干细胞移植治疗颅脑损伤的研究进展

<正>颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）是全球重大的公共卫生健康问题之一,也是导致中青年死亡和残疾的最主要原因[1]。TBI后,神经细胞的快速死亡和细胞外基质的降解导致创伤局部形成一个空腔,并被包裹在一层密集的胶质瘢痕组织中,导致长期的神经功能缺损。干细胞移植可以重建病变腔和促进脑组织再生,一方面能够释放神经营养因子以促进受损的神经元修复,另一方面能通过分化或转分化为成熟的神经细胞修复受损的神经组织。本文就目前干细胞移植治疗TBI的临床前研究及临床试验做一简要综述。     

神经干细胞移植对颅脑损伤大鼠脑皮层的神经保护作用

目的研究神经干细胞(neural stem cells,NSCs)在颅脑创伤(traumatic brain injury,TBI)大鼠脑皮层中的转归,及NSCs移植对TBI引起的免疫反应的作用。方法将NSCs移植入TBI大鼠脑皮层,2周后评价NSCs的存活、迁移及分化,并检测脑皮层促炎症因子水平及脑组织炎症反应。结果移植后2周,NSCs在TBI脑皮层中存活,并向病变迁移,TBI组中的迁移细胞是脑组织(1246±92)个/mm2细胞,多数迁移细胞(51.3%±7.5%)具有神经元表型,NSCs移植明显提高TBI大鼠神经运动功能评分,降低急性期促炎症因子水平,并且降低CD3+T细胞及Mac3+细胞数目,从而减轻炎症反应。结论 TBI大鼠脑组织影响NSCs的存活、迁移及分化,NSCs移植的神经保护作用与减轻脑组织炎症反应有一定关系。     

小胶质细胞在创伤性脑损伤后癫痫中的作用研究进展

创伤性脑损伤(TBI)是一种严重威胁人们生命健康的疾病, 而TBI后癫痫(PTE)是其严重的后遗症之一。由于PTE发生的病理生理机制尚未阐明, 目前尚无有效的预防和治疗方法。TBI触发了强烈且持久的炎症级联反应, 提示神经炎症可能与PTE的发病机制有关。而小胶质细胞, 作为大脑中最常见的免疫细胞, 在神经炎症中发挥着重要作用。小胶质细胞在TBI后被激活, 可表达促炎或抗炎等表型。不同的极化状态与各种促炎或抗炎型介质的释放有关, 且不同程度上影响着大脑的修复和PTE的发生与发展。鉴于不同表型的小胶质细胞在神经炎症中发挥的作用不同, 调节小胶质细胞的极化方向可能对TBI和PTE患者的治疗具有重要意义。本文综述了TBI后不同时间点小胶质细胞的表型和功能, 深入探究小胶质细胞极化的信号通路和导致癫痫发生的潜在机制, 以及总结了防治TBI和PTE的药物研究进展, 以期为PTE动物实验的临床转化奠定基础。     

神经干细胞移植促进鼠脊髓损伤后髓鞘结构的修复

目的 观察神经干细胞移植治疗对鼠脊髓损伤后髓鞘结构修复的作用并探讨其作用机制。方法 制备鼠T10脊髓损伤模型,体外培养、诱导鼠神经干细胞,定量评价神经干细胞移植对脊髓损伤后髓鞘结构修复的影响。结果 与对照组相比,神经干细胞移植组明显地增强了蛋白前脂蛋白信使核糖核酸(PLP mRNA)的表达,促进了髓鞘碱性蛋白(MBP)性的髓鞘再生和髓鞘结构的修复。结论 神经干细胞移植通过增强髓鞘的再生而促进了脊髓损伤后髓鞘结构的修复,是急性脊髓损伤一种有效的治疗方案。     

甘氨酸通过抑制大鼠创伤性脑损伤后炎症反应来发挥神经保护作用

目的 探讨甘氨酸对创伤性脑损伤(TBI)大鼠的神经保护作用及机制。方法 将SD雄性大鼠随机分为对照(Sham)组、脑损伤+溶剂(TBI+Vehicle)组和脑损伤+甘氨酸(TBI+Glycine)组,采用Feeney's自由落体法建立创伤性脑损伤模型; 术后1 h侧脑室注射甘氨酸(2 mg/kg)或等体积的溶剂; 术后24 h,取脑组织样本; 采用脑含水量测定、蛋白免疫印迹法和免疫荧光法评价甘氨酸对大鼠TBI的神经保护作用; 采用ELISA法检测炎症因子白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平,评价甘氨酸对TBI后脑组织炎症反应的抑制作用。结果 甘氨酸可减轻TBI后脑水肿,减少皮层神经元损伤; 同时甘氨酸可抑制TBI后炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的过度释放。结论 甘氨酸对大鼠TBI具有神经保护作用; 甘氨酸对TBI后相关炎症因子过度增高的抑制可能部分解释其神经保护作用机制。     

移植神经干细胞的存活与迁移：电刺激小脑顶核可提高移植效率吗？**

背景：缺血早期半暗带中神经元和内皮细胞的坏死和凋亡无法得到缓解,加之移植后的存活率低,向功能细胞的分化率低,是单纯神经干细胞移植的缺陷。课题组提出整体干预理念,期望给移植细胞提供优化的整体环境。 目的：观察神经干细胞移植与电刺激小脑顶核相结合整体干预对移植神经干细胞存活与迁移的影响。 方法：体外分离、培养新生Wistar大鼠海马表皮生长因子反应性神经干细胞,Brdu标记,并用胎牛血清诱导,观察其多向分化潜能;80只Wistar大鼠分为4组：顶核刺激+神经干细胞移植组(n=32)：左侧小脑顶核刺激24 h后行右侧大脑中动脉梗死,再24 h后将神经干细胞立体定向注入右侧侧脑室内;顶核刺激组(n=8)：PBS代替神经干细胞,其余同顶核刺激+神经干细胞移植组;单纯神经干细胞移植组(n=32)：同心圆电极插入小脑顶核,不通电其余同顶核刺激+神经干细胞移植组;对照组(n=8)：同心圆电极插入小脑顶核后不通电,其余同顶核刺激组。记录梗死后6,24 h,3,7,14,28 d大鼠的神经功能;分别在移植后3,7,14,28 d处死大鼠,以梗死灶为中心切片,Brdu免疫组织化学染色,观察移植神经干细胞的存活与迁移。 结果与结论：分离培养的表皮生长因子反应性细胞表达nestin抗原,并有自我更新及多向分化潜能,在胎牛血清诱导下可分化为神经胶质细胞和神经元。经Brdu标记后,85%以上神经干细胞表达Brdu抗原。移植28 d内顶核刺激+神经干细胞移植组功能评分明显优于与其他3组(P < 0.05~0.01)。顶核刺激+神经干细胞移植组在移植14,28 d存活细胞数明显多于单纯神经干细胞移植组;提示电刺激小脑顶核可显著提高移植神经干细胞的存活率及大脑中动脉梗死大鼠的神经功能评分;优化的整体环境可提高移植神经干细胞对局灶性脑缺血损伤细胞的替代作用。     

胚胎小鼠脊髓源性与纹状体源性神经干细胞的培养及分化特点

目的 探讨小鼠脊髓源性神经干细胞与纹状体源性神经干细胞的分离培养方法 及增殖特点,比较两种来源的神经干细胞发育时期上的异同,寻找更有利于脊髓损伤修复的种子细胞.方法 利用显微解剖、无血清培养和单细胞克隆技术在孕14 d小鼠的胎鼠的脊髓及纹状体中分离培养具有单细胞克隆能力的细胞,免疫荧光染色检测克隆细胞的神经巢蛋白(nestin)抗原和诱导分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达,并比较两种来源的干细胞在培养及分化方向上的异同点.结果从胎鼠的脊髓和纹状体中成功分离出神经干细胞.两种来源的干细胞均具有连续克隆能力可传代培养,表达nestin.脊髓血清诱导分化后脊髓源性神经干细胞β-tubulinⅢ阳性细胞(13.5±0.8)较纹状体源性神经干细胞(17.4±1.1)减少,而nestin、GFAP阳性细胞明显增多(45.7±0.3vs 39.2±1.2;25.2±1.3 vs 18.8±0.9),差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 依据细胞增殖特点和分化结果的区别,证实纹状体源性神经干细胞更适合用于移植修复脊髓损伤.     

创伤性脑损伤与机体免疫的关系研究进展

创伤性脑损伤((Traumatic Brain Injury,TBI)发生后因患者血脑屏障被破坏导致中枢神经系统发生一系列免疫反应,既往研究文献多强调这些免疫反应是导致TBI患者脑继发性损伤及预后不良的重要危险因素,认为TBI与机体免疫之间呈现更多的是一种消极关系。而近年来随着国内外研究学者对TBI后机体免疫机制研究的进一步深入,强调TBI与机体免疫二者之间也有一定的积极关系,即机体免疫具有阻断继发性损害及保护、修复神经的重要作用。本文通过对近年来国内外相关文献的回顾和整理,对TBI与机体免疫的积极关系和消极关系进行综述。     

脑室内神经干细胞移植修复谷氨酸导致的成年小鼠神经损伤(英文)

目的探讨脑室内神经干细胞移植修复成年小鼠谷氨酸神经毒性损伤的可能性。方法从15日小鼠胚胎脑组织分离神经干细胞,采用免疫细胞化学技术检测细胞Nestin抗原表达;通过免疫荧光染色观察所移植神经干细胞在体内的存活及定位。除对照组外,所有小鼠均以谷氨酸单钠(每天4.0 g/kg)灌胃,连续10天。灌胃后第1 天和10 天,谷氨酸加神经干细胞移植组行神经干细胞脑室内移植(1× 105细胞 /鼠),对照组和谷氨酸组注射DMEM 液。末次移植后第 11天进行Y迷宫试验,试验结束后进行小鼠脑病理检查,以分析谷氨酸引起的脑功能和形态学上的改变。结果所分离细胞呈Nestin阳性表达;移植10天后所移植神经干细胞在小鼠脑中呈区域特异性存活;脑室内移植神经干细胞能明显促进成年小鼠脑谷氨酸兴奋性毒性损伤的修复。结论脑室内移植神经干细胞可用于疾病或损伤脑组织的修复。     

神经干细胞及其在中枢神经系统疾病中的应用

神经干细胞 (neuralstemcell,NSC)的发现和分离成功 ,脑组织具有自我修复的潜能 ,这对“神经组织损伤不能再生”的传统观念提出了挑战。NSC就是神经系统自我修复的细胞学基础 ,NSC的生物学特性 ,分离和增殖、分化及其调控 ,已成为神经组织移植治疗中枢神经系统疾病和神经损伤修复的研究焦点 ,动物实验研究为神经干细胞移植的临床应用提供了基础。一、神经干细胞、祖细胞和神经前体细胞的概念1 992年Reynolds等[1] 从胚胎鼠脑的纹状体区 ,首次分离出能在体外持续增殖且具有向神经元及星形胶质细胞分化潜能的细胞群 ,这些细胞群具有干细胞…     

创伤性脑损伤与神经炎性反应

近年来,交通事故、军事行动及对抗类体育运动等所导致的颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的发病率逐年上升。全面了解TBI发病机制对其治疗具有重要意义,其中炎性因子和免疫细胞参与的神经炎性反应在TBI继发性损伤中扮演重要角色,本文将对TBI后神经炎性反应相关机制研究的进展作一综述。     

NMDA受体拮抗剂剂量与脑缺血再灌注大鼠海马内源性神经干细胞的增殖

背景：脑缺血再灌注后,过度释放的兴奋性氨基酸可通过NMDA受体激活内源性神经干细胞,促使其增殖、分化,修复神经细胞,但同时也导致细胞内钙离子超载,引起神经细胞的损伤。通过控制NMDA受体活化的程度,刺激内源性神经干细胞激活的同时把损伤减到最小。 目的：观察NMDA受体拮抗剂MK-801质量浓度对脑缺血再灌注大鼠海马内源性神经干细胞增殖的影响。 方法：健康雄性SD大鼠54只随机数字表法分为对照组(不进行任何处理)、手术组(缺血模型制作)及不同剂量MK-801组。采用大鼠四条血管阻断方法(Pulsinelli-4VO法)制备大鼠全脑缺血再灌注模型。不同浓度MK-801组在模型制作前30 min按照0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 ,1.2 mg/kg侧脑室注射MK-801。Western-blot、RT-PCR技术检测各组nestin蛋白及mRNA水平及表达。 结果与结论：MK-801剂量在0.8 mg/kg以下时,nestin mRNA及蛋白的表达差异无显著性意义(P > 0.05),呈现高表达;当剂量为0.8 mg/kg时,可明显抑制内源性神经干细胞增殖;在0.8mg/kg以上,对神经干细胞的抑制作用随着剂量的升高呈递增趋势;在1.2 mg/kg时,大鼠有躁动、共济失调等严重不良反应。nestin mRNA表达结果与蛋白表达趋势相吻合。说明MK-801的剂量与脑梗死后神经功能的修复有一定的关系,实验中0.6 mg/kg是一个比较合适的实验应用剂量,在此剂量下既可使MK-801减少兴奋性氨基酸对神经元的毒性作用,保护神经细胞,又使内源性神经干细胞的增殖不受较大影响。     

创伤性脑损伤后海马区S1PR1表达与NSCs增殖的关系

目的探讨创伤性脑损伤(TBI)后大鼠海马区1-磷酸鞘氨醇受体1(S1PR1)的表达变化特点及其与神经干细胞(NSCs)增殖的关系。方法 96只健康雄性SD大鼠随机分为TBI后1、3、7、14、21、28 d组(n=10)和各时点相应的对照组(n=6)。采用控制性皮层损伤法建立大鼠TBI模型,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)和性别决定相关基因簇2(Sox2)免疫荧光染色双标NSCs,观察TBI后海马区NSCs的增殖趋势,Western Blot检测和分析海马区S1PR1的表达变化规律。结果与对照组相比,伤后第1天海马区NSCs数量增多,第7天达到高峰,第14、21、28天逐渐减少(P0.05)。海马区S1PR1于伤后第1天表达显著上调,高峰出现在伤后第7天,于第14、21、28天表达逐渐下调(P0.05)。结论 TBI后海马区S1PR1表达变化与NSCs增殖趋势在时程上一致,S1PR1可能在TBI后神经再生与修复过程中具有重要调控作用。     

中枢神经再生系列讲座 第一讲 神经系统损伤的细胞反应

神经再生 ,特别是中枢神经再生 ,牵涉到神经活动基本过程以及神经损伤修复的一系列重要问题 ,近年来有重要与飞速的发展。现在 ,我们甚至已经触摸到脊髓损伤后截瘫康复的大门 ,这真是激动人心、令人向往的科学事态的变化。中枢神经系统再生牵涉到如下一些理论问题 :轴突受损伤后其远端及近端的变性 ;损伤引起的瘢痕组织对中枢再生的阻抑作用 ;神经营养因子对再生的重要作用 ;应用神经前细胞 (progenitor)、神经干细胞及基因工程方法用于中枢再生的前景等等。为了能将这些喜人的进展及时地介绍给国内广大的神经科学工作者 ,本刊特邀有关专家撰写该系列讲座。讲座共分若干讲 ,将分别叙述 :神经系统损伤的细胞反应 ,神经营养因子的神经修复作用及其机制 ,胚胎脑移植与中枢神经的再生 ,神经干细胞参与神经修复 ,神经干细胞移植在神经退化性疾病治疗中的应用研究 ,基因工程在促进中枢再生中的应用前景 ,等等。编辑部     

神经干细胞移植修复鼠脊髓损伤的实验研究

目的 :观察神经干细胞移植治疗对鼠脊髓损伤后神经结构修复和功能恢复的作用并探讨其作用机制。方法 :制备鼠T10 脊髓损伤模型 ,体外培养、诱导鼠神经干细胞 ,定量评价神经干细胞移植对脊髓损伤后神经结构修复和功能恢复的影响。结果 :与对照组相比 ,神经干细胞移植组明显的增强了GAP 43mRNA的表达 ,促进了脊髓ChAT阳性的运动神经元的再生、结构的修复和下肢运动功能的恢复。结论 :神经干细胞移植促进了脊髓损伤后神经结构的修复和功能的恢复 ,是急性脊髓损伤一种有效的治疗方案     

神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

背景：单纯的神经干细胞移植对受损脊髓组织的修复作用并不理想,研究证实神经生长因子兼有神经元营养和促突起生长双重作用,可以有效的促进脊髓损伤后神经功能的恢复。 目的：观察神经干细胞移植联合应用神经生长因子对脊髓损伤后大鼠运动功能恢复的影响。 方法：SD大鼠42只,建立急性脊髓损伤模型后随机分成3组,伤后1周于损伤处分别注入培养液、单纯神经干细胞或神经干细胞联合神经生长因子。于伤后1,2,4,6,8周进行BBB评分和斜板实验等运动功能检测。伤后4周取材行病理切片苏木精-伊红染色及BrdU免疫组化染色,伤后8周取材行辣根过氧化物酶示踪观察及体感诱发电位观察神经电生理恢复情况。 结果与结论：伤后4周单纯神经干细胞组、神经干细胞联合神经生长因子组大鼠后肢运动功能均有较明显恢复,神经干细胞联合神经生长因子组较单纯神经干细胞组快,差异有显著性意义(P < 0.05)。培养液组亦有所恢复,但程度较轻。病理切片显示培养液组未见神经轴索通过。单纯神经干细胞组可见少量神经轴索样结构,神经干细胞联合神经生长因子组可见较多神经轴索样结构。BrdU的阳性细胞数及HRP阳性神经纤维数：神经干细胞联合神经生长因子组>单纯神经干细胞组>培养液组且各组之间差异有显著性意义(P < 0.01)。神经干细胞联合神经生长因子组大鼠体感诱发电位的潜伏期、波幅优于单纯神经干细胞组(P < 0.05),明显优于培养液组(P < 0.01)。结果提示神经干细胞移植对于后肢功能的恢复有促进作用,联合应用神经生长因子有协同效果。     

不同方法及载体转染神经干细胞的实验研究

目的利用不同的表达载体(阳离子脂质体及腺相关病毒rAAV-2-EGFP)转染神经干细胞,比较转染的效率,长期稳定性以及对神经干细胞活性的影响;再用不同转染方法(贴壁法及悬浮转染法)转染神经干细胞,比较转染的效率;为神经干细胞的标记以及进一步移植示踪寻找一种更为理想的方法。方法通过体外分离,培养孕12d胚鼠脑中神经干细胞,分别采用腺相关病毒与阳离子脂质体转染神经干细胞,于转染后36h,1周、2周、1月、6月采用荧光显微镜下计数绿色荧光细胞数目及比例,稳定表达后利用流式细胞仪检测稳定转染的效率,MTT法测定2种方法对神经干细胞增殖活性的影响,利用腺相关病毒转染对比贴壁法与悬浮法的转染效率。结果腺相关病毒转染后36h开始出现荧光,1周后转染效率为61.17%,明显高于脂质体转染的38.70%,并能长期稳定表达(6月),对神经干细胞的生长及增殖无明显的影响;悬浮法和贴壁法转染的效率分别为(60.1±3.5)%、(27.4±4.2)%,2组比较有显著性差异(P<0.05)。结论利用腺相关病毒及采用悬浮法转染神经干细胞是一种比较好的转染标记方法,适合干细胞移植后长期示踪检测。     

神经干细胞植入阿尔茨海默病鼠脑后的效果观察

神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病鼠包括细胞替代治疗和基因治疗,神经干细胞移植阿尔茨海默病鼠脑后其组织形态学与行为学效应均可以得到不同程度的修复和改善。细胞替代治疗中,神经干细胞与神经营养因子联合移植效应优于单纯的神经干细胞移植,但目前对神经干细胞体内分化机制的不确定导致了神经干细胞移植治疗的盲目性,同时对影响其疗效的各种可能因素也缺乏比较研究。神经干细胞基因治疗具有细胞替代和基因治疗的双重作用,但尚处于研究的初期阶段,仍以NGF,BDNF,GDNF等单一营养因子基因修饰的神经干细胞移植治疗为主,且转基因神经干细胞移植入阿尔茨海默病鼠脑后外源基因表达效率、促分化、功能修复情况以及安全性的研究还很缺乏。目前神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病鼠脑后的疗效检测技术手段比较单一,免疫组化方法与活体示踪技术的结合、形态学指标与功能学指标的综合检测是疗效检测的发展趋势。     

缺血再灌注大鼠海马的神经干细胞移植：磷脂酰肌醇3/Akt通路激活和脑源性神经营养因子表达增加

背景：PI3K/Akt通路和BDNF在脑缺血动物模型和患者中表达异常,也成为的脑缺血的治疗靶点。神经干细胞在修复的潜在用途包括移植修复丢失的细胞和激活内源性细胞提供“自我修复。” 目的：观察神经干细胞植入对PI3K/Akt和BDNF在海马表达的影响,阐明神经干细胞植入对脑缺血的神经保护机制。 设计：完全随机分组,对照动物实验。 时间及地点：实验于2007-03-2008.09在南方医科大学基因工程研究所完成。 材料：E17的怀孕大鼠和雌性大鼠购自南方医科大学实验动物中心,兔抗PI3K的试剂盒购自北京博奥森生物科技公司,磷酸化Akt（Ser473）由美国Cell Signaling Technology提供,其他试剂由美国sigma和Santa Cruz公司提供。 方法：体外分离、培养大鼠NSCs,进行WTS-8、 BrdU检测。局灶性脑缺血模型,大脑中动脉线栓方法制作大鼠脑缺血再灌注模型。参照Longa氏5分评分方法,得分超过2分大鼠入选实验。2,3,5,氯化三苯基四唑（TTC）染色检测梗死体积。两天后大脑中动脉阻塞大鼠给与50000 E17的立体定向神经干细胞移植或5μgWortmannin至缺血海马旁。使用免疫印迹分析Akt（Ser473）,PI3K和BNDF的表达。 主要观察指标：脑组织神经干细胞移植激活PI3K/Akt通路参与促进神经组织的结构和功能恢复且上调脑源性神经营养因子的功能。 结果：神经干细胞治疗组脑梗死体积显着低于缺血模型组(P<0.01)、Wortmannin干预组(P<0.01)和神经干细胞+Wortmannin干预组(P<0.05)。在神经干细胞治疗组PI3K蛋白的水平比较显着高于脑缺血模型性(P<0.01)。在Akt的蛋白质水平（Ser473）和神经干细胞治疗组BNDF更为显著高于脑缺血模型性(P<0.01)。在治疗组的BNDF蛋白水平比较显着高于Wortmannin干预(P<0.01)神经干细胞+Wortmannin干预组(P<0.05)。 结论：在脑缺血过程中神经干细胞移植激活PI3K/Akt通路参与脑源性神经营养因子的基因表达。     

神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的实验研究

目的探讨胎鼠皮质培养的神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的可行性及疗效。方法取孕龄15d Sprague-Dawley(SD)胎鼠皮质细胞培养为神经干细胞;用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型;将24只健康SD大鼠分为假手术组、缺血对照组、缺血移植组,在移植后2周、4周依据Garcia的18分评分法对各组大鼠的神经功能进行评分;行脑灌注固定取材,免疫组化染色观察移植后神经干细胞的分化、迁移和整合情况。结果用胎鼠皮质培养的细胞nestin表达阳性;缺血移植组大鼠的神经功能评分明显高于缺血对照组(P<0.05);缺血移植组免疫组织化学染色能够检测到存活的BrdU阳性细胞,移植后4周时可见移植细胞向周围迁移、分化、参与血管形成,并可见梗死区边缘微血管明显增生;缺血移植组大鼠脑GFAP阳性细胞数较缺血对照组明显增多(P<0.05)。结论分离、培养胎鼠皮质细胞Nestin表达阳性,即是大鼠的神经干细胞;移植体外培养的神经干细胞能在脑缺血大鼠脑内存活、迁移、分化,并且对脑梗死大鼠的神经功能修复起到了积极作用。