抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定鼠源抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ单克隆抗体（Monoclonal Antibody,McAb）。方法重组Der fⅡ蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠免疫脾细胞与NS-1细胞融合。间接ELISA法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞。用筛选获得的单克隆细胞株诱生小鼠腹水,蛋白G亲和层析法纯化腹水抗体。利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting方法鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。结果获得5株IgG2a型鼠抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ的单克隆抗体,效价良好。ELISA和Western Blotting分析表明该5株单抗均可识别重组Der fⅡ蛋白和天然粉尘螨提取物。结论成功制备了5株鼠抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Der fⅡ的检测及纯化方法奠定了基础。     

3 种常见尘螨分子进化关系的初步探讨

为探讨粉尘螨（Dermatophagoides farinae）、屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）和梅氏嗜霉螨（Euroglyphus maynei）的分类，采用PCR扩增获得粉尘螨1类(Der f 1)和2类变应原(Der f 2)的cDNA片段，经测序后推导氨基酸序列, 与GenBank中的屋尘螨Der p 1、Der p 2和梅氏嗜霉螨Eur m 1、Eur m 2氨基酸序列进行比对，分别构建1类和2类变应原分子进化树。结果显示变应原之间相似度，Der p 1与Eur m 1为86%，Der p 1与Der f 1为83%；Der p 2与Eur m 2为87%，Der p 2与Der f 2为67%。用变应原氨基酸序列构建分子进化树，1类变应原Der p 1与Eur m 1聚成一簇，2类变应原Der p 2与Eur m 2聚成一簇。结果表明屋尘螨和梅氏嗜霉螨亲缘关系较近，而与粉尘螨较远。     

粉尘螨1类变应原重组融合表位免疫治疗小鼠哮喘的效果分析

目的 目的 探讨粉尘螨1类变应原重组融合表位对哮喘小鼠的免疫治疗效果。 方法 方法 将40只小鼠随机分为阴性 对照组、 哮喘组、 Der f 1治疗组和重组融合变应原Der f 1A治疗组等4组。哮喘组、 Der f 1治疗组和Der f 1A治疗组小鼠 用粉尘螨提取液于第1、 7、 14 d进行3次腹腔注射致敏, 并于第21 d开始雾化吸入激发, 持续7 d。其中治疗组于雾化吸 入前30 min, 分别用Der f 1、 Der f 1A进行特异性免疫治疗。对照组用磷酸盐缓冲液 （PBS） 进行腹腔注射和雾化吸入。完 成雾化吸入激发后, 计数支气管肺泡灌洗液 （BALF） 中白细胞总数; 观察肺组织病理切片; 检测BALF与脾细胞培养上清 液 （SCCS） 中IL?5、 IFN?γ和血清中特异性IgE、 IgG2a水平。 结果 结果 与哮喘组相比, 免疫治疗组小鼠肺部炎症明显减轻, 且 BALF中白细胞总数明显降低; 免疫治疗组小鼠BALF和SCCS中IL?5水平显著降低, IFN?γ水平则显著升高; 血清中变应 原的特异性IgE抗体水平显著降低, IgG2a抗体水平则显著升高 （P均< 0.01）。 结论 结论 粉尘螨1类变应原重组融合表位能 够有效减轻小鼠的哮喘症状, 为诊断和治疗过敏性哮喘奠定了基础。     

粉尘螨Ⅲ类重组变应原致敏的小鼠哮喘模型致敏效果分析

目的 探讨粉尘螨Ⅲ类重组变应原（Der f3）诱导的小鼠哮喘模型的致敏效果。方法 30只6~8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠随机分为PBS组（阴性对照组）、卵清蛋白（OVA）组（阳性对照组）和Der f3组（实验组）,OVA组和Der f3组分别使用OVA和纯化Der f3蛋白于第0、7、14天进行腹腔注射致敏,于第21d开始雾化吸入,连续7d,PBS组则换成PBS进行腹腔注射和雾化吸入。最后一次雾化吸入24h后,分别观察肺组织病理变化、支气管肺泡灌洗液（BALF）中的白细胞计数,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定BALF和脾细胞培养上清中IL-4、IL-2、IL-17和IFN-γ的含量及血清中IgG1、IgE抗体水平变化;结果OVA组和Der f3组小鼠肺部支气管、血管粘膜下及周围肺组织有明显的炎性细胞浸润、支气管上皮细胞部分断裂及脱落,血管壁明显水肿等,而PBS组未见明显病理改变;Der f3组的BALF中白细胞总数[(19.99±1.03)×106个/ml]及嗜酸性粒细胞（EOS）[(1.81±0.07)×106个/ml]计数均明显高于PBS组（P<0.01）;与PBS组相比：BALF中IL-4 [(80.99±9.06) pg/ml]、IL-17 [(209.69±31.86) pg/ml]呈高水平表达（P<0.01）,而IL-2 [(8.29±1.27) pg/ml]和IFN-γ [(55.04±18.85) pg/ml]含量则显著下降（P<0.01）;上述指标在脾细胞培养上清中出现类似的变化。Der f3组血清中IgE [(31.92±2.68) U/ml]、IgG1 [(16.46±4.32) μg/ml]的含量表现为Th2型反应增强趋势;但OVA组和Der f3组间所有指标差异均无统计学意义（P>0.05）;结论 粉尘螨重组Der f3蛋白可成功建立小鼠变态反应性气道及肺部炎症动物模型。     

Der f 1血清特异性IgE ELISA检测方法的建立

目的利用粉尘螨变应原第1组分重组蛋白rDer f 1建立特异性IgE ELISA检测方法,并对哮喘患者血清进行检测。方法以rDer f 1为包被抗原,分别建立间接ELISA法和亲和素-生物素复合ELISA(ABC-ELISA)法,检测Der f 1特异性IgE阳性标准血清和39例哮喘患者血清中的Der f 1特异性IgE,并分析检测结果。结果间接ELISA法和ABC-ELISA法检测Der f 1特异性IgE的最适抗原包被浓度和血清稀释倍数均为15μg/ml和1︰2,间接ELISA法辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人IgE抗体适宜稀释倍数为1︰1 000,ABC-ELISA法生物素标记抗人IgE抗体和HRP标记亲和素的稀释倍数分别为1︰1 000和1︰2 000。用间接ELISA和ABC-ELISA检测IgE的灵敏度分别为0.68U/ml和0.73U/ml,检测患者血清中Der f 1特异性IgE的阳性率分别为92.3%和97.4%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论基于重组变应原rDer f 1的ELISA法检测粉尘螨特异性IgE具有较高的敏感度,可用于螨过敏性疾病的实验诊断。     

粉尘螨3类变应原基因的克隆、表达、纯化与变应原性鉴定

目的 克隆表达粉尘螨3类变应原（Der f 3）基因，并鉴定纯化蛋白的变应原性。 方法 取华南地区采集经实验室培养的粉尘螨（约500只）提取总RNA，经RT-PCR扩增Der f 3基因。将目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 3。大肠埃希菌（E.coli）BL21（DE3）经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导培养，表达Der f 3目的蛋白。重组rDer f 3蛋白经6His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化，蛋白质印迹法（Western blotting）分析该纯化Der f 3蛋白与粉尘螨过敏患者血清IgE反应性，以鉴定重组Der f 3的变应原性。 结果 以粉尘螨总RNA为模板克隆出Der f 3基因，该基因与GenBank（D63858）公布的Der f 3比较有4个核苷酸差异，但同源性为99.5%。E.coli BL21（DE3） 经IPTG诱导后高效表达Der f 3重组蛋白，主要以包涵体形式存在。经Western blotting分析该重组蛋白Der f 3能与粉尘螨过敏患者血清的IgE反应，而不与健康者血清IgE反应。 结论 构建了华南地区粉尘螨3类变应原的原核表达载体，并高效表达和纯化出具变应原性的Der f 3重组蛋白。     

粉尘螨主要变应原基因Der f2和Der f3基因改组的优化

目的 优化粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因。方法 RT-PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因,用DnaseⅠ分别酶解Der f2和Der f3基因10、15、20、25、30min;酶解相同时间的Der f2和Der f3基因两两混合,采用DNA shuffling技术对粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因进行重组,电泳检测重组子。结果 以Der f1 F和Der f1 R、Der f2 F和Der f2 R为引物分别在酶切10min、15min、20min、25min均可扩增出清晰条带;以Der f2 F和Der f3 R为 引物在酶切10min、15min和30min的模板中亦出现PCR片段。结论 通过多种条件的组合,可获得多个粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因间的融合基因,为大规模制备高效,低价的哮喘疫苗奠定基础。     

标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原Der f 2含量测定

目的研制粉尘螨Ⅱ组变应原Der f 2单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb),并建立双单抗夹心ELISA检测方法 ,测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f 2的含量。方法应用基因工程方法获得粉尘螨变应原Der f2重组蛋白并通过亲和层析纯化,再免疫小鼠,利用间接ELISA筛选获得McAb杂交瘤细胞株并纯化、鉴定抗体的特异性;用一株单抗包被酶标板,同时用生物素标记另一株单抗,从而建立双单抗体夹心ELISA法;并用此法测定粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f2的含量。结果成功地获得了一株单抗3B12与屋尘螨抗原具有交叉反应,另外一株单抗3G7与屋尘螨抗原没有交叉反应,并建立了双单抗夹心ELISA方法测定Der f2的含量,其方法的检测限为0.5ng/mL,并在6.25ng/mL-300ng/mL范围内线性良好;标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f2的含量为100ng/10000BAU。结论成功制备了高效价抗Der f 2单抗,并建立了双抗体夹心ELISA检测方法。该方法具有很高的灵敏度,可以测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原Der f 2含量,为临床应用奠定基础。     

屋尘螨和粉尘螨主要变应原的序列多态性分析

目的 探讨不同地域间屋尘螨和粉尘螨主要变应原变异体的差异。方法 分别提取中国华南地区培养的粉尘螨和欧洲商业化培养的屋尘螨和粉尘螨的螨体、螨卵和全螨培养物总RNA,采用RT-PCR技术扩增第1组变应原的包含前导肽段、酶原肽段和成熟肽段,以及第2组变应原的包含前导肽段和成熟肽段的目的片段,根据国际标准参照物进行序列比较。 结果 欧洲商业化的屋尘螨Der p 1主要变异体是Der p 1.0105,除了第124V、50Y和19M位氨基酸有频繁的置换外,其余为散在的置换,出现8种新的变异体;Der p 2主要变异体是Der p 2.0104,置换集中在第40V、4T7、111M和114D位,出现6种新的变异体。中国华南地区的粉尘螨Der f 1变异体很少,出现3种新的变异体;与欧洲商业化的粉尘螨相比,中国华南地区有不同的Der f 2变异体,出现6种新的变异体。来自螨体、螨卵和全螨培养物的各主要变应原变异体无明显差异。 结论 不同地域间尘螨的主要变异体不同。     

上海市居室尘螨变应原浓度初步检测

目的检测上海市居室尘螨变应原浓度。方法应用层析介质及蛋白质沉淀技术从螨代谢分泌物中分离、纯化粉尘螨变应原Dff F3及国际公认的变应原Der fⅢ,经临床检测和放射性变应原吸附实验(RAST)鉴定其变应原性。制备抗Dff F3和Der fⅢIgG,从室内收集尘埃,分离尘螨抗原,夹心ELISA测定尘螨变应原Dff F3和Der fⅢ浓度。结果Dff F3和Der fⅢ呈现强致变应性,均能与尘螨过敏哮喘患者血清IgE结合。检测200份家庭尘埃样品尘螨变应原,结果显示,Dff F3浓度>10μg/g的家庭占57.0%,2~10μg/g的家庭占29.5%,<2μg/g的家庭占13.5%。Der fⅢ浓度>10μg/g的家庭占53.5%,2～10μg/g的家庭占32.0%,<2μg/g的家庭占14.5%。结论上海市部分居室尘螨变应原浓度偏高。粉尘螨Dff F3有较强的变应原性。     

空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1基因的检测

目的应用PCR技术检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1的基因。方法从深圳和北京地区分别收集20台、10台空调过滤网上的灰尘样品,分别提取其生物总基因组DNA作PCR模板,分别设计Der f1和Der p1各两套内外扩增引物分两步进行PCR,通过扩增出目的片段来检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1基因片段,并以深层泥土DNA提取物为阴性对照和以培养的粉尘螨、屋尘螨基因组DNA提取物为阳性对照。PCR产物经电泳后切胶回收目的片段并克隆到T载体上,进行DNA序列分析并与Gen Bank进行同源性比较分析。结果深圳地区20台空调空气滤网上收集的灰尘中均含有粉尘螨和屋尘螨主要变应原Der f1和Der p1基因片段;北京地区10台空调空气滤网上收集的灰尘样品中,只有4份均含有Der f1和Der p1;它们扩增部分的序列与GenBank数据库里相应序列同源性为100%。从阴性对照提取物中未扩增得到目的变应原Der f1和Der p1基因片段,从阳性对照的DNA提取物中分别扩增得到目的变应原Der f1和Der p1基因片段。结论本研究首次应用分子生物学技术证实了空调空气滤网上的灰尘中存在尘螨主要变应原Der f1和Der p1基因,并提示深圳地区空调过滤网灰尘中尘螨可能比北京地区的多,从而为今后防治空调中尘螨引起的变态反应性疾病提供了依据。     

Mite allergen levels and acarologic analysis in house dust samples in Uberaba, Brazil.

Mite allergen exposure has been widely related to sensitization and development of allergic diseases. This study intended to evaluate the degree of allergen exposure in Uberaba, Brazil, through the measurements of Der f 1 and Der p 1 allergen levels associated with the acarologic analysis in house dust samples. A total of 240 dust samples were collected from 60 houses through vacuuming sofas and bedding, during the months of March and July 2000. Indoor temperature and relative humidity were also measured. Mites were counted and identified under light microscopy and allergen levels were measured by two-site monoclonal antibody ELISAs. The major mite family was Pyroglyphidae (39.4%), having D. pteronyssinus as the most frequent species (15.6%), followed by D. farinae (12.3%) and E. maynei (7.9%). The family Glycyphagidae was less commonly found (4.8%), with Blomia tropicalis (4.4%) as its majoritary member. The highest levels of Der f 1 and Der p 1 allergens were found in bedding samples in March (31.7 and 0.9 microg/g of dust, respectively), with Der f 1 levels significantly higher than Der p 1 (p < 0.0001). There was a significant positive correlation between the mite number and allergen levels. These results indicate that Dermatophagoides sp are the most frequent mites in our region followed by E. maynei. Therefore, the knowledge of the local mite fauna would improve the means of investigating the association between allergen exposure and sensitization, allowing the addition of new mite extracts in diagnostic tests.     

粉尘螨第24组过敏原cDNA克隆表达及其免疫学特性的研究

目的 克隆表达粉尘螨第24组过敏原cDNA,研究其免疫学特性,为深入研究尘螨致敏机制提供基础。方法 以粉尘螨cDNA文库为模板,根据Der f24基因序列(GenBank Accession No.KC669700)设计引物, PCR扩增Der f24 cDNA,构建原核表达载体pET-His-Derf24,并经酶切鉴定和DNA测序,转化至E.coli BL21(DE3)plysS,用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导表达;重组产物经Ni²⁺螯合层析纯化,获得重组的Der f24(14 kDa);对重组蛋白进行IgE-Western blotting(WB)实验和IgE-ELISA实验;通过Swiss-model软件模拟Der f24的3D结构并通过DNAStar软件分析其潜在的B细胞表位,合成三个肽(位置分别为75-88 aa、44-57 aa和104-117 aa)进行IgE-ELISA实验。结果 克隆的Der f24基因cDNA序列全长为357 bp,编码118个氨基酸(GenBank Accession No. KP064571);Der f24原核表达主要形式为不可溶的包涵体,纯化后的重组Der f24蛋白分子量约为14 kDa。IgE-WB结果显示,重组Der f24与10例粉尘螨过敏患者血清呈强阳性反应,而与10例健康对照组均为阴性。IgE-ELISA结果显示,合成表位肽(No.1 75-88 aa:Z=5.6734、No.2 44-57 aa:Z=5.6720和No.3 104-117 aa:Z=5.6791;P< 0.0001)均与22例粉尘螨过敏患者血清呈阳性反应,而与22例健康对照组血清呈阴性反应。结论 本研究成功克隆表达了Der f24 cDNA,重组Der f24可结合粉尘螨过敏血清IgE,鉴定了3个潜在的IgE B细胞表位。本研究为进一步防治螨性过敏性疾病奠定了技术基础。     

华南地区粉尘螨主要变应原Derf2的cDNA克隆及序列分析

目的克隆并分析华南地区粉尘螨主要变应原Derf2的cDNA片段。方法广州地区收集、鉴定、培养的粉尘螨,提取总RNA,RT-PCR扩增其Derf2片段,连接入T载体,测序和分析。结果Derf2片段长度为558bp,与GenBank公布的Derf2(D10448)的核酸序列比较,在62个核苷酸处插入了87个核苷酸,插入点前后的核酸序列没有差异,按原读码框进行读码显示插入了29个氨基酸,插入点前后的氨基酸序列没有改变。结论获得华南地区粉尘螨的Derf2cDNA片段,和已公布的序列相比,有较大差异。     

Dynamics of the number of house dust mites and the accumulation of groups 1 and 2 allergens in simple periodic cultures

Dynamics of the number and biomass of D. pteronyssinus and D. farinae and the concentration of major significant mite allergens of groups 1 and 2 were studied in simple periodic cultures. The experiments provided evidence for that there is a positive relationship between the concentration of mite allergens Der p I, Der p II, Der f I, Der f II and the number of mites D. pteronyssinus and D. farinae, as evidenced by both correlation coefficients and curves. The same relationship was seen while examining the number of mites and the exposure of mite allergens in house dust. The findings suggest that the concentration of major mite allergens of Groups 1 and 2 in addition to the number/biomass of mites are one of the most important criteria for the maturity of the culture. The cultures of D. pteronyssinus and D. farinae mature no later than on day 29 of the onset of cultivation, as shown by the maximum concentrations of Der p I, Der p II, Der f I, Der f II and mite biomass, achieved in this period.     

粉尘螨Der f4变应原的提纯及其淀粉酶活性分析

采用上海医科大学医学螨类研究室培养的粉尘螨提纯粉尘螨４类变应原，并对其作淀粉活性分析。     

空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Derfl和Derpl基因的检测

目的应用PCR技术检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Derfl和Derpl的基因。方法从深圳和北京地区分别收集20台、10台空调过滤网上的灰尘样品，分别提取其生物总基因组DNA作PCR模板。分别设计Derfl和Derpl各两套内外扩增引物分两步进行PCR，通过扩增出目的片段来检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Derfl和Derpl基因片段，并以深层泥土DNA提取物为阴性对照和以培养的粉尘螨、屋尘螨基因组DNA提取物为阳性对照。PCR产物经电泳后切胶回收日的片段并克隆到T载体上，进行DNA序列分析并与GenBank进行同源性比较分析。结果深圳地区20台空调空气滤网上收集的灰尘中均含有粉尘螨和屋尘螨主要变应原Derfl和Derpl基因片段；北京地区10台空调空气滤网上收集的灰尘样品中，只有4份均含有Derfl和Derpl；它们扩增部分的序列与GenBank数据库里相应序列同源性为100％。从阴性对照提取物中未扩增得到目的变应原Derfl和Derpl基因片段，从阳性对照的DNA提取物中分别扩增得到目的交应原Derfl和Derpl基因片段。结论本研究首次应用分子生物学技术证实了空调空气滤网上的灰尘中存在尘螨主要变应原Derfl和Derpl基因，并提示深圳地区空调过滤网灰尘中尘螨可能比北京地区的多，从而为今后防治空调中尘螨引起的变态反应性疾病提供了依据。