海参皂苷抑制人脑胶质母细胞瘤U251细胞生长实验研究

目的研究一种新型海参皂苷fuscocineroside A对人脑胶质母细胞瘤U251细胞的生长抑制作用及其机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线;用Hoechst33342荧光染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法（TUNEL）及流式细胞仪检测分析U251细胞凋亡;并通过Western blot检测细胞内survivin蛋白表达情况。结果Fuscocineroside A能显著抑制U251细胞的生长,诱导其凋亡,下调survivin的表达,呈浓度及时间依赖性,而对正常胶质细胞并没有明显抑制作用。结论Fuscocineroside A能诱导U251细胞凋亡,这种作用可能与survivin的表达下调有关。     

丙酮酸乙酯对鱼藤酮诱导的多巴胺能神经细胞损伤的保护作用

目的 建立鱼藤酮(Rotenone, Rot)诱导的SH-SY5Y细胞模型,探讨丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate,EP)对多巴胺能神经细胞的保护作用及机制。方法 Rot作用于SH-SY5Y细胞,构建Rot诱导的PD细胞模型,使用不同浓度的EP作用于PD细胞模型,MTT法检测细胞活力,Annexin V/PI染色检测细胞凋亡,免疫印迹法检测LC3 Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白的表达,免疫荧光染色观察HMGB1的表达及定位。结果 EP减轻了Rot引起的多巴胺能神经细胞凋亡,并提高了细胞活力; EP减少了Rot诱导的LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比例增高,增加P62蛋白的表达,且与EP的水平呈正相关。激光共聚焦显微镜观察到EP抑制了HMGB1的胞浆转位。结论 EP可能通过抑制HMGB1的转位来减少Rot诱导的自噬性损伤,从而对多巴胺能神经细胞起到保护作用。     

低氧对体外培养的血管平滑肌细胞HMGB1的分泌及尼莫地平干预作用的研究

目的探讨低氧对血管平滑肌细胞分泌高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的影响,以及尼莫地平对其干预作用。方法体外培养大鼠血管平滑肌细胞,采用Kuwabara等并加以改进的方法对平滑肌细胞进行低氧培养,在低氧处理后(1h、4h、12h、24h和48h),使用Westernblot检测培养液上清中HMGB1的表达水平。再按同样方法加入尼莫地平预处理,分为对照组、单纯低氧组、低氧+尼莫地平组(加入100mmol/L尼莫地平),低氧培养24h后检测上清HMGB1水平。台盼蓝排斥法检测48h以内细胞的存活率。结果与正常对照组相比,培养液上清中HMGB1在低氧各组表达均明显增加(P<0.05)。低氧组、低氧+尼莫地平组HMGB1水平明显高于对照组,尼莫地平预处理组较单纯缺氧组要低(P<0.05)。台盼蓝排斥法检测低氧48h以内对细胞生存率影响较小。结论低氧可诱导体外培养的血管平滑肌细胞分泌表达HMGB1,在24h内随着缺氧时间的延长,其表达增加。加入尼莫地平预处理可降低HMGB1的表达,故提示尼莫地平可能通过部分降低HMGB1水平从而起到脑保护作用。     

二氢杨梅素抑制脂多糖诱导后BV2细胞HMGB1的核质转位和释放

目的 探索二氢杨梅素(Ampelopsin,AMP)对脂多糖(LPS)刺激的小胶质细胞BV2高迁移率族蛋白B1(HMGB1)核质转位和释放的影响。方法 不同浓度的二氢杨梅素(10μmol/L,30μmol/L,50μmol/L)联合LPS处理BV2细胞,用Elisa法检测HMGB1的分泌水平;细胞核质分离方法检测HMGB1核/质转位;免疫共沉淀检测HMGB1磷酸化的表达情况;免疫印迹检测JAK2、STAT3磷酸化水平。结果 不同浓度的二氢杨梅素显著抑制了LPS引起的BV2细胞HMGB1释放,减少了LPS诱导的HMGB1由细胞核到细胞质的转位。免疫共沉淀和免疫印迹结果表明:二氢杨梅素可减少HMGB1磷酸化水平,抑制LPS诱导的JAK2-STAT3信号通路激活。结论 二氢杨梅素可以抑制LPS介导的BV2细胞HMGB1的转位和释放,其主要机制可能是通过降低HMGB1的磷酸化以及抑制JAK2-STAT3信号途径。     

SNAI2与E-cadherin参与LRIG1对U251细胞侵袭与转移的抑制作用

目的 探讨多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（LRIG1）对人脑胶质瘤U251细胞侵袭与转移及U251细胞SNAI2、E-cadherin表达的影响。方法 传代培养U251细胞,随机分为空白对照组、LRIG1空载体组、LRIG1过表达组、LRIG1低表达组、LRIG1低表达阴性对照组,应用脂质体介导的基因转染技术分别转染PBS、PEGFP-N1-U251质粒、PEGFP-LRIG1-U251质粒、LRIG1-siRNA、LRIG1-NC-siRNA。应用PCR、Western blot检测细胞LRIG1、SNAI2、E-cadherin mRNA和蛋白表达水平,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞转移能力。结果 LRIG1过表达组U251 SNAI2表达下调（P<0.05）,E-cadherin表达上调（P<0.05）,细胞侵袭与转移能力明显下降（P<0.05）。LRIG1低表达组U251细胞SNAI2表达上调（P<0.05）,E-cadherin表达下调（P<0.05）,细胞侵袭与转移能力明显提高（P<0.05）。结论 上调LRIG1可抑制U251细胞侵袭与转移,而敲除LRIG1可明显促进U251细胞侵袭与转移,SNAI2及E-cadherin可能参与其调节过程。     

CREPT对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制

目的 探讨肿瘤高表达细胞周期相关蛋白（CREPT）对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响及可能机制。方法 体外培养人胶质瘤细胞株U373、U251、A172、U87-MG、SHG44,并构建过表达或沉默CREPT的U251细胞;免疫印迹法检测蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力;细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 U251细胞CREPT蛋白表达水平最高,SHG44细胞最低。沉默CREPT后,U251细胞增殖、侵袭和迁移能力明显下降（P<0.05）,p-Wnt和p-β-catenin蛋白表达水平下降（P<0.05）。过表达CREPT后,U251细胞增殖、侵袭和迁移能力明显增强（P<0.05）,p-Wnt和p-β-catenin蛋白水平明显升高（P<0.05）。Wnt/β-catenin通路抑制剂KYA1797K可逆转过表达CREPT对细胞增殖、侵袭和迁移的影响（P<0.05）。结论 CREPT可能通过激活Wnt/β-catenin通路促进胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭和迁移。     

下调磷酸甘油酸激酶1增强胶质瘤U251细胞的放射敏感性

目的研究磷酸甘油酸激酶1(PGK1)对胶质瘤U251细胞放射敏感性的影响。方法建立放射抵抗的U251(RR-U251)细胞;LipofectamineTM2000方法将抑制PGK1表达的shRNA-PGK1质粒或对照shRNANC转染至U251细胞;荧光定量PCR及Western Blot检测PGK1的表达;MTT检测细胞相对存活率,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果与正常U251细胞相比,RR-U251细胞中PGK1的表达明显增高;放射处理后,RR-U251细胞的相对存活率升高,迁移能力及侵袭能力增强。转染shRNA-PGK1的细胞接受放射处理后,与对照组相比,细胞的相对存活率降低,迁移能力以及侵袭能力减弱。结论下调U251细胞中PGK1的表达可增加其放射敏感性,提示PGK1可能成为增强放射敏感性的调控靶点。     

NK细胞杀伤神经胶质瘤细胞U251的体外研究

目的在体外观察同种异体NK细胞对神经胶质瘤细胞U251的杀伤活性,并探讨其机制,以寻找一种神经胶质瘤生物治疗的有效方法。方法本研究应用细胞曲线、克隆形成试验、染色体核型分析等细胞学的基本常用方法对神经胶质瘤细胞U251的生物雪特性进行了研究。结果 NKG2D-MICA/B间的相互作用确实参与NK细胞对K562和U251细胞的杀伤,抗体阻断试验并没有完全阻断NK细胞的杀伤活性,说明除了NKG2D介导的杀伤活性外,尚有其他信号通路参与NK细胞对该肿瘤的杀伤作用。靶细胞表面NKG2D配体的表达水平几乎决定了机体NK细胞免疫应答的强弱。结论同种异体NK细胞在体外对神经胶质瘤细胞有杀伤作用,其杀伤活性和神经胶质瘤细胞表面NKG2D的表达率有关。     

STIP1对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的 探讨下调磷酸化应激诱导蛋白1（STIP1）表达对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和凋亡的影响,及其对JAK2/STAT3信号通路的调控作用。方法 免疫印迹法检测体外培养的正常胶质细胞（SVG）和人胶质瘤细胞（U251、U87和U37）STIP1蛋白表达水平。NC-siRNA或STIP1-siRNA质粒转染U251细胞,CCK-8法检测U251细胞增殖;Transwell实验检测U251细胞侵袭能力;流式细胞术检测U251细胞凋亡率;免疫印迹法检测JAK2/STAT3信号通路蛋白表达水平。结果 与正常胶质细胞SVG比较,胶质瘤细胞U251、U87和U373的STIP1蛋白表达水平均明显增高（P<0.05）。与NC-siRNA组比较,STIP1-siRNA组STIP1蛋白表达水平、细胞增殖活力和细胞侵袭力明显明显降低（P<0.05）,细胞凋亡率明显增高（P<0.05）,而且,p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论 STIP1在胶质瘤细胞中呈高表达,抑制STIP1表达可以抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭、促进凋亡,机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。     

颈动脉粥样硬化斑块中HMGB1表达的改变及意义

目的探讨颈动脉粥样硬化(CAS)斑块中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达的改变,并分析其在CAS病理中的意义。方法应用免疫组化方法研究了CAS斑块中HMGB1表达的改变,并对其与炎症细胞浸润之间的相关性进行了分析。结果CAS斑块不同成分内存在不同的HMGB1表达,其中炎症细胞浸润区内表达显著增高,并与单核-巨噬细胞计数之间呈现明显的直线相关,另外在坏死区和钙化区周边基质内,存在不同程度的HMGB1聚积,而纤维化区HMGB1表达降低。结论在CAS病理过程中存在HMGB1表达的改变,并且其与炎症细胞的浸润程度具有明显的相关性。     

蒿甲醚对人胶质瘤细胞系U251细胞凋亡的影响

目的研究蒿甲醚对体外培养的人胶质瘤细胞系U251细胞凋亡的影响并初步探讨其机制。方法不同浓度蒿甲醚（25、50、100、200、400、800μmol／L）作用U251胶质瘤细胞,四甲基偶氮唑盐法测定药物抑制率和半抑制浓度（IC50）;流式细胞术检测细胞周期的变化和细胞凋亡情况;Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡情况。结果蒿甲醚对U251细胞生长抑制率随药物浓度增加而显著增加（P〈O．05）,同时随药物作用时间延长而显著增加（P〈O．05）。药物作用24、48和72h,其IC50分别为849．28±25．89、518．93±32．83和172．99±6．06μmol／L,三者之间均差异显著（P〈0．05）。经400μmol／L蒿甲醚作用48h,Hochest33258荧光染色可观察到凋亡小体。经400μmol／L蒿甲醚作用24、48、72h,细胞凋亡率分别为（4．55±0．24）％、（12．82±1．88）％和（24．22±2．17）％,三者之间均差异显著（P〈0．05）;细胞周期分析显示,随着蒿甲醚作用时间的延长,G0/G1期细胞比例显著增加（P〈0．05）,S期和G2/M期细胞比例显著减少（P〈O．05）。结论蒿甲醚能抑制U251细胞生长,呈剂量和时间依赖性;其机制可能为将细胞阻滞在G0/G1期并诱导其凋亡。     

长链非编码RNA PVT1对人脑胶质瘤U251细胞增殖能力的影响

目的 探讨长链非编码RNA PVT1（lncRNA-PVT1）对人脑胶质瘤U251细胞增殖能力的影响。方法 体外培养胶质瘤细胞系U251细胞,分别转染PVT1 siRNA（PVT1组）和negative control siRNA（对照组）。PCR法检测lncRNA-PVT1及C-MYC mRNA表达水平,CCK-8法检测细胞增殖能力,Western blot检测C-MYC蛋白表达水平。结果 PVT1组lncRNA-PVT1 mRNA表达水平（0.27±0.08）较对照组（1.0±0.30）明显降低（P<0.05）;PVT1组C-MYC mRNA表达水平（0.87±0.19）与对照组（1.0±0.15）无明显差异（P>0.05）。转染siRNA后1、2、3 d,PVT1组U251细胞活力较对照组均明显降低（P<0.05）。PTV1组C-MYC蛋白表达水平（0.29±0.12）较对照组（0.85±0.27）明显降低（P<0.05）。结论 降低lncRNA-PVT1表达水平能够抑制U251细胞增殖,其机制可能与lncRNA-PVT1够影响C-MYC蛋白的表达水平有关。     

miR-21调控人脑胶质瘤细胞侵袭能力的体外研究

目的 探讨miR-21调控人脑胶质瘤细胞侵袭能力的体外机制.方法 脂质体介导反义miR-21(AS-miR-21)转染体外常规培养的U251细胞,同时设无义寡脱氧核苷酸(ODN)组和对照组.测定荧光素酶活性验证3组细胞中miR-21的表达,Matrigel基质生长实验检测U251细胞的生长情况,Transwell细胞体外迁移实验检测U251细胞的迁移能力,Western blotting检测细胞侵袭相关蛋白局部粘着斑激酶(FAK)、基质金属蛋白酶9/2(MMP-9/2)、人基质金属蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)、微管蛋白α(Tubulin-α)的表达,免疫荧光检测细胞Tubulin-α蛋白的形态. 结果 与对照组和无义ODN组比较,转染AS-miR-21组U251细胞miR-21表达水平降低,Matrigel基质生长实验显示转染AS-miR-21组U251细胞体外培养克隆平均直径较小,Transwell细胞体外迁移实验显示转染AS-miR-21组穿膜细胞数较少,Western blotting结果 显示转染AS-miR-21组U251细胞FAK、MMP-9/2表达较低,TIMP-1表达较高,差异均有统计学意义(P＜0.05).Tubulin-α的表达无明显变化,免疫荧光染色显示转染AS-miR-21组Tubulin-α蛋白形态扭曲. 结论 miR-21高表达可以促进U251胶质瘤细胞侵袭生长,提示miR-21可以作为基因治疗脑胶质瘤的候选靶点.     

高压氧联合替莫唑胺对胶质瘤U251细胞的影响

目的研究高压氧(Hyperbaric Oxygen,HBO)联合替莫唑胺(Temozolomide)对人神经胶质瘤U251细胞株的的影响及其机制。方法实验分为4组:A组高压氧联合替莫唑胺组、B组高压氧组、C组替莫唑胺组、D组对照组。通过体外模拟缺氧微环境,用四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)、碘化丙啶(PI)染色法、流式细胞仪分别检测细胞生长抑制率、细胞死亡率、细胞凋亡率。Elisa法检测缺氧诱导因子1-α(HIF1-α)和多药耐药相关蛋白-1(MRP-1)的表达情况。结果 1高压氧联合替莫唑胺组在细胞生长抑制率、细胞死亡率和细胞凋亡率上明显高于其他组,数值均有统计学意义(P<0.05)。2高压氧联合替莫唑胺组与高压氧组在HIF1-α和MRP-1上无统计学意义(P>0.05),与其他组有统计学意义(P<0.05)。结论高压氧够增强替莫唑胺化疗效果,高压氧纠正了肿瘤的缺氧环境,下调了HIF1-α和MRP-1的表达,这可能是治疗作用的关键所在。     

二氢杨梅素促进胶质瘤U251细胞凋亡的实验研究

目的 探讨二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DHM)对人胶质瘤U251细胞凋亡的促进作用及其机制。方法 将体外培养的胶质瘤U251细胞分为对照组和DHM组(根据DHM水平的不同分为3个亚组),MTT法观察细胞活性,Hoechst 33258核染色法观察细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡率,透射电镜观察细胞形态,Western blot检测Bax和bcl-2蛋白表达水平。结果 Hoechst 33258核染色和流式细胞仪检测显示,随着DHM水平的增高,U251细胞凋亡率呈剂量依赖性增高; 电镜观察显示,对照组胶质瘤U251细胞形态正常,DHM组胶质瘤U251细胞肿胀,细胞器呈碎片样分散,随着DHM水平升高,线粒体、内质网等细胞器结构破坏明显。此外, DHM处理后Bax蛋白表达水平增高,Bcl-2蛋白表达水平降低。结论 DHM可能通过改变Bax及Bcl-2蛋白表达水平来抑制胶质瘤U251细胞增殖并促进其凋亡。     

小鼠HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在真核细胞中的表达

目的 构建小鼠高迁移率族蛋白B1(HMGB1)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内HMGB1的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法 采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-HMGB1p;脂质体法瞬时转染NIH3T3细胞.观察HMGB1启动子存正常情况下以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激后的细胞内活性.结果 酶切鉴定和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基凼载体正确:该载体在NIH3T3细胞内静息状态呈低水平表达,经TNF-α刺激后,观察到表达高亮度红色荧光的细胞明显增多.结论所构建的HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体正确,具有正常启动蛋白表达的活性,可有效用于HMGB1基因表达信号调控机制的研究.