上述各组分别予常氧(5%CO_2,95%空气)和缺氧(1%O_2,5%CO_2,94%N_2)培养24 h,Western blotting检测各组HCAEC细胞LC3蛋白和Beclin-1蛋白的表达量,RT-q PCR检测各组HCAEC细胞LC3基因和Beclin-1基因的表达水平,流式细胞术检测各组HCAEC细胞早期凋亡率。结果共培养组与单独培养组相比、以及缺氧组与常氧组相比,LC3蛋白和Beclin-1蛋白表达量均有升高(P0.05)。各组间LC3基因和Beclin-1基因的表达水平没有检测到明显差异(P0.05)。缺氧组中共培养组的早期凋亡率为(8.86%±1.48%),明显低于单独培养组(15.23%±2.56%)和对照组(14.49%±3.31%)(P0.05)。结论 MSC可以诱导HCAEC产生自噬,并在缺氧状况下改善HCAEC的生存状况,减少早期凋亡率。     

Corresponding Changes of Autophagy‐Related Genes and Proteins in Different Stages of Knee Osteoarthritis: An Animal Model Study

ObjectiveTo investigate the effect of autophagy expression levels of different weight‐bearing states and different stages of osteoarthritis in animal models, as well as the corresponding mechanisms.MethodsWe used the male Sprague–Dawley (SD) rats (12‐week‐old, SPF) to establish the OA animal models by modified Hulth method, and grouped animal models according to the length of time after surgery and different weight‐bearing areas. RT‐qPCR was carried out for detection of autophagy‐related genes such as Atg7, Atg12, P62, etc. Western blot analysis was used to detect the expression levels of corresponding autophagy‐related proteins such as LC3B, P62, etc. T test was performed for statistical analysis to compare different groups, while the differences were deemed statistically significant with P < 0.05. Transmission electron microscopy was used to observe the autophagosome to demonstrate the level of autophagy expression and the status of the chondrocytes.ResultsThe results of the RT‐qPCR testing showed that when the weight‐bearing cartilage of the 4‐week group (relatively mild) was compared with that of the 10‐week group (relatively severe), there were statistically significant differences in all the genes tested, in detail: Atg3 (P < 0.01), Atg7 (P < 0.01), Atg12 (P < 0.01), P62 (P < 0.0001). The expression of autophagy‐related mRNA in the 4‐week group is increased compared with that of the 10‐week group. As for the expression of proteins, Western blotting showed that in the comparison between the 4‐ and the 10‐week groups, statistically significant results include Atg12 (P < 0.01) in the non‐weight‐bearing area, with decreased autophagy in the 10‐week group compared with that of the 4‐week group, while expression of LC3B (P < 0.05) protein was significantly higher in the 4‐week group than in the control in the non‐weight‐bearing area. The expression of LC3B (P < 0.0001) and P62 (P < 0.05) in the 10‐week group were higher than that of the control. Transmission electron microscope showed that autophagy in the weight‐bearing area is stronger than that in the non‐weight‐bearing area, and autophagy in the 4‐week group is stronger than in the 10‐week group for the weight‐bearing area.ConclusionsThe expression of autophagy varies during different stages of osteoarthritis, in which the autophagy is stronger in the early stage of osteoarthritis, and gradually decreases with the progression of the disease. Autophagy in different weight‐bearing areas may also be different.     

周期性应力下胰岛素样生长因子1受体对大鼠软骨细胞功能的影响

目的探讨周期性机械应力条件下胰岛素样生长因子1型受体(IGF1R)对大鼠软骨细胞增殖及细胞外基质合成的影响。 方法体外分离培养大鼠软骨细胞,随机分为4组：加压0 h组、加压0.5 h组、加压1 h组、加压2 h组,采用Western Blot法检测各组细胞IGF1R的表达及磷酸化水平,并在此基础上将同代无处理的软骨细胞在加压各组检测的同时给予同样检测即为静态组,应用Gel-Pro Analyzer软件进行半定量灰度分析比较各时间段静态和加压两两各组磷酸化IGF1R/总IGF1R水平差异。另取大鼠软骨细胞随机分为静态组、加压对照组、IGF1R阻断组、加压后IGF1R阻断组,IGF1R阻断采用顺式－3－[8－胺基－1－(2－苯基－喹啉－7－基)－咪唑并[1,5－a]吡嗪－3－基]－1－甲基－环丁醇(OSI－906)或者以IGF1R shRNA两种方式。阻断IGF1R 1 h后Western Blot法检测各组细胞磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(ERK 1/2)表达及磷酸化水平;8 h后实时荧光定量PCR检测各组2型胶原(collagen Ⅱ)、蛋白聚糖(aggrecan)表达;3 d后采用直接细胞计数方式及细胞计数试剂盒(CCK-8)对软骨细胞增殖状况进行测定。应用SPSS 18.0软件进行相关统计学分析,两组间差异采用t检验比较。 结果磷酸化IGF1R/总IGF1R蛋白水平在加压0 h组与静态组之间差异无统计学意义(t＝0.255, P＝0.811),而在0.5 h组,1 h组,2 h组较相对应的静态组增高,差异具有统计学意义(t＝－5.881、－6.172、－10.518,P均小于0.05)。IGF1R被OSI-906或shRNA抑制后,加压处理的ERK 1/2磷酸化水平显著降低(OSI-906阻断后t＝3.074,shRNA阻断后t＝3.990,P均小于0.05),细胞外基质collagen Ⅱ(OSI-906阻断后t＝3.243, shRNA阻断后t＝3.621,均为P<0.05)、aggrecan(OSI-906阻断后t＝3.128,shRNA阻断后t＝3.608,P均小于0.05)基因表达水平显著降低,大鼠软骨细胞增殖能力减弱,差异均具有统计学意义(OSI-906阻断后t＝2.835、shRNA阻断后t＝3.467,均为P<0.05)。 结论周期性机械应力通过压力感受器IGF1R将机械信号转变为生物化学信号,激活ERK 1/2信号通路促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成。     

靶向慢病毒载体RNA干扰小鼠血管内皮细胞异种抗原的研究

目的 使用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)方法抑制小鼠血管内皮细胞异种抗原半乳糖α1,3-半乳糖(Galα1,3-Gal)的表达.方法 经体外设计合成针对α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-GT)mRNA的序列特异性小发夹RNA(shRNA),并构建携带α1,3-GT shRNA的重组慢病毒载体,以慢病毒感染小鼠血管瘤内皮细胞系EOMA细胞.采用荧光实时定量聚合酶链反应检测转染后的EOMA细胞α1,3-GT mRNA表达水平的变化;免疫荧光法和流式细胞术检测转染后的EOMA细胞异种抗原Galα1,3-Gal表达水平的变化.并将转染后的EOMA细胞与人血清混合培养,用四甲基偶氮唑盐比色法测定细胞存活率.结果 成功获得携带α1,3-GT shRNA的成熟重组慢病毒颗粒,转染EOMA细胞效率可达75%.与空白对照组、空转染组以及阴性siRNA对照组比较,重组慢病毒转染EOMA细胞后,能有效抑制α1,3-GT的表达,抑制率为88%(P＜0.05);Galα1,3-Gal抗原表达水平明显降低(P＜0.05);而空白对照组、空转染组和阴性siRNA对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05).重组慢病毒转染后的EOMA细胞与人血清混合培养后的存活率较各对照组明显提高(P＜0.05).结论 成功构建靶向α1,3-GT基因的重组慢病毒载体,通过RNAi沉默α1,3-GT基因,抑制EOMA细胞异种抗原Galα1,3-Gal的表达,在体外实验中可减轻异种超急性排斥反应.     

GYY4137通过提高自噬水平和降低氧化应激来保护老年雌性大鼠骨量流失

目的 观察GYY4137对老年大鼠骨量影响以及对氧化应激水平和自噬水平的影响.方法 10只年轻大鼠和20只老年雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为3组,对照组(Con,10只年轻大鼠)、模型组(Mod,10只老年大鼠)和治疗组(Tre,10只老年大鼠),每组10只.在实验过程中,治疗组接受GYY4137治疗.治...