九种重要经济动物二级抗体的制备和HRP标记

目的 制备兔抗9种重要经济动物的二级抗体,并进行辣根过氧化酶标记,为经济动物血清学检测系统的建立提供工具.方法 利用饱和硫酸铵沉淀粗纯抗体后,再利用protein A或protein G 亲和层析的方法进一步纯化动物血清IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法纯化兔抗经济动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的二级抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting考察标记抗体的特异性.结果 纯化了家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物的血清IgG,免疫双扩散法测定兔抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物二级抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶(2000～15000)左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性.结论 成功制备了HRP标记的兔抗9种重要经济动物的二级抗体,为经济动物血清学检测体系的建立提供了工具.     

十六种鸟类二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

目的制备兔抗16种鸟类的二级抗体,并进行辣根过氧化物酶标记,为鸟类血清学检测系统的建立提供工具。方法采用水稀释法粗纯抗体后,再利用改良的饱和硫酸铵分级沉淀法,或亲和层析结合饱和硫酸铵沉淀法,或饱和硫酸铵沉淀法结合SDS-PAGE凝胶切胶纯化的方法进一步纯化鸟类的IgY,利用纯化的IgY免疫大耳白兔制备抗血清,用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗鸟类的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗鸟类的二级抗体进行辣根过氧化物酶标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blots考察标记抗体的特异性。结果纯化了灰雁、鸬鹚、鸵鸟、小鹈、鸽子、鹅、孔雀、鹌鹑、贵妃鸡、草鹭、夜鹭、赤嘴潜鸭、燕鸥、长脚鹬、虎皮鹦鹉、翘鼻麻鸭等16种鸟类的IgY,免疫双扩散法测定兔抗这16种鸟类的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗灰雁IgY、兔抗鸬鹚IgY、兔抗鸵鸟IgY、兔抗小鹈IgY、兔抗鸽子IgY、兔抗鹅IgY、兔抗孔雀IgY、兔抗鹌鹑IgY、兔抗贵妃鸡IgY、兔抗草鹭IgY、兔抗夜鹭IgY、兔抗赤嘴潜鸭IgY、兔抗燕鸥IgY、兔抗长脚鹬IgY、兔抗虎皮鹦鹉IgY、兔抗翘鼻麻鸭IgY等16种兔抗鸟类IgY的二级抗体进行了辣根过氧化物酶标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶800～80000左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了辣根过氧化物酶标记的兔抗16种鸟类的二级抗体,为鸟类血清学检测体系的建立提供了工具。     

十七种哺乳动物二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

目的制备兔抗17种哺乳动物的二级抗体,并进行辣根过氧化物酶标记,为哺乳血清学检测系统的建立提供工具。方法利用饱和硫酸铵沉淀法粗纯抗体后,再利用protein A或protein G亲和层析的方法进一步纯化哺乳动物的IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗哺乳动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗哺乳动物的二级抗体进行辣根过氧化物酶标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blot方法考察标记抗体的特异性。结果纯化了恒河猴、东北虎、布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、原驼、果子狸、食蟹猴、梅花鹿、长爪沙鼠、马鹿、骆驼、大仓鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17种哺乳动物的血清IgG,分别免疫大耳白兔制备了这17种哺乳动物的兔抗血清,免疫双扩散法测定兔抗这17种哺乳动物的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗恒河猴IgG、兔抗东北虎IgG、兔抗布氏田鼠IgG、兔抗黑线姬鼠IgG、兔抗斑羚IgG、兔抗原驼IgG、兔抗果子狸IgG、兔抗食蟹猴IgG、兔抗梅花鹿IgG、兔抗长爪沙鼠IgG、兔抗马鹿IgG、兔抗骆驼IgG、兔抗大仓鼠IgG、兔抗豚鹿IgG、兔抗熊猴IgG、兔抗大耳羊IgG和兔抗雪貂IgG等17种哺乳动物的二级抗体进行了辣根过氧化物酶标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶(2000～60000)左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了HRP标记的兔抗17种哺乳动物的二级抗体,为哺乳动物血清学检测体系的建立提供了工具。     

以钼酸铵作HRP组化TMB反应的稳定剂及其在电镜免疫组化技术...

Ammonium molybdate (AHM) was used as a stabilizing agent in the tetramethyl benzidine (TMB) reaction of choleragen subunit B conjugated horseradish peroxidase (CB-HRP) neurohistochemistry. In comparison with Mesulam's TMB method using sodium nitroprusside (SNP) as stabilizing agent, this new stabilizer offers similar sensitivity in regard to visualization of CB-HRP labelled neurons and their extranuclear Golgi-phobic dendrites. The nearly physiological pH (6-8) of the reaction medium demonstrates better preservation of tissue and cell structures of reacted sections and avoids non-specific needle-like crystal formation. Under the electron microscope, the histochemical reaction products can be clearly distinguished, without the usual shrinkage or distention of cellular and subcellular structures. This method was also applied with success to immunocytochemistry through small modifications.     

用化学发光法测定辣根过氧化物酶几种体系的研究

Four systems were studied used for chemiluminescent determination of HRP and the determination conditions optimized. In luminol-H2O2 (NaOH) system, HRP was determined conveniently in the range of 0.05-4 pmol, with a correlation coefficient of 0.998 for the linear log-log equation and a limit of detection of 16 fmol HRP. In pyrogallol-H2O2 (pH 6.5) system, 0.1-100 pmol of HRP were determined, based on three log-log regression equations with correlation coefficients of 0.997, 0.994 and 0.999, respectively, and limits of detection of 3-17 fmol HRP. Luminol-H2O2-para iodophenol system was used to determine HRP in the range to 10-50 fmol, based on the chemiluminescence intensity at 1 min and the correlation coefficient of the log-log equation being 0.996 with a limit of detection of 10 fmol HRP. When p-hydroxybiphenyl was used to take the place of p-iodophenol and the chemiluminescence intensity at 1 min or 3 min measured, 6-40 fmol HRP were determined with a correlation coefficient of 0.994 or 0.995 for the log-log equation and a limit of detection of 6.5 or 3.3 fmol HRP.     

兔抗五种鱼免疫球蛋白抗体的制备和HRP标记

目的制备兔抗鱼类免疫球蛋白抗体并进行辣根过氧化酶标记,为鱼类血清学检测系统的建立提供工具。方法利用proteinA亲和层析的方法纯化鱼血清免疫球蛋白,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗鱼免疫球蛋白的抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗鱼免疫球蛋白的抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting来考察标记抗体与其他常见鱼类血清蛋白间的交叉反应。结果纯化了鳙、鲤、乌鳢、黄鳝、鲈五种鱼血清免疫球蛋白,免疫双扩散法测定兔抗这五种鱼免疫球蛋白的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗鳙、鲤、乌鳢、黄鳝、鲈五种鱼类免疫球蛋白的抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶10000左右,Western blots显示标记抗体与部分其他鱼类免疫球蛋白之间存在不同程度的交叉反应。结论成功制备了HRP标记的兔抗鱼类免疫球蛋白抗体,为鱼类血清学检测体系的建立提供了工具。     

两种不同制备酶标记结合物方法的比较

①目的 对过碘酸盐经典法（经典法）和过碘酸盐改良法（改良法）制备的酶标结合物进行比较。②方法 两种方法均用过碘酸盐氧化辣根过氧化物酶（HRP）使醛基暴露以提高酶与抗体（或抗原）的结合率。但在用NaIO4氧化前应将酶蛋白分子上的氨基进行处理，以防酶经氧化后形成醛基造成自身交联，为此，经典法是用二硝基氟苯将氨基封闭，而改良法是在低PH条件下用NaIO4直接氧化HRP。用二硝基氟苯封闭仍有35%的HRP发生自身交联，而且酶的活性受影响。而改良法在低PH条件下直接氧化HRP，仅5%HRP有自身交联而且活性不受影响。我们用上述方法分别制备了两种酶结合物，并对两种酶结合物作了质量对比试验，包括对流电泳、酶活性测定。③结果 改良法酶结合物活性及产率明显比经典法高。④结论 过碘酸盐改良法制备的酶结合物活性及产率均较过碘酸盐经典法好。     

家兔胆囊传入神经的节段性——HRP及CT-HRP法研究

应用辣根过氧化酶逆向运输技术(HRP和CT-HRP法)研究胆囊的神经支配,发现在两侧迷走神经结状节、右颈2～5脊神经节、两侧胸2～11脊神经节内出现数量不等的标记细胞。胸脊神经节内,标记细胞频率最高者集中在胸5～9。左胸5～8脊神经节内标记细胞数多于右侧相应脊神经节。腹腔节内发现大量标记细胞。     

谷胱甘肽转硫酶多克隆抗体的制备及应用

将含有谷胱甘肽转硫酶 ( GST)基因的 p GEX质粒转入大肠杆菌 TG1后 ,在 0 .5 mmol/L异丙基硫代 - β- D-半乳糖苷 ( IPTG)诱导培养下表达了 GST,用亲和纯化得到的 GST免疫新西兰大白兔 ,获得了滴度 ( ELISA)在 2× 1 0 5以上的抗血清 ,纯化后的抗体已成功地应用于两种新的融合蛋白 GST- FLP和 GST- Pre S1的免疫印迹检测和亲和层析法纯化     

兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶多克隆抗体的制备

目的：制备兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶（NRDR）多克隆抗体。方法：应用原核表达的兔NRDR免疫豚鼠,制备豚鼠抗兔NRDR多克隆抗体,并以Western blot法分析抗体特异性。结果：免疫豚鼠获得了高效价抗血清,效价为1：2000时检测极限为160rig蛋白,与NRDR蛋白能特异性结合。结论：获得的多克隆抗体应用于Western blot中检测兔NRDR效果良好。为NRDR的进一步研究打下基础。     

EOLA1多克隆抗体的制备及免疫定位

目的:制备兔抗人内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)多克隆抗体,探讨其在部分人体恶性肿瘤组织中的免疫定位。方法:构建重组质粒,转化大肠杆菌及诱导表达,抽提目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,免疫组织化学法检测EOLA1在部分人体恶性肿瘤组织中的表达。结果:成功制备重组质粒在大肠杆菌中表达人EOLA1蛋白,免疫家兔制备得到兔抗EOLA1多克隆抗体,免疫组织化学法检测显示EOLA1蛋白在乳腺癌组织癌细胞胞浆中有表达。结论:成功制备EOLA1多克隆抗体,证实EOLA1蛋白在乳腺癌组织癌细胞胞浆中有表达。     

长爪沙鼠IgG的纯化及抗血清的制备

目的纯化长爪沙鼠血清IgG,制备兔抗长爪沙鼠IgG抗血清。方法采用Hitrap Protein G亲和层析预装柱来纯化长爪沙鼠血清IgG;通过SDS-PAGE电泳和Western-Blotting免疫印迹法对长爪沙鼠血清IgG进行纯度鉴定,免疫兔子制备抗血清。结果7 mL长爪沙鼠血清纯化得到11 mg IgG;电泳和免疫印迹测定,IgG纯度大于95%;用纯化的IgG作抗原制备了兔抗血清,免疫双扩散测定效价达1∶32。结论建立了长爪沙鼠血清IgG的纯化方法,制备了长爪沙鼠IgG抗血清,证实长爪沙鼠血清IgG和Protein G具有较高的亲和性。     

SP-B中间产物特异性抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定表面活性物质蛋白B(surfactant protein B,SP-B)加工处理过程中部分中间产物的特异性抗体。方法利用Lasergene 7.0和Macvector 11.0.4软件进行抗原表位分析,确定作为抗原的3条多肽序列,将人工合成的多肽与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联,免疫兔制备抗血清,间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫前血清背景和免疫后血清效价,抗原亲和纯化抗血清,超滤浓缩抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹(Western blot)鉴定抗体特异性。结果免疫前兔血清背景均低,免疫后抗血清效价均达到要求,抗原亲和纯化后所得抗体纯度及效价高,特异性好。结论成功制备了3种SP-B中间产物特异性多克隆抗体,为深入研究SP-B的加工处理奠定了基础。     

ELF3多克隆抗体的制备及其免疫定位

目的 制备并鉴定兔抗小鼠胚肝血影蛋白3(embryonic liver fodrin 3,ELF3)的多克隆抗体,并探讨其在部分小鼠组织中的免疫定位.方法 合成ELF3氨基端特异性多肽片段,连接载体蛋白钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin,KLH),免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,用ELISA方法 检测抗体效价,Western blot和免疫组织化学方法 检测抗体特异性及在小鼠组织中的表达情况.结果合成ELF3特异性多肽,并连接KLH后免疫实验兔,制备得到兔抗小鼠ELF3多克隆抗体,ELISA及Western blot检测结果显示此抗体效价及特异性高;Western blot和免疫组织化学检测结果显示ELF3在心、肝、肾组织中表达,尤其是细胞膜上表达明显.结论 本实验成功制备ELF3多克隆抗体,并证实ELF3在小鼠心、肝、肾组织细胞膜表达明显,这将为ELF3功能研究提供有力的工具.