胰岛素和IGF-1对成骨样细胞MG63 I型胶原基因表达的影响

目的应用胰岛素(INSU)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)干预体外培养的人成骨样细胞MG63,并以17-雌二醇(E2)做阳性对照。观察药物干预对MG63细胞Ⅰ型胶原(COL1)表达的影响。方法用DMEM培养基培养MG63细胞,并以INSU、IGF-1、E2进行干预。抽提各样本总RNA后,行逆转录并对COL1的cDNA进行荧光扩增和定量。结果各药物组内基因拷贝数(COPYS)均有统计学差异(P<0·05),各组药效呈浓度依赖性增加趋势。在本实验所选的药物浓度范围内,INSU、IGF-1、E2各药物组的最高药效浓度均为本实验所用的最高药物浓度,分别为2×10-7mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L。3组间有统计学差异(P<0·05),INSU和IGF-1组COPYS增长率明显大于E2组,INSU和IGF-1组比较无统计学差异。结论INSU、IGF-1和E2一样,均有显著促进MG63分化的作用。     

美兰染色对药物干预后成骨样细胞增殖功能的检测

目的用胰岛素(INSU)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)干预体外培养的人成骨肉瘤细胞MG63(MG63),并以17-β雌二醇(E2)做阳性对照.观察细胞增殖功能的改变,为治疗OP提供实验依据.方法将MG63细胞接种到DMEM培养基中培养,并进行药物干预.用美兰染色,酶标仪测定细胞OD值.结果各药物组内OD值比较均有统计学差异(P＜0.05),量效关系呈抛物线形.三药物组间细胞增殖率差异无统计学意义(P＞0.05).三组药物的最佳药物浓度分别为5×10-8 mol/L、5×10-8mol/L、10-8 mol/L.结论与E2相同,INSU、IGF-1两种药物均有促进MG63细胞增殖的作用.     

Bcl2及Bak1重组表达腺病毒对MG63细胞的影响

目的研究Bcl2、Bak1重组表达腺病毒载体单独或共转染对MG63细胞活性及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的影响。方法收集对数期MG63细胞,分为4组:A组:空载腺病毒干预组;B组:Bcl2重组表达腺病毒转染组;C组:Bak1重组表达腺病毒转染组;D组:Bcl2、Bak1重组表达腺病毒共转染组。A组给予空载腺病毒转染,B、C组分别给予Bcl2重组表达腺病毒、Bak1重组表达腺病毒转染,D组给予Bcl2、Bak1重组表达腺病毒共转染,MTT法检测细胞活性,碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)活性检测试剂盒检测ALP活性,流式细胞仪检测钙离子浓度,Western Blot检测CTGF、Runx2、OPN、TNF-α的表达。结果与A组相比,B组细胞活性、ALP活性升高,钙离子浓度降低,CTGF、OPN、Runx2蛋白相对表达量均升高,TNF-α表达量则降低,差异有统计学意义(P0.05);C组细胞活性、ALP活性降低,钙离子浓度升高,各蛋白相对表达趋势与B组相反,差异有统计学意义(P0.05);D组细胞活性、ALP活性、钙离子浓度升高,CTGF、Runx2相对表达量升高,OPN、TNF-α相对表达量降低,但差异均无统计学意义(P0.05)。(2)B组、C组、D组各检测指标组间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 Bcl2重组表达腺病毒载体转染MG63细胞可增强细胞活性及钙化能力,促进骨形成。     

hsa-miR-655靶向CLCF1基因对人成骨肉瘤MG63 细胞OPG/RANKL系统表达的影响

目的探讨hsa-miR-655通过靶向调控心肌营养素样细胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1,CLCF1)基因表达,对人成骨肉MG63细胞系增殖、护骨素(osteoprotegerin,OPG)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)表达的影响。方法通过hsa-miR-655慢病毒转染MG63细胞进行功能获得实验。实验分阴性对照组(NC组)和hsa-miR-655过表达组(OE组),荧光显微镜和流式细胞术(flow cytometry analysis,FCM)评估转染效率,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖能力,FCM检测细胞周期分布,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测hsa-miR-655、CLCF1、OPG和RANKL mRNA的水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测CLCF1、OPG及RANKL蛋白的变化。结果荧光显微镜和FCM显示对照组和miR-655过表达组感染效率为80%以上;qRT-PCR结果显示,相对于对照组,过表达组MG63细胞hsa-miR-655表达上调,差异有统计学意义(P=0.0004);CLCF1 mRNA水平未见明显变化(P=0.0986);过表达组OPG(P=0.0384)、RANKL(P=0.0007)mRNA均有所上调,差异具有统计学意义(P0.05);Western blot结果显示,过表达组CLCF1蛋白水平表达下调(P=0.0053);与对照组比较,过表达组OPG(P=0.0021)、RANKL(P=0.0002)蛋白均上调,而OPG/RANKL比值却降低(P=0.0078),差异具有统计学意义(P0.05);CCK-8细胞增殖实验结果显示,miR-655过表达后抑制MG63细胞增殖;FCM检测细胞周期结果显示,miR-655过表达后MG63细胞G0/G1期细胞比例增加,S期减少,差异具有统计学意义(P0.05)。结论hsa-miR-655通过负调控CLCF1基因的表达,抑制MG63细胞的增殖,下调OPG/RANKL的比值。     

siRNA下调THBS4对人骨肉瘤MG63增殖的影响

目的探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制血小板反应蛋白4(thrombospondin 4,THBS4)基因的表达对骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响及其分子机制。方法将合成的THBS4 siRNA转染到人成骨细胞株MG63,CCK-8法观察对细胞增殖的影响,荧光定量PCR检测THBS4及TGF-beta1的mRNA表达,Western-blotting检测THBS4及TGF-beta1的蛋白表达。结果 Thbs4 siRNA转染后实验组48 h,72 h OD值高于阴性对照组(P0.05),差异具有显著性;Thbs4 mRNA和蛋白的表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P0.01);Thbs4 siRNA转染后MG63细胞中TGF-beta1 mRNA及蛋白的表达水平提高(P0.01)。结论 THBS4 siRNA转染MG63后能够促进细胞增殖,其机制可能是激活TGF-beta1信号通路。     

瘦素对人成骨样细胞MG63 Ⅰ型胶原A1基因表达的影响

目的 探讨瘦素对人成骨样细胞MG63 Ⅰ型胶原A1基因表达的影响.方法 MG63细胞以3个不同浓度的瘦素(10~(-8)～10~(-6) mol/L)分别干预24、48、72 h,用实时荧光定量PCR法检测MG63细胞Ⅰ型胶原A1基因 mRNA的表达量,分析量效关系和时效关系,以17β-雌二醇作为阳性对照.结果 瘦素可上调MG63细胞Ⅰ型胶原A1基因 mRNA的表达,并存在浓度依赖和时间依赖效应,其最佳浓度为10~(-7) mol/L,最佳作用时间点为72 h.17β-雌二醇则以10~(-7) mol/L浓度组在24 h表达为最强.结论 瘦素可上调MG63细胞Ⅰ型胶原A1基因mRNA的表达,其作用较17β-雌二醇持久和滞后.     

淫羊藿苷对人成骨样细胞成骨分化及OPG/RANKL 表达的影响

目的探讨淫羊藿苷对人成骨样细胞(MG-63)成骨分化及OPG/RANKL表达的影响。方法用1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1μmol/L、10μmol/L 5种浓度的淫羊藿苷对MG-63进行干预,并同时进行成骨诱导,RT-PCR在第3天检测其细胞增殖基因MYC、CDK7表达量,在第6天检测成骨分化标志基因RUNX2、COL1A1及OPG、RANKL的表达量。结果对成骨分化相关基因,10 nmol、1μmol干预的MG-63 RUNX2基因表达量较1 nmol及10μmol的高(P0.05),与100 nmol及空白对照组没有明显差别(P0.05),10μmol的RUNX2蛋白表达量较其余各组更高;COL1A1的基因表达呈剂量依赖型,随浓度的增加而升高,10μmol的表达量较其余各组有明显升高(P0.05),其蛋白表达也更多;RANKL的表达量极低,且在各组之间均无明显差异(P0.05);OPG的表达在1μmol浓度时较100 nmol、10μmol明显增高(P0.05),与1 nmol、10 nmol及空白组没有统计学差异(P0.05);与细胞增殖相关的MYC的表达各组之间均没有差异(P0.05),而CDK7的表达均较空白组降低(P0.05)。结论 10μmol/L的淫羊藿苷能够明显促进MG-63细胞的成骨分化,但并不通过影响OPG/RANKL起效。     

利塞膦酸钠对人成骨样细胞MG63 OPG及TNFα表达的影响

目的研究利塞膦酸钠对人成骨样细胞MG 63护骨素（OPG）及肿瘤坏死因子α（TNFα）表达的影响，以阐明利塞膦酸钠发挥骨保护作用的机制。方法以不同浓度（10^-10mol／L；10^-9mol／L；10^-8mol／L；10^-7mol／L）的利塞膦酸钠干预MG 63细胞72h；ELISA法测定细胞条件培养液中OPG及TNFα的含量。结果利塞膦酸钠可下词MG 63细胞TNFα的表达；上调OPG的表达；并提高碱性磷酸酶（ALP）活性。结论利塞膦酸钠可通过调节成骨样细胞MG 63 OPG、TNFα的表达，从而发挥其抗骨吸收的作用．     

靶向IGF-1R的siRNA表达载体的构建及其对肺癌细胞的促凋亡作用

目的构建IGF-1R的siRNA表达载体，并观察其在人肺腺癌A549中对IGF-1R表达抑制及诱导细胞凋亡的作用。方法设计并构建了pENTR／U6-shRNA-1和pENTR／U6-shRNA-2，同时设计并构建了pENTR／U6-shRNA—luc作为对照，转染A549细胞，48h后检测IGF-1R表达及分析细胞凋亡情况。结果相对于对照组，pENTR／U6-shRNA-1和pENTR／U6-shRNA-2转染组IGF-IR mRNA的表达量分别为（22．1±2．5）％和（80．1±3．9）％，蛋白的表达分别为（15．2±3．1）％和（47．1±4．1）％，组间差异具有统计学意义（P〈0．05）。pENTR／U6-shRNA-1转染组抑制了Akt的磷酸化，增加了3％乙醇诱导的细胞凋亡作用，并使77．5％细胞停留在G0／G1期。结论IGF-1R的siRNA表达载体能有效地抑制IGF-1R的表达和诱导细胞凋亡。     

肺癌抑癌基因1对人骨肉瘤细胞株MG63生长和增殖的影响

目的 观察肺癌抑癌基因1(TSLC1)对人骨肉瘤细胞株MG63的生长和增殖能力的影响.方法 将稳定表达TSLC1的人骨肉瘤MG63细胞株M8T设为研究对象,转染空载体的骨肉瘤MG63细胞株M8P设为对照组,人骨肉瘤细胞株MG63设为空白组.噻唑蓝(MTT)法检测M8T细胞增殖;FACSort流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡;将2×107个瘤细胞皮下注射裸鼠,观察体内成瘤的影响.结果 稳定转染TSLCl的实验组M8T细胞株与对照组及空白组细胞比较,其细胞增殖能力下降,生长速度明显受到抑制;M8T细胞G0-G1期细胞数为(63.76 ±2.78)％,生长周期出现了G0～G1期阻滞,细胞凋亡总数为(28.45 ±0.65)个,显著增加(P＜0.01);裸鼠皮下成瘤于皮下注射后3周开始形成.结论 TSLC1能明显抑制骨肉瘤MG63细胞的生长和增殖.     

肺癌抑癌基因-1对人骨肉瘤细胞株MG63的侵袭和转移抑制效应研究

目的观察肺癌抑癌基因-1（TSLC1）稳定转染至骨肉瘤细胞株后对其侵袭、转移及裸鼠皮下成瘤能力的影响。方法采用稳定表达TSLC1基因的人骨肉瘤细胞株M8T为研究对象,转染空载体的细胞系M8P设为对照组,MG63细胞株为空白组;Transwell法检测三组细胞株的体外侵袭和迁移能力;将细胞制成1×107细胞悬液,于裸鼠尾静脉注射,第4周开始处死裸鼠,肉眼及镜下观察肺部转移灶形成情况,肺组织石蜡包埋切片HE染色检测。将0.5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬2×107细胞皮下注射5周龄裸鼠,皮下肿瘤生长情况1周检测1次。结果 M8T细胞株体外侵袭细胞数目为（25.86±2.12）,迁移的细胞数目为（37.55±3.46）;其裸鼠皮下成瘤形成时间：于注射后第4周开始生长,较对照组和空白组细胞株成瘤时间晚,体积显著减小,体内肺转移形成时间为注射后第9周,肺部转移灶发生率为40%。结论 TSLC1基因可明显抑制人骨肉瘤细胞的侵袭和转移及皮下成瘤能力。     

生长激素对胰腺癌移植瘤细胞周期及宿主IGF-1与小肠黏膜形态的影响

目的探讨生长激素(GH)对胰腺癌移植瘤细胞周期及对宿主胰岛素样生长因子1(IGF-1)、小肠黏膜形态的影响。方法2003-2005年在中国协和医科大学北京协和医院取BALB/c裸小鼠53只,以胰腺癌细胞SW-1990成瘤后随机分为注射GH的实验组(GH组,分为A组:GH4mg每日1次共2周;B组:GH2mg共2周;C组:GH2mg共3周)及对照组(NS组),于最后一次注药后检测血浆IGF-1,分析肿瘤的细胞周期,观察肿瘤与小肠黏膜的超微结构。结果GH未能改变胰腺癌移植瘤细胞周期各期(G1、G2M、S)的百分率,也不影响肿瘤细胞的超微结构;GH可提高宿主血浆中的IGF-1水平;GH作用后小肠吸收上皮、杯状细胞呈现显著的功能旺盛状态。结论GH不能改变胰腺癌在体肿瘤的细胞增殖特性,但有利于维持小肠黏膜的形态。     

稳定表达TSLC1基因骨肉瘤MG63细胞系的建立及鉴定

目的 建立稳定表达人肺癌抑癌基因-1（TSLC1）骨肉瘤细胞系并对其进行鉴定.方法 脂质体转染的方法 将真核表达载体pCI-TSLC1稳定转染至MG63细胞系,经克隆化培养以及G418筛选,获得了1株稳定高表达TSLC1蛋白的细胞系.对其表达的蛋白性质进行了鉴定,对其分泌动态、细胞纯度、遗传稳定性、外源基因整合等生物学特性做了鉴定.结果 获得高表达TSLC1的稳定细胞系,命名为M8T.生物学性状研究结果 表明该转基因细胞系纯度好,遗传性状稳定,抽提细胞RNA进RT-PCR,扩增到与预期结果 大小一致的DNA片段,说明TSLC1基因成功整合到细胞基因组中.细胞系无细菌和霉菌污染.结论 成功建立了稳定表达TSLC1的骨肉瘤细胞系M8T.该细胞系遗传性质稳定,为进一步研究抑癌基因TSLC1在骨肉瘤中的作用奠定了基础.     

The effects of unilateral testicular ischemia and hemicastration on contralateral testicular IGF-1 level,histology and lipid peroxidation

Hemicastration is followed by compansatory hypertrophy whereas unilateral testicular torsion is followed by atrophy in contralateral testicle in rats. Insulin-like growth factor (IGF-1) has important roles in testicular paracrine and autocrine functions. In this study it was aimed to compare ischemic parameters and IGF-1 levels in the contralateral testicle in unilateral spermatic cord ligation, testicular torsion, and hemicastratron. 32 wistar rats were equally altocated into sham, ligation, torsion, and hemicastration groups. In ligation group, right spermatic cord was ligated with 3/0 silk suture. In the torsion group, right testis was tcrsed for 720 degrees. In hemicastration group, right orchiectomy was done. 48 hours later left orchiectomy was done in all groups. Malondialdehyde (MDA) and IGF-1 levels were determined in the testicle. Average values of the groups were compared with Anova followed by Dunnett T3 multiple comparison tests. MDA levels were significantly reduced in ligation and torsion groups (p < 0.05). This reduction was more prominent in hemicastration group (p < 0.05). Contralateral testicular IGF-1 levels in ligation and torsion groups were not different compared with the sham group. Left testicular IGF-1 level in the hemicastration group was decreased significantly compared with other groups (p < 0.05). Histological. changes evaluated. Contralateral Johnsen's testicular biopsy scores were significantly decreased in all experimental groups but mean tubular diameter was not changed in all groups.     

反义RNA抑制Survivin在人骨肉瘤细胞系MG63中表达的实验研究

[目的]研究人骨肉瘤细胞MG63中反义RNA对Survivin表达的抑制作用。[方法]培养骨肉瘤细胞MG63，采用RT—PCR的方法克隆人Survivin基因编码区cDNA。构建Survivin的反义诱导表达载体。转染MG63细胞，G418筛选稳定转染的细胞系。稳定转染的细胞系，以ZnSO4 120μmol／L诱导，HE染色、Survivin免疫细胞化学染色透射电镜等形态学观察。绘制生长曲线。RT—PCR检测各组细胞Survivin的表达。Annexin V法检测细胞凋亡。[结果]RT—PCR从MG63细胞mRNA扩增了Survivin编码区cDNA，约420bp。构建了pMDNA3-anti—Survivin重组质粒。转染MG63细胞，G4181000μg/ml筛选4周后，建成稳定转染细胞系。通过ZnSO4 120μmol／L诱导，电子显微镜观察可见MG63／pMDNA3-anti—Survivin细胞出现凋亡。免疫细胞化学染色可见诱导后的MG63／pMDNA3-anti—Survivin Survivin蛋白表达明显降低。AnnexinV染色后发现pMDNA3-anti—Survivin细胞，在ZnSO4诱导48h后凋亡率达到11％，较对照组高出3倍。[结论]Survivin的反义RNA能够有效的抑制Survivin的表达，从而抑制肿瘤生长，并促进肿瘤细胞凋亡．